乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)指導(dǎo)書

乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)指導(dǎo)書-模板目的 采用PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光探針技術(shù)，用于臨床血清或血漿標(biāo)本中的乙型肝炎病毒核酸的定量檢測(cè)，或用于乙型肝炎的輔助診斷和抗病毒藥物治療中的療效觀察。范圍適用于乙型肝炎病毒核酸（HBVDNA）定量檢測(cè)（PCR-熒光探針法）。3.職責(zé)3.1操作人員：負(fù)責(zé)標(biāo)本制備檢測(cè)、儀器操作、報(bào)告發(fā)送。3.2專業(yè)組組長(zhǎng)：負(fù)責(zé)本組耗材的請(qǐng)購(gòu)，監(jiān)督本組標(biāo)本檢測(cè)、儀器操作、報(bào)告發(fā)送、質(zhì)控管理等各方面工作。3.3實(shí)驗(yàn)室主任：負(fù)責(zé)監(jiān)督和指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室各方面工作。4.原理采用熒光PCR技術(shù)，以HBV基因組中相對(duì)保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針，在樣品核酸純化之后，通過熒光定量PCR對(duì)HBVDNA進(jìn)行擴(kuò)增，并檢測(cè)熒光信號(hào)，儀器軟件系統(tǒng)自動(dòng)繪制出實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，根據(jù)閾循環(huán)值(CT)實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣品的檢測(cè)。另外，本試劑盒帶有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，用于對(duì)核酸提取的整個(gè)過程進(jìn)行監(jiān)控，減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。5.樣品要求5.1適用樣品類型：血清或血漿。5.2樣品采集：5.2.1血清用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2ml，注入無菌的真空采血管中（未加抗凝劑），室溫（22-25℃）放置30-60min血標(biāo)本可自發(fā)完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機(jī)，1500rpm離心5min，吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管。5.2.2血漿用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）抗凝劑的真空采血管，立即輕輕顛倒混勻5-10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，5-10min后分離血漿于無菌的1.5ml滅菌離心管。5.3樣品保存和運(yùn)送使用專用樣品0℃冰壺送檢，溫度約維持在4℃左右。分離后的血清或血漿可立即用于測(cè)試，也可以保存于-20℃待測(cè)，保存期為6個(gè)月。5.4拒收樣品：拒絕重度溶血樣品、肝素抗凝的血漿。6.儀器和試劑6.1儀器AB7500核酸擴(kuò)增儀、恒溫金屬浴、生物安全柜、低溫離心機(jī)等。6.2試劑生產(chǎn)廠家：中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)批號(hào)：YZB/國(guó)7265-2013線性范圍：100IU/ml-5×108IU/ml最低檢出限及定量限：最低檢出限濃度為30IU/ml，最低定量濃度為100IU/ml。試劑各組分見表1：表1試劑盒組分表組分名稱規(guī)格數(shù)量核酸提取試劑DNA提取液Ⅰ4.5ml/瓶2質(zhì)控品及陽性定量參考品陰性質(zhì)控品250ul/管1HBV強(qiáng)陽性質(zhì)控品250ul/管1HBV臨界陽性質(zhì)控品250ul/管1HBV陽性定量參考品（2.0×106IU/ml）250ul/管1HBV陽性定量參考品（2.0×105IU/ml）250ul/管1HBV陽性定量參考品（2.0×104IU/ml）250ul/管1HBV陽性定量參考品（2.0×103IU/ml）250ul/管1PCR檢測(cè)試劑PCR內(nèi)標(biāo)溶液100ul/管1HBVPCR反應(yīng)液270ul/管2Taq酶60ul/管17.操作步驟7.1試劑準(zhǔn)備（試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)）7.1.1進(jìn)入試劑準(zhǔn)備區(qū)，打開通風(fēng)設(shè)備，按照消毒清潔程序擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái)面。7.1.2取出N個(gè)（N=待測(cè)樣品數(shù)+8=待測(cè)樣品數(shù)+4個(gè)HCV陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品+HCV強(qiáng)陽性質(zhì)控品+HCV臨界陽性質(zhì)控品+陰性質(zhì)控品+空白孔）PCR反應(yīng)管，HBV單人份擴(kuò)增體系配制如下表2：表2反應(yīng)液配制表組分HBV反應(yīng)液Taq酶總體積用量/人份27ul3ul30ul將各組分充分混勻，混合好后進(jìn)行瞬時(shí)離心將管壁上的液體全部離心至管底，之后將30ul擴(kuò)增體系分裝到PCR反應(yīng)管，反應(yīng)液分裝時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，蓋緊管蓋，經(jīng)傳遞窗傳遞到標(biāo)本制備區(qū)。7.2DNA提取（標(biāo)本制備區(qū)）7.2.1進(jìn)入標(biāo)本制備區(qū)，從傳遞窗中取出PCR反應(yīng)管，將其放入標(biāo)本制備區(qū)冰箱冷藏。7.2.2從冰箱取出待測(cè)樣品、陰性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、DNA提取液Ⅰ和內(nèi)標(biāo)液，放入生物安全柜內(nèi)室溫溶解，備用。7.2.3打開金屬浴，調(diào)節(jié)溫度為100℃，使7.2.4用鑷子夾取按需要量準(zhǔn)備的1.5ml滅菌離心管放于安全柜內(nèi)離心管架上，所需離心管數(shù)為樣品數(shù)+8。7.2.5向離心管中各加入450ulDNA提取液Ⅰ和4ul內(nèi)標(biāo)溶液，再按編號(hào)加入200ul樣品，離心管與樣品對(duì)應(yīng)編號(hào)，每個(gè)離心管的編號(hào)方向都要朝向管口開啟的方向。用振蕩器劇烈震蕩混勻15s，瞬時(shí)離心數(shù)秒。7.2.6將離心管放入金屬浴，100℃恒溫處理10±1min7.2.7溫育10min后，用鑷子從金屬浴中取出所有離心管，室溫靜置冷卻。12000g，離心5min，備用。（擺放離心管時(shí)要將離心管開口朝向內(nèi)側(cè)。）7.2.8從標(biāo)本制備區(qū)冰箱冷藏室取出分裝好的HBVDNAPCR反應(yīng)管，向?qū)?yīng)編號(hào)的PCR管中加入處理好的的樣品（包括樣品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品）上清液各20ul，空白對(duì)照不加模板，蓋緊反應(yīng)管。8000rpm離心數(shù)秒，經(jīng)傳遞窗移至擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。（用移液槍小心吸取上清液，盡量不要碰到底層沉淀。）7.3PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增區(qū)）7.3.1從傳遞窗中取出PCR反應(yīng)管，放入儀器樣品槽內(nèi)。7.3.2按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置空白管、陰性質(zhì)控品、陽性室內(nèi)質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、陽性定量參考品及待測(cè)樣品，并在“samplename”一欄中設(shè)置樣品名稱，探針檢測(cè)模式設(shè)置：ReporterDye1：FAM，QuencherDye1：none；ReporterDye2：VIC，QuencherDye2：none；PassiveReference：Rox。具體設(shè)置方法參考《AB7500核酸擴(kuò)增儀標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)指導(dǎo)書》。7.3.3打開Run窗口設(shè)置循環(huán)條件：93℃2min；93℃45s55℃60s10個(gè)循；9330s5545s，30循環(huán)。7.3.4保存文件，運(yùn)行儀器。8.結(jié)果分析8.1反應(yīng)結(jié)束后，操作人員可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以及Threshold值。Start值可以在3-15，End值可設(shè)在5-20。在Log圖譜窗口設(shè)置的Threshold的Value值，使基線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期，調(diào)整陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線，點(diǎn)擊Analysis自動(dòng)獲得分析結(jié)果在Report界面查看結(jié)果，記錄樣品數(shù)值（C）。8.2如果在FAM檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線無明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期或CT值等于30，在VIC檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，則判定樣品的HBVDNA濃度小于檢測(cè)靈敏度。8.3如果在FAM檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期且CT值小于30，則按以下方法判斷：（1）若樣品的C﹤100，則樣品的HBVDNA濃度﹤100IU/ml；（2）若樣品的100﹤C﹤5.0E+008，則樣品的HBVDNA濃度＝CIU/ml；（3）若樣品的＞5.0E+008，則樣品的HBVDNA濃度＞5×108IU/ml；如需要精確定量結(jié)果，可將樣品用陰性質(zhì)控品稀釋到線性范圍后在檢測(cè)。則該樣品的HBVDNA濃度＝（C×稀釋倍數(shù)）IU/ml。9.質(zhì)量控制 每次實(shí)驗(yàn)均需檢測(cè)陰性質(zhì)控品、HBV強(qiáng)陽性質(zhì)控品、HBV臨界陽性質(zhì)控品。質(zhì)控品結(jié)果滿足質(zhì)量控制要求時(shí)方可進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的判斷。9.1試劑盒自帶質(zhì)控（1）陰性質(zhì)控品：FAM檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線無明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期或CT值＝30，VIC檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線為明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期；（2）HBV陽性質(zhì)控品：FAM檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線有明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期且CT值＜30，強(qiáng)陽性質(zhì)控品定值范圍在2.0×105IU/ml~8.0×106IU/ml，臨界陽性質(zhì)控品定量定值范圍在3.0××102IU/ml~1.0×104IU/ml；（3）HBV陽性定量參考品：FAM檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線有明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，呈典型S型曲線，CT值＜29，且R2≥0.98。9.2室內(nèi)質(zhì)控每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)腍BVDNA質(zhì)控品作室內(nèi)質(zhì)控，將陽性質(zhì)控品的數(shù)據(jù)填入質(zhì)控圖。9.3以上要求（9.1和9.2）需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無效，需從新進(jìn)行。10.干擾因素10.1臨床標(biāo)本中內(nèi)源性抑制物：血紅蛋白、免疫球蛋白、白細(xì)胞內(nèi)乳鐵蛋白、脂類等都可抑制PCR反應(yīng)，標(biāo)本應(yīng)避免溶血、脂血、黃疸等。10.2外源性抑制物：肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、手套上的滑石粉、標(biāo)本容器上的抑制物等，標(biāo)本應(yīng)按采集要求采集，操作中應(yīng)小心謹(jǐn)慎，標(biāo)本容器及實(shí)驗(yàn)用具應(yīng)合格。10.3標(biāo)本的交叉污染：操作過程中應(yīng)仔細(xì)認(rèn)真，防止交叉污染，盡量使用帶鑒定合格的濾芯吸頭，陰性對(duì)照品應(yīng)與標(biāo)本一起提取，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)交叉污染。11.生物參考區(qū)間：1×102IU/ml~5.0×108IU/ml12.警示/危急值：HBVDNA檢測(cè)無警示/危急值。13.異常結(jié)果處理如遇HBVDAN檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷或資料，或與近期歷史檢測(cè)結(jié)果不相符合，應(yīng)及時(shí)與臨床醫(yī)生聯(lián)系、溝通，查找原因并采取措施，于《疑問報(bào)告發(fā)放處理記錄表》中記錄處理過程。如需復(fù)查，需及時(shí)保存標(biāo)本。14.臨床意義14.1HBVDNA是乙型肝炎病毒感染的最直接的證據(jù)，較其他血清學(xué)標(biāo)志物（如HBsAg、HBeAg）更有價(jià)值。14.2HBVDNA測(cè)定有助于阻斷母嬰傳播的判斷和檢測(cè)，HBVDNA陽性的產(chǎn)婦，其嬰兒隨訪中60%為HBV感染，而HBVDNA陰性的產(chǎn)婦，其嬰兒隨訪無一例陽性。14.3HBVDNA測(cè)定有助于HBsAg陰性的慢性肝炎的診斷和鑒別診斷，在血清學(xué)試驗(yàn)HBsAg陰性的人群中，至少有3-4%的HBV攜帶者，由于HBV的S基因突變，屬于HBsAg表達(dá)缺陷或低水平表達(dá)而無法常規(guī)檢出，利用HBVDNA方法的敏感性，可以對(duì)HBsAg陰性的慢性肝炎進(jìn)行檢測(cè)，還可以區(qū)分慢性乙型肝炎和非甲非乙型肝炎。14.4HBVDNA測(cè)定可作為抗病毒治療療效的判斷指標(biāo)。15.變異的潛在來源標(biāo)本保存不當(dāng)或反復(fù)凍融，都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。16.注意事項(xiàng)16.1實(shí)驗(yàn)過程中必須穿專用工作服、戴手套、口罩、帽子、必要時(shí)戴防護(hù)眼罩，接觸標(biāo)本后必須及時(shí)更換手套。16.2陽性質(zhì)控品和檢測(cè)樣品均應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，應(yīng)避免接觸到皮膚和粘膜。16.3實(shí)驗(yàn)過程必須嚴(yán)格分區(qū)操作，各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用。16.4樣品的處理操作應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。16.5所用檢測(cè)試劑使用前應(yīng)完全解凍，瞬時(shí)離心后使用，應(yīng)避免反復(fù)凍融。16.6樣品核酸提取后，建議馬上進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，否則請(qǐng)保存于-20℃待用（24h）。16.7操作過程中應(yīng)防止交叉污染，盡量使用鑒定合格的濾芯吸頭，陰性對(duì)照品應(yīng)與標(biāo)本一起提取。16.8加樣時(shí)應(yīng)使樣品完全落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品粘附于管壁上，盡快蓋緊管蓋。上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。16.9標(biāo)本制備區(qū)所用到的試管、吸頭等需打入盛有消毒劑的容器，并與廢物一起滅菌后方可丟棄。16.10擴(kuò)增完畢立即取出反應(yīng)管，密封