高效液相色譜和液相色譜

高效液相色譜和液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒體中代謝產(chǎn)物及途徑劉榮飛;劉幸;劉曉宇;范雯婷;趙冬冬;石旺榮;朱雨田;李宏【摘要】采用差速離心法制備鯽魚(yú)肝微粒體,選擇已經(jīng)建立的肝微粒體系統(tǒng)進(jìn)行體外孵育,研究有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒體中的代謝.產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯萃取2次,取出有機(jī)相于40工下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加lmL甲醇，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分離測(cè)定,液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(LC-ESI/MS)鑒定其分子結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)了3種代謝產(chǎn)物(M1:二乙基硫代磷酸；M2:四乙基二硫代焦磷酸；M3:辛氧磷)，據(jù)此推斷辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒體(細(xì)胞色素P450酶系)的作用下進(jìn)行了脫硫氧化、水解反應(yīng)?從而可推斷辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒體中的代謝途徑和代謝特點(diǎn),為進(jìn)一步研究其體內(nèi)代謝和代謝酶奠定基礎(chǔ).％Thelivermicrosomeswerepreparedbydifferentialultracentrifugationfortheinvestigationofinvitrometabolismofphoxim.Themetaboliteswereextractedtwicefromthereactionsolutionwithethylacetate,removetheorganicphasetorotaryevaporatorbyneardrynessat40°C,thenconstantvolumeby1mLmethanol,separatedanddeterminedbyHPLC,andthenidentifiedbyHPLC-MS(ESI).Threemajormetabolites(M1:O,O,O',O'-tetraethyldithiopyrophosphate,M2:diethylthiophosphateandMs:phoxom)indicatedthatphoximunderwentdesulfur-oxidationandhydrolysisincruciancarplivermicrosomes.Therefore,thisstudydeducedthemetabolicpathwayandmetaboliccharacteristicofphoximinlivermicrosomesofcruciancarpandlaidasolidfoundationforfurtherstudyofitsmetabolismandmetabolicenzymes.期刊名稱】《分析化學(xué)》年(卷),期】2013(041)006【總頁(yè)數(shù)】6頁(yè)(P893-898)【關(guān)鍵詞】辛硫磷;鯽魚(yú);肝微粒體;體外代謝;液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用【作者】劉榮飛;劉幸;劉曉宇;范雯婷;趙冬冬;石旺榮;朱雨田;李宏【作者單位】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,武漢430070;華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,武漢430070;華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,武漢430070;華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,武漢430070;華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,武漢430070;華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,武漢430070;華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,武漢430070;華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,武漢430070【正文語(yǔ)種】中文引言自20世紀(jì)80年代起，我國(guó)有機(jī)磷農(nóng)藥工業(yè)進(jìn)入了高速發(fā)展的階段。由于有機(jī)磷農(nóng)藥具有高效、廣譜、低毒、抗性發(fā)展緩慢、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，在防治農(nóng)業(yè)生產(chǎn)害蟲(chóng)大爆發(fā)時(shí)發(fā)揮了極其重要的作用[1]。但與此同時(shí)，其污染效應(yīng)也擴(kuò)展到整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)。曾有報(bào)道指出，在農(nóng)藥的使用過(guò)程中，僅有1%左右的農(nóng)藥作用于靶生物，其余殘留于土壤或通過(guò)地表徑流進(jìn)入水環(huán)境，從而對(duì)土壤生物和水生生物造成危害，導(dǎo)致生態(tài)平衡被破壞[2]。我國(guó)農(nóng)藥生產(chǎn)總量中有機(jī)磷農(nóng)藥仍然是主要的農(nóng)藥品種，占?xì)⑾x(chóng)劑總量的70%[3]。有機(jī)磷農(nóng)藥主要是使乙酰膽堿酯酶(AChE)活性中心的絲氨酸羥基磷?；?，從而使其喪失水解乙酰膽堿的能力，造成乙酰膽堿大量蓄積，引起膽堿能神經(jīng)和部分中樞神經(jīng)功能的過(guò)度興奮，繼而轉(zhuǎn)入抑制和衰竭，產(chǎn)生中毒癥狀，同時(shí)其代謝產(chǎn)物的毒性作用有可能比母藥更大［4，5］。辛硫磷，又名肟硫磷、倍腈松、腈肟磷，化學(xué)名O,O-二乙基-0-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯，分子式為C12H15N2O3PS。由于其具有高效、廣譜、安全及對(duì)人畜低毒的特點(diǎn)，因而在我國(guó)被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也被用作漁藥。因而通過(guò)研究其在水產(chǎn)品中的代謝產(chǎn)物及途徑，可明確其對(duì)水產(chǎn)品的危害程度，對(duì)保障水產(chǎn)品安全具有積極意義。迄今，關(guān)于有機(jī)磷農(nóng)藥在水產(chǎn)品中的代謝研究鮮見(jiàn)報(bào)道。目前，有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要有色譜法和快速檢測(cè)法兩大類。色譜法是目前農(nóng)藥殘留主要的檢測(cè)方法，包括氣相色譜法(GC)［6］和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)［7］、高效液相色譜法(HPLC)和高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)［8］等。其特點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間略長(zhǎng)，但準(zhǔn)確度和精密度高，可為有機(jī)磷農(nóng)藥殘留提供執(zhí)法依據(jù)。王耀等［7］采用GC-MS法測(cè)定了咸魚(yú)中的多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留;張?jiān)频龋?］建立了同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中7種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的HPLC-MS法，樣品經(jīng)酸化的乙酸乙酯提取，酸性氧化鋁凈化后進(jìn)樣分析，外標(biāo)法定量?？焖贆z測(cè)法包括免疫分析技術(shù)、酶抑制法等。這兩類方法各有所長(zhǎng)，在實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)具體情況選用。本研究選擇鯽魚(yú)作為淡水養(yǎng)殖魚(yú)類的代表，選擇辛硫磷作為有機(jī)磷農(nóng)藥代表，進(jìn)行體外孵育，采用HPLC和LC-ESI/MS法對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定，旨在闡明其在肝微粒體中的代謝途徑和代謝特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究其體內(nèi)代謝和代謝酶奠定基礎(chǔ)。雖然之前利用該方法探究代謝機(jī)理有類似的研究,Roy等［9］研究了殺螟松在小鼠肝臟中的代謝，用HPLC和IR技術(shù)鑒定和檢測(cè)代謝產(chǎn)物及其濃度，發(fā)現(xiàn)注射殺螟松24h后，小鼠肝臟中有3種主要代謝產(chǎn)物，并且發(fā)現(xiàn)注射不同濃度的殺螟松其代謝的途徑也不同。Kitamura等［10］比較了倍硫磷和其代謝產(chǎn)物倍硫磷亞砜在鯛魚(yú)、金魚(yú)和小鼠體外的代謝，并且測(cè)定了3種生物的肝微粒體酶活活性，結(jié)果表明，鯛魚(yú)和金魚(yú)肝微粒體酶活活性低于小鼠，倍硫磷和倍硫磷亞砜在細(xì)胞色素P450作用下可以相互轉(zhuǎn)化。但有關(guān)有機(jī)磷農(nóng)藥，尤其是辛硫磷，在水產(chǎn)品中的代謝產(chǎn)物的研究相對(duì)較少，CYP450與有機(jī)磷農(nóng)藥的效應(yīng)關(guān)系也可為后續(xù)研究有機(jī)磷農(nóng)藥在水生生物體內(nèi)的代謝調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)部分儀器與試劑HimacCP80WX型超高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）;高效液相色譜（美國(guó)Waters公司）;1100Series液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）;UV-1700紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）;722型分光光度計(jì)（天津市普瑞斯儀器有限司）;ML204型電子分析天平（MettlerToledo公司）。辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）;甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；還原型輔酶口（NADPH,純度＞98.0%,Roche公司）;三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度〉99.9%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蔗糖、乙酸乙酯、三氯乙酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。肝微粒體的制備采用差速離心法［11-13］。暫養(yǎng)鯽魚(yú)禁食過(guò)夜后，擊打頭部將其處死，解剖取出肝臟，去除脂肪和結(jié)締組織，用0.9%生理鹽水反復(fù)漂洗除去紅細(xì)胞，用濾紙吸去多余液體后稱重，轉(zhuǎn)入手動(dòng)玻璃勻漿器，按1：4（w/V）的比例加入蔗糖-Tris-HCl緩沖液（pH7.4），置于冰浴中制成勻漿。將勻漿物通過(guò)一層紗布過(guò)濾轉(zhuǎn)入預(yù)冷離心管中，于高速冷凍離心機(jī)中，在2-4°C下，13000g離心20min，棄除上清液上層漂浮脂質(zhì);取出其余上清液轉(zhuǎn)移至離心管，在2-4C條件下，10500g離心60min，棄上清液，沉淀即為微粒體組分。將微粒體用KCl-Tris-HCl緩沖液(pH7.4)懸浮，每克肝加懸浮液1mL混合后，分裝于凍存管中，-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。辛硫磷與肝微粒體的孵育微粒體(2g/L)和1mmol/LNADPH在0.9mLKCI-Tris-HCI緩沖液中預(yù)反應(yīng)2min，再加100pmoI/L辛硫磷開(kāi)始反應(yīng)120min，反應(yīng)總體積1.2mL。不含NADPH或農(nóng)藥為空白組。反應(yīng)用0.3mL三氯乙酸(15%,w/V)終止。加入3mL乙酸乙酯和1mLNaCI(3%,w/w)，對(duì)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取，室溫下在振蕩器上劇烈振蕩3min，在4C條件下3000r/min離心10min。取出有機(jī)相，用3mL乙酸乙酯對(duì)水相進(jìn)行再次提取，同樣條件下離心，取出有機(jī)相于40C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干;殘?jiān)?mL甲醇溶解，過(guò)0.45pm濾膜，供HPLC和LC-MS分析。色譜-質(zhì)譜條件HypersilODSC18色譜柱(250mmx4.6mmx5pm,依利特公司);檢測(cè)波長(zhǎng):254nm;流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量:10pL;柱溫:40°C。流動(dòng)相:水(A)-甲醇(B),采用梯度洗脫:0~22min,49%B;35min,70%B;55min,70%B;60min,49%B;70min，49%B。ESI離子源，正離子模式，噴射電壓:3500V,噴射壓力:40psi;干燥氣流速:10L/min;干燥氣溫度:325°C;掃描質(zhì)量范圍:m/z50~800。3結(jié)果與討論3.1辛硫磷在肝微粒體中代謝物的分離辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒體中代謝產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果如圖1所示，與空白對(duì)照組(不含辛硫磷或者不含NADPH)進(jìn)行比較，色譜圖中保留時(shí)間42.704min的色譜峰對(duì)應(yīng)的組分為辛硫磷，保留時(shí)間13.390,17.205和24.213min的色譜峰對(duì)應(yīng)的組分分別為辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒中代謝的可能產(chǎn)物M1,M2和M3。3.2辛硫磷在肝微粒體中代謝物的鑒定LC-MS集合了HPLC的高分離效能與MS的強(qiáng)結(jié)構(gòu)鑒定功能，具有靈敏度高、選擇性好、分析快速、方便等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為一種優(yōu)越的結(jié)構(gòu)鑒定工具。表1顯示LC-MS分析得到辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒中代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。ESI-MS是一種軟電離技術(shù)，采用正離子模式，對(duì)極性物質(zhì)主要形成質(zhì)子化的分子離子峰，多數(shù)情況下不會(huì)出現(xiàn)碎片。圖2為辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒中代謝產(chǎn)物的總離子流圖。3.2.1代謝物M1的結(jié)構(gòu)鑒定代謝物M1的MS，MS2和其裂解途徑如圖3所示。在ESI離子源作用下，m/z171,經(jīng)初步碰撞誘導(dǎo)電離，首先裂解去一個(gè)乙基(-C2H5)，產(chǎn)生［M+H-29］+碎片離子峰(m/z143)；接著進(jìn)一步裂解，去一個(gè)乙基(--C2H5)，產(chǎn)生m/z115的碎片離子峰。結(jié)合辛硫磷的結(jié)構(gòu)及其裂解途徑，因此可推斷M1為二乙基硫代磷酸。圖1辛硫磷代謝物形成的HPLC色譜圖Fig.1RepresentativeHPLCchromatogramofmetabolitesofphoximformeda.空白組(不含辛硫磷);b.空白組(不含還原型輔酶口);c?鯽魚(yú)肝微粒與NADPH孵育。a.control(nophoxim);b.Control(nonicotinamideadeninedinucleotidephosphate(NADPH));c.CruciancarplivermicrosomeswereincubatedwithNADPH.3.2.2代謝物M2的結(jié)構(gòu)鑒定代謝物M2的MS,MS2和其裂解途徑如圖4所示。m/z=323，而有文獻(xiàn)已報(bào)道鑒定了分子量是322的辛硫磷光解產(chǎn)物為四乙基二硫代焦磷酸［14］。進(jìn)一步的結(jié)合代謝物M2的MS2，在ESI離子源作用下，裂解去一個(gè)乙基(-C2H5)產(chǎn)生［M+H-29］+碎片離子峰(m/z295)，裂解去一個(gè)乙氧基(-OC2H5)，產(chǎn)生m/z277碎片離子峰，從中間的P-O鍵斷裂產(chǎn)生m/z171碎片離子峰，并且M2存在與辛硫磷相同的碎片離子m/z143，因此可推斷M2為四乙基二硫代焦磷酸。表1辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒中代謝物的分子量和結(jié)構(gòu)分析Table1Moleculeweightsandstructuralidentificationofphoximmetabolitesincruciancarplivermicrosomes代謝物Metabolites保留時(shí)間Rt(min)準(zhǔn)分子離子[M+H]+(m/z)二級(jí)碎片MS/MS(m/z)結(jié)構(gòu)IdentificationM114.3171143,115二乙基硫代磷酸DiethythiophosphateM217.2323295,277,173,143四乙基二硫代焦磷酸TetraethyldithiopyrophosphateM324.2283225,129辛氧磷Phoximoxon圖2辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒中代謝產(chǎn)物的總離子流圖Fig.2Totalioncurrentchromatogramofphoximmetabolitesincruciancarplivermicrosomes3.2.3代謝物M3的結(jié)構(gòu)鑒定代謝物M3的MS,MS2和其裂解途徑如圖5所示，分子量為282，比辛硫磷的分子量少16Da，表明有可能是辛硫磷的脫硫氧化產(chǎn)物。而有文獻(xiàn)已報(bào)道辛硫磷在昆蟲(chóng)體內(nèi)進(jìn)行脫硫氧生成辛氧磷，分子量為282[15]。為了進(jìn)一步對(duì)代謝物M3鑒定，結(jié)合其MS2圖，在ESI離子源作用下，經(jīng)初步碰撞誘導(dǎo)電離，裂解去2個(gè)乙基(-C2H5)產(chǎn)生[M+H-58]+碎片離子峰，并且代謝物M3存在與辛硫磷相同的碎片離子m/z129。因此可推斷M3為辛氧磷。圖3代謝物M1的MS⑻和MS2(b)圖及其可能的裂解途徑(c)Fig.3MS(a),MS2(b)spectraandproposedfragmentationpathways(c)ofmetaboliteM1圖4代謝物M2的MSI(a)和MS2(b)圖及其可能的裂解途徑(c)Fig.4MS(a),MS2(b)spectraandproposedfragmentationpathways(c)ofmetaboliteM23.3辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒體中代謝物HPLC-MS分析在解析電噴霧質(zhì)譜圖時(shí)，通過(guò)加合離子可有效地確定分子離子峰的質(zhì)荷比[16]。根據(jù)分子離子峰與氫離子所形成的分子加合離子峰，可確定出辛硫磷代謝產(chǎn)物M1，M2和M3分子離子峰的質(zhì)荷比。在上述3種化合物中，典型的質(zhì)譜碎裂方式有：(1)從分子離子(M)中脫去乙基(M-C2H5:m/z=M-29)、乙氧基(M-OC2H5:m/z=M-58);(2)P-0鍵之間的離子碎裂，在辛硫磷代謝產(chǎn)物M2中，對(duì)應(yīng)的離子碎片為m/z171;(3)N-O鍵之間的離子碎裂，在辛硫磷代謝產(chǎn)物M3中，對(duì)應(yīng)的離子碎片為m/z129。產(chǎn)物M1是辛硫磷水解后的產(chǎn)物，根據(jù)其MS2圖顯示有m/z143和115的兩個(gè)碎片離子峰，結(jié)合辛硫磷的結(jié)構(gòu)和裂解途徑，推斷出M1為二乙基硫代磷酸;產(chǎn)物M2是M1縮合掉一分子水所得到的四乙基二硫代焦磷酸，相關(guān)文獻(xiàn)已報(bào)道了該產(chǎn)物是辛硫磷的光解產(chǎn)物，這可能是因?yàn)轹a魚(yú)肝微體P450酶系有同樣的催化作用。產(chǎn)物M3是辛硫磷發(fā)生脫硫氧化形成的產(chǎn)物，辛硫磷在ESI質(zhì)譜中分子離子的主要碎片離子為m/z171,143，129，115(基峰)，而化合物M3分子離子的主要離子碎片為m/z225和129(基峰);但兩者的共同之處在于離子碎裂發(fā)生在N--O鍵之間，主要原因是該種方式的斷裂產(chǎn)生的正離子內(nèi)能較低，穩(wěn)定性較高。圖5代謝物M3的MS⑻和MS2(b)圖及其可能的裂解途徑(c)Fig.5MS(a)，MS2(b)spectraandproposedfragmentationpathways(c)ofmetaboliteM3圖6辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒體中可能的代謝途徑Fig.6Proposedmetabolicpathwayofphoximincruciancarplivermicrosomes辛硫磷在鯽魚(yú)肝微體中的代謝途徑根據(jù)以上HPLC-MS分析結(jié)果推測(cè)，辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒體P450酶系的作用下的轉(zhuǎn)化過(guò)程如圖6所示。有機(jī)磷農(nóng)藥在生物體內(nèi)往往經(jīng)歷吸收、分布、轉(zhuǎn)化和排泄4個(gè)基本過(guò)程，轉(zhuǎn)化速率以及形成的代謝物類型取決于生物體的種類，這構(gòu)成了有機(jī)磷農(nóng)藥選擇性的代謝基礎(chǔ)。微粒體中細(xì)胞色素P450酶系在轉(zhuǎn)化階段起著非常重要的作用。已知細(xì)胞色素P450酶系能夠催化氧化、還原和水解等多種反應(yīng)[17]。通過(guò)這些反應(yīng)，生物體將外源化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成毒性增強(qiáng)或減弱的其它化合物。邊文杰等[18]報(bào)道了毒死蜱、對(duì)硫磷和馬拉硫磷均能在魚(yú)類肝細(xì)胞色素P450的作用下進(jìn)行脫硫代謝生成相應(yīng)的氧化產(chǎn)物。本研究結(jié)果表明，辛硫磷在鯽魚(yú)肝微粒體細(xì)胞色素P450的作用下進(jìn)行了脫硫氧化和水解反應(yīng)，但P450酶系與有機(jī)磷農(nóng)藥的相關(guān)分子作用機(jī)理有待進(jìn)一步的研究同時(shí)對(duì)于體內(nèi)代謝而言，占主導(dǎo)地位的反應(yīng)種類尚不清楚。從代謝產(chǎn)物分離的結(jié)果分析，代謝辛硫磷的P450酶系活力不高，是否與魚(yú)種類、辛硫磷或者反應(yīng)及提取條件有關(guān)尚不清楚，有待進(jìn)一步探索。References【相關(guān)文獻(xiàn)】HEHong-Wu.ChineseJ.WorldPesticides，2008，30:29－33賀紅武.世界農(nóng)藥，2008，30:29－33SHENGuo-Xing，YANGuo-An.ChineseJ.AdvanceinEnvironmentalScience，1999，7:131－140沈國(guó)興，嚴(yán)國(guó)安.環(huán)境科學(xué)進(jìn)展，1999，7:131－140GAOYan-Wei.ChineseJ.AnhuiAgriculturalScienceBulletin，2008，13:130－131高艷衛(wèi).安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，13:130－131FukutoTR.J.EnvironmentalHealthPerspectives，1990，87:245KachamR，KaranthS，BaireddyP，LiuJ，PopeC.J.ToxicologyandAppliedPharmacology，2006，210:142－149YINGXing-Hua，ZUXia，HUMin-Jun，ZHUZhi-Wei，M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