編制說明-布魯氏菌熒光偏振抗體檢測方法

一、工作簡況（任務來源、主要工作過程、主要參加單位和人員）（一）任務來源1.標準編制的必要性布魯氏菌病（Brucellosis）簡稱布病，是由布魯氏菌感染引起的包括人在內的多種哺乳動物共患的傳染病。主要感染羊、牛、豬、犬、鹿、駱駝及人等，以流產、早產、死胎、睪丸炎、附睪炎、發(fā)熱多汗、乏力、關節(jié)腫痛、肝脾及淋巴結腫大等為主要特征，我國將其列為二類動物疫病。自1886年蘇格蘭病理學家大衛(wèi)·布魯氏（DavidBruce）發(fā)現(xiàn)羊種布魯氏菌病以來，現(xiàn)已在世界160多個國家存在人畜布病，分布于世界各大洲。根據(jù)以往發(fā)病情況，我國布病分布情況分三類—第一類嚴重流行區(qū)有新疆、內蒙古、西藏、黑龍江、吉林、寧夏、青海、河南；第二類一般分布區(qū)有陜西、甘肅、遼寧、廣西、山西、河北、四川；第三類散發(fā)區(qū)有北京、天津、上海、浙江、安徽、福建、江西、湖北、湖南、廣東、云南。近年布病疫情回升地區(qū)有遼寧、吉林、內蒙、黑龍江、山東、西藏、新疆等。總體上在我國的華北、東北、西北等地區(qū)是布病的多發(fā)區(qū)，其中羊種布氏菌是疫情回升流行的優(yōu)勢菌種。布魯氏菌病潛伏期為7-60天，最長1年以上，自然發(fā)病多見于羊、牛、豬。病羊是主要傳染源，其次是牛和豬。在我國該疾病的主要傳染源為牛、羊、豬3種牲畜，其中以羊型布魯氏桿菌對人體的傳播性最強，致病率最高，危害最為嚴重?；疾游锏难骸⒎置谖?、子宮排泄物、流產胎兒、牛乳中均能排出高濃度的布魯氏菌。一年四季均可發(fā)生，以產仔季節(jié)多發(fā)，牧區(qū)、農牧區(qū)家畜飼養(yǎng)密集區(qū)發(fā)病率較高。綿羊和山羊感染前期常不表現(xiàn)癥狀，首先發(fā)現(xiàn)的癥狀是流產，一般發(fā)生在妊娠后3-4個月。其他癥狀有乳房炎產生乳汁結塊，關節(jié)炎引起的跛行，公羊表現(xiàn)睪丸炎、綿羊附睪炎。母牛以流產癥狀為主，常發(fā)生在妊娠后第6-8個月；公牛常見睪丸炎及附睪炎，膝關節(jié)關節(jié)炎導致關節(jié)腫脹。對本病不建議治療，疫苗接種結合檢疫凈化是目前控制布病的有效措施，應以預防為主，采取檢疫、免疫、淘汰患病動物等措施。在流行率較高的地區(qū)，要免疫、監(jiān)測、隔離、凈化同步推進。低感染率的地區(qū)或場群首要采取凈化措施，通過監(jiān)測和撲殺及時剔除陽性個體。布病檢疫凈化采用的檢測技術要強調敏感性。目前，布病的檢測方法主要用來進行疫病診斷、疫病動態(tài)監(jiān)測及其流行情況的調查。近年畜間布病的高位流行勢態(tài)和擴散態(tài)勢，有必要利用快速、高效、敏感的檢測手段來定位及預測布病的流行范圍，實施有效的防控策略。因此建立布病的快速、高效、準確檢測方法具有重要意義。在當前國內標準中，國標GB/T18646-2018推薦方法有虎紅平板凝集試驗（RBT）、乳牛全乳環(huán)狀試驗（MRT)、試管凝集試驗（SAT）、補體結合試驗（CFT）、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（iELISA)、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）、多重聚合酶鏈式反應（Bruce-LadderPCR）、細菌染色鏡檢、分離培養(yǎng)、生化鑒定等。這些方法有點操作復雜，試驗周期較長，不利于快速精準診斷；有的操作簡單，但是敏感性上不去漏檢或誤檢。因此建立快速簡便、敏感性高、特異性強的布魯氏菌熒光偏振抗體檢測標準十分必要。布魯氏菌熒光偏振抗體分析檢測方法相較于細菌培養(yǎng)鑒別、PCR方法、ELISA方法、凝集試驗等檢測方法具有試驗材料易獲取，操作簡便、省時快速、敏感性和特異性高、檢測性能穩(wěn)定等優(yōu)勢，尤其具備快速檢測、結果判定更為簡單的優(yōu)點，使該方法在臨床檢測和疫苗免疫大面積抗體監(jiān)測等方面具有重要價值，對布病的篩查及防控意義重大，鑒于上述現(xiàn)實問題，特制定本標準。本文件規(guī)定了布魯氏菌熒光偏振抗體檢測方法的范圍、規(guī)范性引用文件、試劑與耗材、儀器與設備、操作步驟、結果分析與表述。本標準適用于光滑型布魯氏菌抗體的檢測。本文件實用、準確、敏感，具有十分重要的實際應用價值。將其在基層推廣開來，有利于布病的快速、準確篩查，有利于行業(yè)發(fā)展。2.任務來源為建立布病的快速、高效、準確檢測方法，2023年5月，甘肅省動物衛(wèi)生標準化技術委員會向甘肅省市場監(jiān)督管理局申報制定《布魯氏菌熒光偏振抗體檢測方法》地方標準，同年6月，該標準獲批立項，被列入2023年第2批甘肅省地方標準制修訂計劃。（二）主要工作過程標準申報單位一直致力于布魯氏菌病發(fā)生的病原學和血清學診斷技術研究、流行病學監(jiān)測、疫情形勢研判、防控技術研究等工作。為了完成該標準的編寫，我們召集具有布魯氏菌病診斷檢測技術經(jīng)驗豐富的科研人員，共同組建了由專業(yè)技術人員組成的標準編寫團隊，查閱國內外相關資料，同時結合實驗室已有的該病的診斷檢測技術，按甘肅省地方標準管理辦法和地方標準知識培訓的相關內容進行編寫，最終形成了該標準檢測方法，按時上報給甘肅省動物衛(wèi)生標準化技術委員會進行評審。主要經(jīng)歷了如下4個階段：1.起草工作階段：2020年9月標準起草工作組認真學習了GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》等相關內容，結合標準制定工作程序的各個環(huán)節(jié)，進行了深入探討和研究。標準起草工作組經(jīng)過技術咨詢、調研，收集、整理和分析有關資料，并結合熒光偏振研制方法、技術路線、應用現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢等，于2023年3月編寫完成了地方標準《布魯氏菌熒光偏振抗體檢測方法》的草案稿。2.標準立項階段：2023年6月9日，經(jīng)甘肅省市場監(jiān)督管理局審查，標準起草工作組起草的《布魯氏菌熒光偏振抗體檢測方法》通過標準立項。3.征求意見階段：2023年7月～12月，起草工作組邀請來自于中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所、甘肅農業(yè)大學、甘肅省畜牧獸醫(yī)局、省內14個市（州）、10個縣（區(qū)）動物疫病預防控制中心、蘭州新區(qū)農林水務局、中農威特生物科技股份有限公司和薩福克養(yǎng)種植有限公司等3家企業(yè)的31位專家同行進行函審，共收到相關建議和意見36條。4.修改階段：標準起草工作組按照專家對草案稿提出的所有意見和建議進行了認真分析、理解和總結，根據(jù)所提意見，對標準草案進行了認真修改。5.審查階段：起草工作組對收集到的意見進行了認真分析和處理，采納13條，對征求意見稿進行了修改，于2024年1月8日前形成征求意見稿，報甘肅省動物衛(wèi)生標準化技術委員會審查。（三）主要參加單位本標準起草單位：甘肅省動物疫病預防控制中心、中國動物疫病預防控制中心、中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所、中聯(lián)瑞（北京）生物科技有限責任公司。（四）主要參加人員序號姓名單位職務/職稱任務分工聯(lián)系方式1曹麗萍甘肅省動物疫病預防控制中心正高級獸醫(yī)師主持人139199527032孫雨中國動物疫病預防控制中心正高級獸醫(yī)師標準撰寫152014351913鄭紅飛甘肅省動物疫病預防控制中心高級獸醫(yī)師推廣應用152942029204蔣卉中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所正高級獸醫(yī)師標準撰寫150112169215王睿男中國動物疫病預防控制中心獸醫(yī)師標準撰寫135218144126孫航中國動物疫病預防控制中心獸醫(yī)師標準撰寫136930053237葛忠源中聯(lián)瑞（北京）生物科技有限責任公司獸醫(yī)師推廣應用138105021688楊琪中聯(lián)瑞（北京）生物科技有限責任公司獸醫(yī)師標準撰寫186012523669朱小青中聯(lián)瑞（北京）生物科技有限責任公司獸醫(yī)師標準撰寫1861201151310陳莉麗中聯(lián)瑞（北京）生物科技有限責任公司獸醫(yī)師推廣應用1312187281611莊園中聯(lián)瑞（北京）生物科技有限責任公司獸醫(yī)師推廣應、標準編寫原則和主要內容（一）標準編寫原則本標準依據(jù)《中華人民共和國動物防疫法》的有關規(guī)定，在標準制定單位完成國家布魯氏菌病流行病學緊急監(jiān)測和常規(guī)監(jiān)測、診斷和防控技術研究等一系列工作基礎上，查閱有關文獻資料，依據(jù)“統(tǒng)一性、協(xié)調性、適用性、一致性、規(guī)范性”的原則，按照先進性、科學性、合理性和可操作性的要求以及GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》給出的規(guī)則編寫了本標準。此外，本標準編寫依照甘肅省地方標準管理辦法中地方標準制修訂工作應當遵循的原則進行。（二）主要內容本文件規(guī)定了布魯氏菌熒光偏振抗體檢測方法的適用范圍、規(guī)范性引用文件、原理、術語和定義、試劑、設備與耗材、操作步驟、結果判定、附錄。本文件適用于熒光偏振技術檢測動物血清中的光滑型布魯氏菌抗體。其中主要內容的解釋和說明如下：標準名稱：布魯氏菌熒光偏振抗體檢測方法。2.范圍：本文件描述了應用熒光偏振技術檢測布魯氏菌抗體的方法。本文件適用于熒光偏振技術檢測動物血清中的光滑型布魯氏菌抗體，可以用于動態(tài)監(jiān)測抗體消長變化，適用于未注射布魯氏菌疫苗動物的檢疫及評估養(yǎng)殖場布魯氏菌疫苗免疫狀況。3.規(guī)范性引用文件：本文件中引用和參考了最新版的國內標準、農業(yè)標準，以充分保證本標準條款的可依性和可行性。4.術語和定義：使用的術語和定義適用于本文件。5.原理：本文件描述了檢測方法的原理。6.試劑：本文件描述了所需的試劑。7.設備與耗材：本文件描述了所需的儀器與設備。8.操作步驟：本文件規(guī)定了相關試驗的具體操作步驟。9.結果判定：本文件規(guī)定了試驗成立標準與結果判定標準。10.附錄：本文件規(guī)定了相關試劑的制備方法與說明。三、主要驗證情況和分析本單位對相關重要的試驗項目進行了驗證，驗證結果來看，滿足標準編寫要求。（一）特異性指標驗證1.陰性檢出率檢測布魯氏菌抗體陰性血清60份，由中國動物疫病預防控制中心所采集提供，為田間未免疫布魯氏菌疫苗的30只山羊，30頭奶牛，用試管凝集試驗、布病競爭ELISA和補體結合試驗驗證為陰性血清，其中表中血清編號1-30號為山羊血清，31-60號為奶牛血清。采用布魯氏菌熒光偏振抗體檢測方法檢測上述60份陰性血清，并重復三次試驗，并用競爭ELISA同時驗證，檢測結果顯示布病FPA檢測60份陰性血清檢出率為98.33%，見表1。表1布魯氏菌抗體陰性血清檢測結果血清編號布病FPA抗體檢測方法競爭ELISA試驗第一次第二次第三次△mP值△mP值△mP值判定1-9.358-9.36-9.351—2-0.144-0.14-0.139—31.6831.6511.701—414.24113.91214.207—53.9543.8993.947—6-2.936-2.921-2.877—712.58712.38912.566—8-2.088-2.101-2.161—912.02112.12711.897—107.1517.2016.111—1116.38315.52316.413—128.468.5018.457—1320.05420.10120.066—1411.69911.66111.591—158.9218.9278.919—16-0.781-0.774-0.801—171.8841.8051.881—1811.18411.08510.982—196.2626.0616.251—2011.511.45411.506—2111.26311.0411.259—226.3216.3316.311—2312.60712.61112.583—247.2427.217.253—254.44.4134.382—26-0.537-0.531-0.544—27-2.19-2.091-2.111—287.8187.8037.779—296.8666.8516.861—309.4449.4519.437—319.1939.219.231—325.2585.2675.221—333.8583.8613.866—344.5944.6014.591—358.338.3168.329—367.4667.4297.464—378.0268.1218.033—382.0962.1282.031—396.6326.6286.599—407.6727.6497.701—4112.64112.59112.618—4215.5415.54115.558—432.5242.4832.479—442.452.4412.468—45-15.984-15.897-15.946—46-7.869-7.882-7.871—474.564.6084.611—482.9272.9112.898—497.5617.5467.607—508.9588.9478.96—516.8176.8116.815—52-0.921-0.911-0.943—533.2253.2183.221—54-2.304-2.273-2.3—5514.84514.82214.84—562.7932.7892.807—57-2.595-2.605-2.589—58-16.531-16.541-16.491—594.364.4084.367—60-11.269-11.301-11.287/NC0.1280.1210.125/NC0.1230.1190.12/NC0.1290.1250.127/PC92.53792.48692.501/注:1、FPA分析檢測判定標準：△mP≥20為陽性，△mP＜20為陰性。2.交叉試驗采用特異性質控血清5份，均為光滑型布魯氏菌抗體陰性血清，分別是大腸桿菌O157陽性血清N1、耶爾森氏菌O9陽性血清N2、粗糙性布魯氏菌M111陽性血清N3、布病陰性牛血清N4、布病陰性羊血清N5，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備、提供。將這5份血清用布病FPA分析檢測方法重復三次檢測，同時采用試管凝集進行平行實驗，比較2種檢測方法的特異性。結果全部為陰性，無特異性反應。數(shù)據(jù)見表2。表2特異性質控血清檢測結果特異性質控血清布病FPA抗體檢測方法競爭ELISA試驗第一次第二次第三次判定△mP值△mP值△mP值N1-0.738-0.731-0.744—N2-1.624-1.618-1.62—N3-11.964-11.958-11.961—N4-0.625-0.631-0.627—N5-6.9-6.907-7.021—NC0.1240.1290.127/NC0.120.1220.119/NC0.1250.1210.123/PC92.54192.49792.548/注:1、FPA分析檢測判定標準：△mP≥20為陽性，△mP＜20為陰性。（二）敏感性指標驗證1.最小檢出量試驗本品系用布魯氏菌熒光偏振試劑盒陰性對照血清將陽性對照血清（試管凝集效價為1:320）分別進行1:4（敏感性質控血清P1）、1:16（敏感性質控血清P2）、1:64（敏感性質控血清P3）、1:128（敏感性質控血清P4）稀釋得到陽性質控血清P1-P4，采用FPA分析檢測方法進行檢測結果顯示，三次重復試驗數(shù)據(jù)一致，靈敏度均可達1:64。數(shù)據(jù)如見表3。表3布病敏感性質控血清檢測結果敏感性質控血清布病FPA抗體檢測方法第一次第二次第三次△mP值△mP值△mP值1﹕486.29286.31287.0021﹕1649.56950.12850.2311﹕6433.88634.08133.9041﹕12816.54116.5516.489NC0.1220.1250.127NC0.1250.1280.121NC0.1260.1290.124PC92.49892.48792.511注:1、FPA分析檢測判定標準：△mP≥20為陽性，△mP＜20為陰性。2.陽性檢出率試驗經(jīng)試管凝集試驗、布病競爭ELISA和補體結合試驗驗證布病陽性血清60份，其中包括其中表中血清編號1-30號為山羊陽性血清，31-60號為奶牛陽性血清，由中國動物疫病預防控制中心制備、保存。采用布病FPA分析檢測方法重復三次檢測60份血清，并用試管凝集試驗同時檢測，檢測結果顯示布病FPA檢測60份陽性血清檢出率為98.33%，見表4。表4FPA法布病陽性血清重復檢測結果血清編號布病FPA抗體檢測方法競爭ELISA試驗第一次第二次第三次△mP值△mP值△mP值判定121.22321.23121.218+225.62525.61125.627+321.87121.85121.863+427.56827.54827.565+530.80430.8130.785+696.03496.15696.21+792.65992.65192.711+893.15893.10793.218+9104.968104.853104.91+1092.47592.44892.501+1198.11698.10698.11+1294.35394.36194.375+1396.32796.25195.871+1498.50699.01298.482+1529.31730.12529.319+1654.60854.51555.162+1798.57597.81598.591+1899.357100.25199.421+1978.01778.10577.681+2021.13821.21120.876+2135.25835.35835.121+2233.85834.51233.77+2344.59443.85144.469+2498.3398.54198.477+2537.46636.95137.251+2626.0326.11325.775+2752.80952.90353.016+28109.093109.051108.899+2945.2945.41145.316+3028.14528.00127.881+3172.65372.26373.157+3214.38914.62113.897+3318.51218.45118.561+3421.44321.62121.453+3523.03523.11722.977+3622.72722.86122.717+3726.62626.60126.751+3822.62222.33222.562+3921.65422.15622.011+4071.77971.66171.752+4169.09869.10169.1+4273.28773.51173.302+4371.52670.95171.466+4471.08871.21771.118+4520.52420.65820.775+4622.4522.46122.399+4747.56147.53147.771+4838.95838.69838.558+4986.81786.11786.257+5029.26129.51229.751+5119.10719.11719.427+5266.66266.60567.014+5330.1130.41129.844+5423.12923.41523.169+5516.99417.09416.91+5623.11523.13329.915+5723.70823.61523.801+5822.0352245122.652+5933.32933.30133.251+6027.69227.62227.751/NC0.1270.1280.125/NC0.1240.1260.123/NC0.1220.1210.125/PC92.50892.49792.491/注:1、FPA分析檢測判定標準：△mP≥20為陽性，△mP＜20為陰性。四、標準中涉及專利的情況說明無相關專利申報和授權情況。五、預期達到的社會效益、對行業(yè)發(fā)展的作用布病是在我國列為二類動物疫病，是嚴重危害人類健康的人畜共患病之一，是我國優(yōu)先防治的病種。鑒于近年畜間布病的高位流行和擴散態(tài)勢，建立布病熒光偏振的快速、高效、準確檢測方法是必要的和亟需的，也是對布病防控具有重要意義的。當前布病防控采取疫苗預防和陽性剔除凈化策略，發(fā)現(xiàn)病例，凈化撲殺患病牛羊，遏制畜間傳播，最大可能的減小經(jīng)濟損失。對本病的高危流行地區(qū)防控采用疫苗免疫預防，低風險區(qū)可采用陽性撲殺凈化，而血清學抗體檢測的熒光偏振方法以10分鐘近100份樣品的高通量、快速檢測大大提高了畜群場全覆蓋監(jiān)測效率，極大程度的縮短了人與樣品的暴露與接觸時間，為早期防止人畜傳播提供了保障，對公共衛(wèi)生安全和社會效益是有重大意義的。布病熒光偏振抗體檢測技術是布病快速監(jiān)測、及時指導防控策略和保障畜群養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的有力手段。針對此情況，特制定此標準，應用此標準，對提高我國布病血清學抗體檢測水平和該病的防控具有重要的現(xiàn)實意義。六、采用國際標準和國外先進標準情況，國內外關鍵指標對比分析目前，國際上針對布病的診斷試驗標準有OIE陸生動物手冊3.01.04，關于布病的診斷方法有細菌培養(yǎng)、熒光偏振試驗、熒光PCR方法、普通PCR方法、玫瑰孟加拉試驗、凝集試驗、補體結合試驗、間接ELISA、競爭ELISA。國內的標準為GB/T18646-2018動物布魯氏菌