選修31DNA重組技術的基本工具

基因工程專題1煙草據(jù)WTO調(diào)查：2004年全世界因狂犬病致死人數(shù)約5.5萬人中國衛(wèi)生部通報：2004年７月，狂犬病列法定報告?zhèn)魅静∷劳鰯?shù)之首。發(fā)病死亡率近100%能產(chǎn)生狂犬病抗體蛋白的轉基因每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。1979年，美國將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實現(xiàn)了細菌消費胰島素，大大降低了消費本錢。治療糖尿病特效藥——據(jù)WTO調(diào)查：2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國約6000萬。胰島素思索：轉基因技術實現(xiàn)了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達。這些性狀的表達與我們學過的基因的什么過程有關？密碼子在生物界是的！DNA(基因)mRNA蛋白質(性狀)轉錄翻譯通用定向基因改造想象想象一能否讓禾本科的植物也可以固定空氣中的氮？能否讓細菌“吐出〞蠶絲？想象二能否讓微生物產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？想象三基因工程的產(chǎn)物什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重組技術。是指按照人們的愿望，在DNA分子程度上進展嚴厲的設計，并經(jīng)過體外DNA重組和轉基因技術，賦予生物以新的遺傳特性，從而發(fā)明出更符合人們需求的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ痰母拍罨蚬こ痰母拍罨蚬こ痰膭e名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結果原理DNA重組技術生物體外基因DNA分子程度人類需求的新生物類型和產(chǎn)品剪切→拼接→導入→表達基因重組根底實際和技術開展催生了基因工程科技探求之路早期根底實際達爾文提出生物進化論根底實際和技術開展催生了基因工程科技探求之路早期根底實際孟德爾提出基因的分別定律和自在組合定律根底實際和技術開展催生了基因工程科技探求之路早期根底實際摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律。根底實際和技術開展催生了基因工程科技探求之路后期根底實際艾弗里證明DNA是遺傳物質，DNA可從一種生物個體轉移到另一種生物個體。根底實際和技術開展催生了基因工程科技探求之路后期根底實際沃森、克里克提出DNA的雙螺旋構造模型。根底實際和技術開展催生了基因工程科技探求之路后期根底實際梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保管復制根底實際和技術開展催生了基因工程科技探求之路后期根底實際克里克等提出中心法那么DNARNA蛋白質轉錄翻譯逆轉錄復制根底實際和技術開展催生了基因工程科技探求之路后期根底實際1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實驗加以證明。根底實際和技術開展催生了基因工程科技探求之路1)基因轉移載體的發(fā)現(xiàn)2)工具酶的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測序技術的發(fā)明4)DNA體外重組的實現(xiàn)5)重組DNA表達實驗的勝利6)第一例轉基因動物問世7)PCR技術的發(fā)明問題討論：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細菌的毒蛋白基因在棉花細胞中表達，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

想一想需求做哪些關鍵任務？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：在以上過程中關鍵步驟或難點是什么？普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因經(jīng)過運載體導入轉基因棉花含抗蟲基因轉基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體轉基因棉花有抗蟲特性一、DNA重組技術的根本工具培育轉基因抗蟲棉的關鍵步驟：1.ONE抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌提取出來2.TWO抗蟲基因與運載體DNA銜接3.THREE抗蟲基因導入受體(棉花)細胞基因的“剪刀〞基因的“針線〞基因的運載體一、“分子手術刀〞二、“分子縫合針〞三、“分子運輸車〞Goon轉基因思索：⒈自然界能否存在一種生物的DNA進入另終身物的情況？⒉動物容易讓外來DNA侵入本身而得以遺傳嗎？為什么？植物呢？⒊單細胞生物，容易遭到入侵嗎？⒋單細胞生物并沒有在進化中滅絕，而是產(chǎn)生了一些特殊的酶來防備。這些酶應該有什么特點？能夠酶能識別外來侵入的DNA并將其分解，而對本身的DNA不能起作用。“分子手術刀〞——限制性核酸內(nèi)切酶〔一〕限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術刀〞⒈主要來源：⒉種類與命名：⒊作用特點：⒋作用結果：原核生物閱讀“分子的手術刀〞1min〔一〕限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術刀〞⒈主要來源：⒉種類與命名：⒊作用特點：4.限制酶識別序列5.作用結果：識別特定核苷酸序列原核生物產(chǎn)生黏性末端或平末端,切斷磷酸二酯鍵具有特異性。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成少數(shù)的識別序列由4、5或8個核苷酸組成⒉種類與命名：如今曾經(jīng)從約300種微生物中分別出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質沙雷氏桿菌〔Serratiamarcesens〕大腸桿菌〔EscherichiacoliR〕Goback練習：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分別到3種限制酶，那么分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ屬名種名菌株(品系)大腸桿菌R型菌株分別出的第一個限制酶EscherichiacoliREcoRⅠ種名前兩字母(小寫、斜體)菌株(品系)羅馬數(shù)字區(qū)分同一菌株分別出的不同酶例：流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株系中第二種限制酶的命名：HindII粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescenssb)中第一種限制酶的命名：SmaⅠ限制酶的命名屬名首字母(大寫、斜體)GobackT磷酸二酯鍵1234512345A3.作用特點：切割部位：脫氧核糖和磷酸交替銜接而構成的DNA骨架Goback磷酸二酯鍵3.作用特點：4.限制酶的識別序列：限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線〔如圖〕，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向、對稱、反復陳列的。想一想限制酶所識別的序列有什么特點？Goback大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成少數(shù)的識別序列由4、5或8個核苷酸組成SmaⅠ平末端平末端5.作用結果

EcoRⅠ黏性末端黏性末端5.作用結果Goback

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback反復演示5.作用結果尋根問底他能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進化過程中構成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的損害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證本身的平安。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而到達維護本身的目的。CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG練習運用EcoRI剪切目的基因CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG目的基因黏性末端要想獲得某個特定性狀的基因必需求用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性(平)末端？要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性(平)末端。假設把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產(chǎn)生一樣的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思索?Goback……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混合將不同種來源的DNA片段銜接起來生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……酶切〔二〕“分子縫合針〞——DNA銜接酶①作用:把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸銜接起來.②作用原理：催化磷酸二酯鍵構成可把黏性末端之間的縫隙“縫合〞起來，E·coliDNA銜接酶或T4DNA銜接酶即恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵

T4DNA銜接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合〞起來，但效率較低T4DNA銜接酶DNA銜接酶的作用過程點擊播放③類型：類型E·coliDNA銜接酶T4DNA銜接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能銜接黏性末端能銜接黏性末端和平末端(效率較低)一樣點差別〔二〕“分子縫合針〞——DNA銜接酶DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點尋根問底DNA銜接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個核苷酸銜接到已有的核酸片段上，構成磷酸二酯鍵構成磷酸二酯鍵1)在兩個DNA片段之間構成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸經(jīng)過磷酸二酯鍵銜接成一條互補的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個缺口同時銜接起來，不需求模板Goon模擬制造：用剪刀在特定部位對棉花DNA進展模擬切割，并將模擬毒蛋白基因取出，再用膠紙模擬基因種間銜接。棉花的

一段DNA含毒蛋白基因的細菌DNA片段Goback〔三〕“分子運輸車〞——基因進入受體細胞的載體⒈載體需求的條件：⑴有1~多個限制酶切點⑵對受體細胞無害⑶導入基因能在受體細胞中復制、表達⑷有某些標志基因，便于挑選⒉常用運載體：⑴細菌的質粒⑵噬菌體或某些動植物病毒⑶假設目的基因導入受體細胞后不能復制或不能轉錄，轉基因生物能有料想的效果嗎？⑴作為分子運輸車——載體，假設沒有切割位點將會怎樣？⑵霍亂菌的質粒多個限制酶切點，他會用它來做分子運輸車嗎？⑷目的基因有沒有進入受體細胞，如何去發(fā)現(xiàn)？

議一議2、能否用SARS病毒作為基因載體？3、作為載體，假設沒有切割位點將怎樣？4、攜帶目的基因的載體能否進入了受體細胞，如何鑒定？5、假設目的基因導入受體細胞后不能復制，將怎樣？1、從化學組成來看，載體應含有什么成分？雙鏈DNA不能不能進展DNA的重組載體上應有標志基因能夠呵斥基因喪失常用的載體：質粒能復制并帶著插入的目的基因一同復制有切割位點有標志基因的存在，可用含氨芐青霉素的培育基鑒別Goon答：2和7能銜接構成…ACGT……TGCA…；4和8能銜接構成…GAATTC……CTTAAG…；3和6能銜接構成…GCGC……CGCG…；1和5能銜接構成…CTGCAG……GACGTC…。思索與探求P7思索與探求P71、為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？經(jīng)過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者經(jīng)過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，雖然細菌中含有某種限制酶也不會使本身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。2、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體運用的DNA分子很多都是質?！瞤lasmid〕，即獨立于細菌擬核染色體DNA之外的一種可以自我復制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。能否任何質粒都可以作為基因工程載體運用呢？不是，作為基因工程運用的載體必需滿足以下條件：思索與探求P71〕載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必需是在質粒本身需求的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2〕載體DNA必需具備自我復制的才干，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制。3〕載體DNA必需帶有標志基因，以便重組后進展重組子的挑選。4〕載體DNA必需是平安的，不會對受體細胞有害，或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去。5〕載體DNA分子大小應適宜，以便提取和在體外進展操作，太大就不便操作。實踐上自然存在的質粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進展人工改造后才干用于基因工程操作。3、DNA銜接酶有銜接單鏈DNA的身手嗎？迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA銜接酶都不具有銜接單鏈DNA的才干，至于緣由，如今還不清楚，也許未來會發(fā)現(xiàn)可以銜接單鏈DNA的酶。思索與探求P7知標志基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因，現(xiàn)討論某細菌的質粒中有無標志基因或標志基因是什么？請設計實驗、預期實驗結果，并得出相應的實驗結論。對照組：不添加抗生素實驗組1：添加一定濃度的四環(huán)素實驗組2：添加一定濃度的氨芐青霉素實驗組3：添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素練習對照組實驗組1實驗組2實驗組3結論預期一＋＋＋＋預期二＋＋－－預期三＋－＋－預期四＋－－－對照組：不添加抗生素實驗組1：添加一定濃度的四環(huán)素實驗組2：添加一定濃度的氨芐青霉素實驗組3：添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素既含有抗四環(huán)素基因也含有抗氨芐青霉素基因只含有抗四環(huán)素基因只含有抗氨芐青霉素基因既不含有抗四環(huán)素基因也不含有抗