高分子雜質(zhì)的種類

Contents概述1β-內(nèi)酰胺類2氨基糖苷類3四環(huán)素類4高分子雜質(zhì)檢查5第一節(jié)概述1.抗生素（antibiotics）

在低微濃度下即可對某些生物（病原微生物）的生命活動有特異抑制作用的化學(xué)物質(zhì)的總稱2.分類

β–內(nèi)酰胺類(青霉素類、頭孢菌素類)氨基糖苷類(鏈霉素、慶大霉素、依替米星)四環(huán)素類(四環(huán)素、金霉素、土霉素)

大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、螺旋霉素、麥迪霉素)多烯大環(huán)類(制霉菌素、兩性霉素B)多肽類(多黏菌素、放線菌素)第一節(jié)概述3.來源生物合成（發(fā)酵）化學(xué)合成或半合成4.特點化學(xué)純度較低活性組分易發(fā)生變異穩(wěn)定性差第一節(jié)概述5.抗生素質(zhì)量分析——生物學(xué)法、物理化學(xué)法

鑒別：理化方法、微生物法

檢查：水分、pH值、異常毒性、熱原、細(xì)菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)等

含量/效價測定：

微生物法：

與臨床療效吻合,靈敏度高，結(jié)果直觀，適用范圍廣；但操作復(fù)雜費時，誤差大

理化方法：準(zhǔn)確度與專屬性較高,且操作簡便；但與臨床療效有偏差第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類青霉素(芐青霉素)(penicillins)氨芐西林阿莫西林第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類頭孢氨芐頭孢拉定頭孢羥氨芐頭孢噻吩鈉第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類6-aminopenicillanicacid,簡稱6-APA青霉素類7-aminocephalosporanicacid,簡稱7-ACA頭孢菌素類氫化噻唑環(huán)氫化噻嗪環(huán)＊＊＊＊第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.酸性（羧基）

pKa2.5-2.8，酸性較強。堿金屬鹽水溶性好，有機堿鹽難溶于水。普魯卡因青霉素第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類2.手性C（旋光性）﹡﹡﹡﹡﹡3.UV青霉素類：苯環(huán)取代基頭孢菌素類：母核有共軛結(jié)構(gòu)260nm4.β–內(nèi)酰胺環(huán)(四元環(huán)張力+酰胺鍵)

第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類干燥條件較穩(wěn)定，溶液不穩(wěn)定某些氧化劑、金屬離子、溫度第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類二、Identification(一)色譜法HPLC(tR)TLC(Rf)(二)光譜法IRUVNMR第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類頭孢利定的NMR鑒別法(JP14)取本品50mg溶于0.5ml重水中，測定NMR光譜時，應(yīng)顯示δ3.8附近δ6.9～7.5δ7.9～9.0

單峰信號多重峰信號多重峰信號

2：3：5第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類(三)呈色反應(yīng)1）羥肟酸鐵反應(yīng)——β–內(nèi)酰胺環(huán)β–內(nèi)酰胺類NH2OH·HClNaOH羥肟酸Fe3+H+顯色（紅、棕、褐）2）茚三酮反應(yīng)——α-氨基茚三酮Δ

藍(lán)紫色第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類α3）雙縮脲反應(yīng)——β–內(nèi)酰胺類堿性酒石酸銅紫色第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類4）變色酸-硫酸反應(yīng)H2SO4Δ

HCHO變色酸（縮合）顯色5）重氮苯磺酸反應(yīng)——酚羥基（偶合）6）銅鹽反應(yīng)——頭孢氨芐的專屬反應(yīng)7）硫酸-甲醛反應(yīng)(BP)第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類青霉素鉀和青霉素鈉呈紅棕色(四)焰色反應(yīng)——K+、Na+三、PurityTest(聚合物、有關(guān)物質(zhì)、異構(gòu)體等)1.聚合物頭孢他啶中聚合物測定第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

用葡聚糖凝膠G-10（40～120

m）為填充劑，玻璃柱內(nèi)徑1.3～1.6cm，床體積50～60ml；流動相A為含3.5%硫酸銨的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鈉2.19g和磷酸二氫鈉0.54g，加水100ml使溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0），流動相B為水；流速為0.8ml/min；檢測波長為254nm。以流動相A為流動相，用0.1mg/ml藍(lán)色葡聚糖2000溶液進(jìn)樣200

l進(jìn)行測定，理論板數(shù)應(yīng)不低于900，拖尾因子在0.75～1.5。兩種流動相系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖的保留時間比應(yīng)在0.93～1.07之間。對照品溶液以流動相B為流動相，重復(fù)進(jìn)樣200

l，峰面積值的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)小于5.0%。對照品溶液的制備取頭孢他啶對照品適量，精密稱定，加水制成每1ml中含頭孢他啶100

g的溶液，搖勻第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類測定法

取本品適量，精密稱定，加水制成每1ml中約含頭孢他啶20mg的溶液，立即進(jìn)樣200

l，以流動相A為流動相進(jìn)行測定，記錄色譜圖；另取對照品溶液200

l注入液相色譜儀，以流動相B為流動相，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算，本品含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計不得過0.3%主成分自身對照法面積歸一化法限量法自身對照外標(biāo)法

萄聚糖凝膠立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖原理——“分子篩”第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類2.有關(guān)物質(zhì)與異構(gòu)體頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：ODS分析柱；0.2mol/L磷酸二氫銨-甲醇（62:?38）為流動相，流速1ml/min；檢測波長278nm。要求頭孢呋辛酯A，B異構(gòu)體之間，頭孢呋辛酯A異構(gòu)體與頭孢呋辛酯△2-異構(gòu)體之間的分離度應(yīng)大于1.5；理論板數(shù)按頭孢呋辛酯A異構(gòu)體峰計算，應(yīng)不低于1500異構(gòu)體取本品適量，配制成每1ml中約含0.25mg的溶液，取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。B異構(gòu)體峰的相對保留時間約為0.85，A異構(gòu)體峰的相對保留時間為1.0。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類40020600302010時間(min)峰高(mAU)65432113.95411.9192.401供試品色譜圖中A異構(gòu)體峰的面積與A、B異構(gòu)體峰的面積和之比應(yīng)為0.48～0.55。BA△3-EE第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類有關(guān)物質(zhì)

取本品適量，精密稱定，加流動相制成約含0.25mg/ml的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動相制成2.5

g/ml的溶液，作為對照溶液。取對照溶液20

l注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10%，再取供試品溶液和對照品溶液各20

l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的3.5倍，供試品溶液如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和，其中E異構(gòu)體峰面積不得大于對照溶液主峰面積之和(1.0%)，△3-異構(gòu)體峰面積不得大于1.5倍(1.5%)，其余單個雜質(zhì)峰面積的和不得大于3倍(3.0%)。(供試品溶液中任何小于對照品溶液主峰面積之和0.05倍的峰可忽略不計)3.UV第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類4.有機溶劑5.結(jié)晶性第一法(偏光顯微鏡法)第二法(X射線粉末衍射法)四、Assay碘量法汞量法酸堿滴定法羥肟酸比色法HPLC法第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類阿莫西林克拉維酸鉀片色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉7.8g，加水900ml溶解，用磷酸或10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.4±0.1，加水稀釋至1000ml)-甲醇(95:5)為流動相；流速為0.7ml/min；檢測波長為220nm。阿莫西林峰與克拉維酸峰的分離度應(yīng)大于3.5

測定法

取本品10片，置1000ml量瓶中，加水適量，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10

l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取阿莫西林對照品與克拉維酸對照品各適量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉維酸0.25mg的混合溶液，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積分別計算供試品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類第三節(jié)氨基糖苷類氨基環(huán)醇+氨基糖→苷鏈霉素(Streptomycin)第三節(jié)氨基糖苷類巴龍霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脫氧鏈霉胺巴龍胺D－核糖巴龍霉糖巴龍二糖胺第三節(jié)氨基糖苷類慶大霉素(gentamycin)絳紅糖胺(紫素胺)2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺(N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺)第三節(jié)氨基糖苷類一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1）堿性（氨基）：臨床應(yīng)用其硫酸鹽2）溶解度（氨基、羥基）：水溶性3）旋光性（糖）：多個手性碳4）穩(wěn)定性（苷）：強酸、堿條件均可水解二、Identification第三節(jié)氨基糖苷類坂口反應(yīng)麥芽酚反應(yīng)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)第三節(jié)氨基糖苷類1.茚三酮反應(yīng)——羥基胺類,α-氨基酸△2.Molisch試驗——五碳糖或六碳糖結(jié)構(gòu)紅紫色羥甲基糠醛(含六碳糖結(jié)構(gòu)氨基糖苷類酸性水解產(chǎn)物)第三節(jié)氨基糖苷類藍(lán)紫色3.N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)（Elson-Morgan反應(yīng)）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+紅色第三節(jié)氨基糖苷類乙酰丙酮OH-對二甲氨基苯甲醛H+第三節(jié)氨基糖苷類4.麥芽酚反應(yīng)——鏈霉糖特有反應(yīng)H+5.坂口反應(yīng)——鏈霉胍特有反應(yīng)鏈霉素OH-水解8-羥基喹啉NaOBr或α-萘酚

鏈霉胍橙紅色6.硫酸鹽反應(yīng)7.色譜法8.光譜法第三節(jié)氨基糖苷類三、PurityTest1.鏈霉素中鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）的檢查來源：發(fā)酵中產(chǎn)生方法：TLC中的對照品法2.硫酸奈替米星中西索米星的檢查(TLC)3.慶大霉素C組分的測定第三節(jié)氨基糖苷類色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水－冰醋酸－甲醇(25:5:70)配制的0.02mol/L庚烷磺酸鈉溶液為流動相（必要時調(diào)節(jié)甲醇的含量）；檢測波長為330nm。理論板數(shù)按C2組分峰計算應(yīng)不低于2000。C2a

峰和C2峰的分離度應(yīng)符合要求。測定法取本品適量，精密稱定，加水制成每1ml中含0.65mg的溶液，精密量取4.0ml，置10ml量瓶中，加異丙醇2ml與鄰苯二醛試液1.6ml，用異丙醇稀釋至刻度，搖勻，置60℃水浴中加熱15分鐘，冷卻，濾過，取續(xù)濾液10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，同法測定。C組分的保留時間依次為：C1、C1a、C2a、C2。量取C1、C1a、C2a、C2的峰面積。C1應(yīng)為25％～50％，C1a應(yīng)為15％～40％，C2a＋C2應(yīng)為20～50％

。第三節(jié)氨基糖苷類慶大霉素?zé)o紫外吸收，需進(jìn)行衍生化處理后再進(jìn)行HPLC測定。λmax=330nm討論第三節(jié)氨基糖苷類1、柱效：以C2峰計算，理論板數(shù)應(yīng)不低于2000，在此柱效下各組分之間才能達(dá)到規(guī)定的分離度。為此色譜柱做適當(dāng)選擇。2、流動相：流動相極性適當(dāng)控制(適當(dāng)調(diào)節(jié)甲醇的比例)。極性過強，出峰快，分離不佳。C1峰與衍生試劑等雜質(zhì)峰難分析;極性過弱，出峰太慢。實驗表明，C2峰的保留時間控制在20min～30min較為適宜。3、衍生化試劑與衍生物的穩(wěn)定性：配制后不能久置，時間久了試劑峰峰高增加并影響組分測定，一般避光保存可使用三天。生成的衍生物不穩(wěn)定。4、離子對試劑濃度影響：離子對試劑濃度對慶大霉素OPA衍生物保留值有影響。第三節(jié)氨基糖苷類BP(2005)——HPLC-ECDCh.P——HPLC-ELSD4.硫酸鹽測定——EDTA滴定四、Assay微生物檢定法HPLC法第四節(jié)四環(huán)素類ABCD123456789101112一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)第四節(jié)四環(huán)素類1）兩性：

-OH→酸性N(CH3)2→堿性

Ca2+、Mg2+生成不溶性鹽；Fe3+形成紅色配合物；Al3+形成黃色配合物；pH3~7.5多價陽離子與酚二酮→熒光

與酸、堿均可成鹽；臨床多用鹽酸鹽；強酸或強堿中溶解度↑

2）旋光性3）UV和熒光4）與金屬離子絡(luò)合(酚羥基、烯醇基)弱酸性（pH2-6）A環(huán)C-4異構(gòu)化差向四環(huán)素酸性（pH<2）C環(huán)脫水脫水四環(huán)素堿性C環(huán)開環(huán)，形成內(nèi)酯異四環(huán)素5）不穩(wěn)定性第四節(jié)四環(huán)素類A.差向異構(gòu)化藍(lán)色熒光淡黃→黑第四節(jié)四環(huán)素類AApH2.0~6.0（氫鍵，土霉素、多西環(huán)素不易差向異構(gòu)化）第四節(jié)四環(huán)素類B.酸性脫水降解λmax=445nmλmax=435nmDDDCBBCBCC.堿性脫水降解第四節(jié)四環(huán)素類OH-第四節(jié)四環(huán)素類二、Identification1、HPLC2、TLC(正相分配薄層色譜)EDTA→克服痕量金屬