紅白蠶石丸中柚皮苷的含量測定研究 定稿

目錄[摘要] 紅白蠶石丸中柚皮苷的含量測定研究[摘要]目的：進(jìn)行紅白蠶石丸中柚皮苷的含量測定研究，為建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。方法：HPLC法同時測定制劑中柚皮苷的含量。結(jié)果：HPLC法測定同時測定制劑中的柚皮苷的含量，方法靈敏、簡便、重復(fù)性好。結(jié)論：該方法可以作為紅白蠶石丸的含量測定方法。[關(guān)鍵詞]紅白蠶石丸；鑒別；檢查；含量測定StudyonqualitystandardofHongbaicanshipellets[Abstract]Object:TodeterminethecontentofnaringininHongbaiCanshiWan,andtoprovideareferenceforitsconstructionofqualitystandards.Method:SimultaneouslydeterminethecontentofnaringininthepreparationbyHPLC.Results:TheHPLCmethodisusedtodeterminethecontentofnaringininthepreparationatthesametime.Thismethodissimpler,moresensitive,andhasgoodrepeatability.Conclusion:ThismethodcanbeusedasamethodforthedeterminationofthecontentofHongbaiCanshiWan.[Keywords]Redandwhitesilkwormstonepills;Identify;examination;Determinationofcontent紅白蠶石丸全方由生磁石粉、白礬、炒僵蠶、法半夏、天麻、化橘紅等藥材組成，具有熄風(fēng)鎮(zhèn)驚，平肝安神的功能，臨床主要用于治療頭目眩暈，目脹耳鳴，肢麻震顫，語言不利，步履不穩(wěn)等之效[1]。為建立該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制成品的質(zhì)量，采用HPLC法對制劑中柚皮苷的含量進(jìn)行了測定，為建立其可行、可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了充分的科學(xué)依據(jù)。紅白蠶石丸組方中含有化橘紅，其所含柚皮苷成分是該藥物的主要有效成分，柚皮苷是一種二氫黃酮類物質(zhì)，主要存在于柚及其變種的果皮及果實中，具有抗氧化性、抗腫瘤、抑制微生物活性和抗骨質(zhì)疏松等作用，具有很高的藥用價值，應(yīng)用范圍廣泛[2]。為探討本制劑的內(nèi)在質(zhì)量，制定該藥物的定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，參考2015版中國藥典一部及相關(guān)參考文獻(xiàn)中的含測方法，對紅白蠶石丸樣品中的柚皮苷建立了高效液相色譜含測方法。本法操作簡單易行，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，是控制紅白蠶石丸制劑內(nèi)在質(zhì)量的較理想方法。本文建立的質(zhì)量控制方法準(zhǔn)確可靠,為控制該制劑的質(zhì)量提供了依據(jù)。1儀器與試劑表1儀器型號生產(chǎn)廠家含量測定用高效液相色譜儀Ultimate3000二極管陣列檢測器紫外檢測器Ultimate3000美國Thermo公司工作站Chromeleon7美國Thermo科技公司超聲波清洗機(jī)SB-5200DTS寧波新芝生物科技股份有限公司電子天平BP211D型sartorius公司色譜柱SupersilODS2（4.6mmｘ250mm，5μm，大連依利特分析儀器有限公司）試劑柚皮苷（批號110737-200415），中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用。乙腈為色譜純，純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)公司），其余試劑均為分析純。中藥白礬、法半夏等由安徽濟(jì)順中藥飲片有限公司中藥廠提供。2研究的起因近年來在癲癇的各方面研究都取得了很大的進(jìn)展。西藥主要通過目前新開發(fā)的抗癲癇藥主要是通過影響離子通道,增加抑制性神經(jīng)元功能,減弱興奮性神經(jīng)元功能而起到抗癲癇作用[3]。目前,中藥治療癲癇的作用機(jī)制已經(jīng)取得了較突出的進(jìn)展,國內(nèi)外的專家學(xué)者對中藥抗癲癇的研究前景都十分看好,如何從現(xiàn)有的研究成果中開發(fā)一種廣譜、低毒、無副反應(yīng)的抗癲癇新藥,并能應(yīng)用于臨床將成為下一步研究的重點[4]。但中藥制劑由于成分復(fù)雜、基礎(chǔ)研究薄弱、有效成分不明確、作用機(jī)制不清楚等原因，其質(zhì)量控制長期以來成為了中藥制劑的難點和關(guān)鍵問題，如何基于中藥特點開展中藥制劑質(zhì)量研究一直是業(yè)界研究探討的重要內(nèi)容[5]。與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的基礎(chǔ)研究較為薄弱的問題在于，中藥大多為復(fù)方制劑,化學(xué)成分比較復(fù)雜,有效成分等基礎(chǔ)研究難度較大,進(jìn)展緩慢；而受基礎(chǔ)研究薄弱,對照品提取分離難度較大等因素影響,部分中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中所選擇的檢測指標(biāo)不能完全體現(xiàn)中藥的治療作用[6]。而在國務(wù)院發(fā)布的關(guān)于中醫(yī)藥事業(yè)的意見中曾提到，推進(jìn)實施中藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范，加強(qiáng)中藥生產(chǎn)質(zhì)量監(jiān)管是十分重要的[7]。因此，要客觀面對問題，找出解決的辦法，推進(jìn)中成藥質(zhì)量的整體提升。質(zhì)量評價要能真實反映中成藥的內(nèi)在質(zhì)量，方法要科學(xué)、可行，并得到國際認(rèn)可?？傊?，只要堅持科學(xué)理念，本著推進(jìn)中藥發(fā)展，為人民服務(wù)的精神，中成藥的質(zhì)量會不斷得到提高[8]。紅白蠶石丸全方由生磁石粉、白礬、炒僵蠶、法半夏、天麻、化橘紅6味中藥組成，為制訂科學(xué)合理的提取制備工藝，保證產(chǎn)品質(zhì)量，采用HPLC法對制劑中柚皮苷的含量進(jìn)行了測定，為建立其可行、可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了充分的科學(xué)依據(jù)。3制劑中各藥材的有效成份及作用分析3.1生磁石粉：生磁石是四氧化三鐵與氧化鐵的混合物，還含有錳、鎂、鉛、鈦等元素，進(jìn)行了久煅醋淬的炮制后，主要含三氧化二鐵及醋酸鐵等[9]。有潛陽安神、鎮(zhèn)靜作用，適用于陰虛陽亢所致的煩躁不寧、睡眠不安，頭暈頭痛及癲癇之證。3.2白礬：白礬為硫酸鹽類礦物明礬石經(jīng)加工提煉制成，主要成分為含水硫酸鋁鉀[KAl(SO4)2·12H2O],別名明礬、礬石、理石、白君、雪礬、羽涅、羽澤、云母礬等[10]。白礬有解毒殺蟲之功，外用多煅成枯礬，尤能收濕止癢，主要用于癰腫瘡毒、濕疹疥癬、口舌生瘡、耳內(nèi)流膿等證。內(nèi)服多用生白礬，有較強(qiáng)的祛痰作用，用于風(fēng)痰壅盛，或癲癇等證。3.3炒僵蠶：僵蠶所含的蛋白質(zhì)有刺激腎上腺皮質(zhì)的作用，動物實驗有抗驚厥作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)實踐研究表明白僵蠶對治療腮腺炎、癲癇及腦炎后遺癥有治療作用[11]。藥用能息風(fēng)止痙，又可化痰，適用于肝風(fēng)內(nèi)動及痰熱所致的驚風(fēng)、癲癇、中風(fēng)等痙攣抽搐之證[12]。3.4法半夏：本品含揮發(fā)油、棕櫚酸、植物笛醇、生物堿、粘液質(zhì)、淀粉、油酸、硬脂酸、亞麻仁油酸等，目前發(fā)現(xiàn)半夏中有90個化學(xué)成分,定性80個化學(xué)成分,分別為生物堿類7個、醇醚類8個、脂肪酸甘油脂類12個、黃酮類5個、溶血磷脂酰膽堿類12個、醇氨類10個、氨基酸類11個、酰胺類11個、其他類型4個化合物[13]。本品能抑制嘔吐中樞，有止吐作用；還有祛痰、鎮(zhèn)咳、緩解支氣管痙攣等作用。能燥濕化痰，為治濕痰、寒痰要藥。半夏中有毒成分難溶于水，不易被熱所破壞(在100℃的水中三小時也不能完全破壞)，也不能單純被姜汁所破壞，而能被白礬所消除[14]。3.5天麻：天麻有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗癲癇和促進(jìn)膽汁分泌的作用。本品含生物堿，甙類、香草醇、維生素A、粘液質(zhì)。其中天麻素屬于脂溶性物質(zhì)，穿透血腦屏障后對抑制興奮性氨基酸產(chǎn)生與釋放有明顯的作用，還能降低髓性細(xì)胞核分化抗原（MyeloidCellNuclearDifferentiationAntigen,MNDA）受體活性，避免鈣離子的升高，進(jìn)一步阻斷N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-asparticAcidReceptor,NMDA）鈣離子通路，從而達(dá)到抗驚厥的作用[15]?，F(xiàn)代以本品配全蝎、僵蠶等藥用于“流感”、“乙腦”引起的腦神經(jīng)刺激癥狀如痙攣、抽搐等有一定的療效，如天麻祛風(fēng)湯。3.6化橘紅為橘的外層果皮。辛、苦，溫；歸肺、脾經(jīng)?，F(xiàn)代研究表明化橘紅含有黃酮、多糖、香豆素、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分，具有顯著的止咳化痰、抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫力和防治糖尿病所導(dǎo)致的心肌功能損傷等藥理作用[16]。4含量測定4.1方法與結(jié)果 4.1.1樣品溶液的制備[17]：表2方法供試品溶液的制備取本品，研細(xì)，精密稱定0.4g，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，水浴加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，以0.45μm濾膜濾過，即得。柚皮苷對照品溶液的制備精密稱取柚皮苷對照品8.8mg于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，其濃度為88mg/ml。精密量取1ml上述對照品溶液于25ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液，得濃度為35.2mg/ml.缺化橘紅空白液的制備按處方比例，準(zhǔn)確稱取除化橘紅以外的其它藥材，模擬本品的制備工藝和供試品的制備方法，制成缺化橘紅空白溶液。化橘紅藥材溶液的制備取化橘紅藥材0.5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，水浴加熱回流1小時，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重。搖勻，濾過，取續(xù)濾液5ml置50ml量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻既得。4.1.1.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.1%磷酸水（20：80）為流動相；檢測波長為283nm。理論板數(shù)按柚皮苷峰計算應(yīng)不低于1000。4.1.1.2最大吸收波長的選擇：參考中國藥典2015年版一部化橘紅項下柚皮苷的高效液相法測定檢測波長，確定本測定的檢測波長為283nm。2、色譜條件與適用性試驗[18]：4.2.1空白干擾試驗：取供試液、化橘紅對照液、缺化橘紅空白液，各進(jìn)樣5μl，在283nm處檢測，結(jié)果表明柚皮苷對照液和供試品溶液在該波長下均呈現(xiàn)吸收峰，而缺化橘紅空白液在與對照品相應(yīng)的位置上未見色譜峰出現(xiàn)，見圖1，表明本測定空白無干擾。ABCA柚皮苷B缺化橘紅空白C供試品圖1HPLC色譜圖4.2.2線性關(guān)系考察[19]：配制柚皮苷對照品溶液濃度為70.4μg/ml，分別進(jìn)樣1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl，注入高效液相色譜儀，測定峰面積積分值，結(jié)果見表3。以柚皮苷的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果柚皮苷進(jìn)樣量在0.0704~0.4224μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析得回歸方程：y=2.1696X，r2=0.9997。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。表3柚皮苷線性關(guān)系考察結(jié)果進(jìn)樣量（μg）0.07040.14080.21120.28160.35200.4224峰面積（A）1.9134.4456.6728.76110.81712.915圖2柚皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線4.2.3精密度試驗[20]：精密吸取對照品溶液5μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值，計算精密度，結(jié)果柚皮苷6次測定的RSD為0.142%，表明精密度良好，見表4。表4精密度試驗結(jié)果次數(shù)123456±SDRSD（%）峰面積（A）5.2425.2505.2605.2535.2535.2635.254±0.007450.1424.2.4穩(wěn)定性試驗[21]：精密吸取供試品溶液5μl，分別在間隔0、3、6、9、12、18、24小時進(jìn)樣，共進(jìn)樣測定7次，其峰面積積分值在測定時間24h內(nèi)基本不變，供試品柚皮苷7次測定的RSD為0.207%，表明在測定時間24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，見表5。表5穩(wěn)定性試驗結(jié)果時間（h）0369121824±SDRSD（%）峰面積（A）5.6555.6475.6665.6585.6705.6755.6805.664±0.01170.2074.2.5重復(fù)性試驗表6重復(fù)性試驗結(jié)果次數(shù)123456±SDRSD（%）淫羊藿苷（mg/g）2.3612.3842.3612.4122.3012.3472.361±0.03721.584.2.6回收率試驗：表7回收率試驗結(jié)果稱樣量樣品中的量加入量測得量回收率（%）（g）（mg）（mg）（mg）單次平均RSD0.20050.4730.4960.96398.6398.651.750.20040.4730.4960.96498.980.20090.4740.4960.96198.200.20060.4740.4960.970100.070.20020.4730.4960.971100.460.20370.4810.4960.95595.584.2.7樣品的測定[18]：分別精密吸取對照品溶液與三批供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀測定，并計算各批樣品中柚皮苷的含量，結(jié)果見表8。表83批樣品含量測定結(jié)果批號含量（mg/g）平均含量12（mg/袋）2104072.3612.3842.3732104082.6142.6512.6322104092.6532.7222.688 5.討論紅白蠶石丸全方由生磁石粉、白礬、炒僵蠶、法半夏、天麻、橘紅等藥材組成，具有熄風(fēng)鎮(zhèn)驚，平肝安神之效，臨床主要用于治療頭目眩暈，目脹耳鳴，肢麻震顫，語言不利，步履不穩(wěn)等證?？偨Y(jié)上述實驗結(jié)果，本課題制定了紅白蠶石丸的含量測定研究方法，為有效評價該制劑質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。柚皮苷具有很高的藥用價值，可以用于制備治療咳嗽和止咳化痰的藥物。因其具有良好的誘導(dǎo)成骨作用，因此可以用于治療骨缺損及骨質(zhì)疏松，對牙周病也有一定的治療作用[2]。同時柚皮苷還具有明顯的促進(jìn)胃潰瘍愈合，保護(hù)心肌細(xì)胞等作用[2]，具有較高的藥物開發(fā)價值。參考文獻(xiàn)[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[M].北京:中國醫(yī)藥出版社,2015:318-319.[2]劉影,龐富.化橘紅有效成分柚皮苷的研究進(jìn)展[J].糧食與油脂,2021,34(02):8-10.[3]胡艷麗,周園,楊德林,吳越.抗癲癇新藥研究進(jìn)展[J].農(nóng)墾醫(yī)學(xué),2001(06):405-408.[4]李滿,鄭輯英,李光來.抗癲癇中藥作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2005(11):64-66.[5]陽長明,陳霞,趙巍,韓煒,張永文,李計萍,周思源.基于源頭控制的中藥制劑質(zhì)量研究[J].中草藥,2021,52(02):321-326.[6]李淼.中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究現(xiàn)狀[J].黑龍江醫(yī)藥,2014,27(01):135-137.[7]國務(wù)院.國務(wù)院關(guān)于扶持和促進(jìn)中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的若干意見[S].國發(fā)[2009]22號,2009.[8]馬雙成,王翀,朱炯,戴忠.中成藥的整體質(zhì)量狀況及有關(guān)問題分析[J].中國藥學(xué)雜志,2019,54(17):1369-1373.[9]朱祥成.耳嗚——中醫(yī)對策[A].中華中醫(yī)藥學(xué)會、中華中醫(yī)藥學(xué)會耳鼻喉科分會、“世中聯(lián)”耳鼻喉口腔科專業(yè)委員會.中華中醫(yī)藥學(xué)會耳鼻喉科分會第15屆學(xué)術(shù)交流會論文集[C].中華中醫(yī)藥學(xué)會、中華中醫(yī)藥學(xué)會耳鼻喉科分會、“世中聯(lián)”耳鼻喉口腔科專業(yè)委員會:中華中醫(yī)藥學(xué)會耳鼻喉科分會,2009:6.[10]馬浩文,趙啟苗,單國順,鞠成國,賈天柱.白礬炮制歷史沿革及現(xiàn)代研究概況[J].中國現(xiàn)代中藥,2021,23(03):562-566.[11]米紅霞,劉吉平.白僵蠶應(yīng)用研究進(jìn)展[J].廣東蠶業(yè),2010,44(01):46-