高級技能訓(xùn)練：分離技術(shù)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一:雙水相萃取牛血清蛋白實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私怆p水相系統(tǒng)的成相原理和方法；了解制作雙水相系統(tǒng)相圖的方法，加深對相圖的認(rèn)識；掌握雙水相溶液配制與雙水相萃取的操作；掌握分配系數(shù)和萃取收率的計算方法。實(shí)驗(yàn)原理雙水相系統(tǒng)是由兩種互不相溶的聚合物（如聚乙二醇（PEG）與葡聚糖（DX））或者互不相溶的聚合物溶液和鹽溶液（如PEG與（NH）SO）組成。雙水相系統(tǒng)的424制備一般是將兩種溶質(zhì)分別配制成一定濃度的水溶液，然后將兩種溶液按照不同的比例混合，靜止一段時間，當(dāng)兩種溶質(zhì)的濃度超過某一濃度范圍時，就會產(chǎn)生兩相。相圖是研究雙水相萃取的基礎(chǔ)，雙水相形成條件和定量關(guān)系常用相圖來表示。圖1是典型的高聚物-高聚物雙水相體系的直角坐標(biāo)相圖，兩種聚合物A、B以適當(dāng)比例溶于水就會分別形成有不同組成的兩相，上相組成用T點(diǎn)表示，下相組成用B點(diǎn)表示，由圖1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B,下相主要含A。曲線TCB稱為結(jié)線，直線TMB稱為系線。結(jié)線上方是兩相區(qū)，下方為單相區(qū)，若配比取在曲線上，則混合后，溶液恰好從澄清變?yōu)榛鞚?。組成在系線上的點(diǎn)，分為兩相后，其上下相組成分別為T和B,T、B量的多少服從相圖的杠桿定律。即T和B相質(zhì)量之比等于系線上MB與MT的線段長度之比。又由于兩相密度相差很小，故上下相體積之比也近似等于系線上MB與MT線段長度之比。雙水相萃取與有機(jī)溶劑萃取原理相似,都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配原則。當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力（如憎水性、氫鍵、離子鍵等）的存在，使得待分離的物質(zhì)在上、下相中的濃度不同。對于某一物質(zhì)，只要選擇合適的雙水相體系，控制一定的條件就可以得到合適的分配系數(shù)，從而達(dá)到分離純化的目的。本實(shí)驗(yàn)選擇PEG-硫酸銨雙水相系統(tǒng)萃取牛血清蛋白。雙縮脲反應(yīng)是指蛋白質(zhì)在堿性溶液中與二價銅離子結(jié)合生成紫色絡(luò)合物的反應(yīng)。含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都具有雙縮脲反應(yīng)，蛋白質(zhì)含有多個肽鍵，因此有雙縮脲反應(yīng)，反應(yīng)生成物顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可以利用雙縮脲反應(yīng)進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量測定。三、試劑及儀器儀器：紫外可見分光光度計，電子天平，臺式高速離心機(jī)，電熱恒溫水浴箱，漩渦混合儀，滴定管，大試管，離心試管（20mL）6只,移液管（1mL,5mL）,試管（10mL）,注射器（10mL）試劑：PEG2000，硫酸銨，牛血清蛋白，雙縮脲試劑四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、 PEG2000-硫酸銨雙水相體系相圖的測定（1） 取50%的PEG2000溶液（w/v）10mL于大試管中；（2） 用40%的硫酸銨溶液（w/v）裝入滴定管中向大試管滴加，并不斷在漩渦混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直至試管內(nèi)液體出現(xiàn)渾濁為止，記錄硫酸銨消耗的體積。加入1mL水使溶液澄清，繼續(xù)用硫酸銨滴定至恰好混濁，重復(fù)7次，記錄每次硫酸銨消耗的體積，計算每次出現(xiàn)混濁時體系中PEG和硫酸銨的濃度（w/v），并填入表1中。（3） 以硫酸銨的濃度（w/v）為橫坐標(biāo)，PEG的濃度（w/v）為縱坐標(biāo)作圖，即得到PEG2000-硫酸銨的相圖。2、 利用PEG2000-硫酸銨雙水相體系分離牛血清蛋白（1） 利用雙水相體系分離牛血清蛋白根據(jù)相圖，選擇三個成相比例，分別加入3mL濃度為10mg/mL牛血清蛋白溶液。攪拌均勻，3500r/min離心5min，靜置分層，分別量取記錄上下相的體積。（2） 蛋白質(zhì)濃度的測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清蛋白(BSA)配制成10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取六支試管分別加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,l.OmL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，并用水補(bǔ)足到1mL，然后加入4mL雙縮脲試劑(ANaOH3.5mL,BCuSO40.5mL)，充分搖勻后在室溫下放置30min,在540nm波長下測定吸光度。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照樣。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測定：按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法，分別取上下相溶液1mL置于兩支試管中，分別加入4mL雙縮脲試劑測定吸光度。與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，計算出牛血清蛋白的含量和萃取收率。表1PEG2000-硫酸銨雙水相體系相圖的制作表編號累計加水量(mL)硫酸銨溶液讀數(shù)大試管中純硫酸銨的累計量(g)溶液的總體積(mL)PEG2000的濃度(w/v)硫酸銨的濃度(w/v)1021324354657687五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù),計算系統(tǒng)的相比,蛋白在不同雙水相系統(tǒng)中的分配系數(shù)及收率。計算公式如下：表觀分配系數(shù)K=Ct/Cb相比R=Vt/Vb收率p=下相蛋白含量/上下相蛋白總含量二Vt*ct/(Vt*Ct+Vb*Cb)二R*K/(1+R*K)式中Ct、Cb分別為上下相蛋白濃度；Vt、Vb分別為上下相體積。比較上下相蛋白總含量與加入的蛋白總量是否一致。六、討論1、 如何正確繪制相圖？如何根據(jù)相圖配制雙水相體系，并對混合物進(jìn)行分離？2、 實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)注意哪些問題？分析實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)二大孔樹脂吸附分離實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解大孔樹脂的使用方法；2、 掌握利用大孔樹脂的靜態(tài)和動態(tài)吸附分離操作；3、 掌握大孔樹脂的洗脫方法；4、學(xué)習(xí)吸附等溫曲線、吸附動力學(xué)曲線和洗脫曲線的測定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理大孔樹脂是一種具有大孔結(jié)構(gòu)的有機(jī)高分子共聚體，是一類人工合成的有機(jī)高聚物吸附劑。因其具多孔性結(jié)構(gòu)而具篩選性，又通過表面吸附、表面電性或形成氫鍵而具吸附性。一般為球形顆粒狀，粒度多為20-60目。大孔樹脂有非極性(HPD-100,HPD-300,D-101,X-5,H103)、弱極性(AB-8,DA-201,HPD-400)、極性(NKA-9,S-&HPD-500)之分。大孔吸附樹脂理化性質(zhì)穩(wěn)定，一般不溶于酸堿及有機(jī)溶媒，在水和有機(jī)溶劑中可以吸收溶劑而膨脹。大孔樹脂吸附技術(shù)以大孔吸附樹脂為吸附劑，利用其對不同成分的選擇性吸附和篩選作用，通過選用適宜的吸附和解吸條件借以分離、提純某一或某一類有機(jī)化合物的技術(shù)。吸附分離依據(jù)相似相容的原則，一般非極性樹脂宜于從極性溶劑中吸附非極性有機(jī)物質(zhì)，相反強(qiáng)極性樹脂宜于從非極性溶劑中吸附極性溶質(zhì)，而中等極性吸附樹脂，不但能從非水介質(zhì)中吸附極性物質(zhì)，也能從極性溶液中吸附非極性物質(zhì)。大孔吸附樹脂吸附技術(shù)廣泛應(yīng)用于制藥及天然植物中活性成分如皂甙、黃酮、內(nèi)脂、生物堿等大分子化合物的提取分離以及維生素和抗生素的提純、化學(xué)制品的脫色、醫(yī)院臨床化驗(yàn)和中草藥化學(xué)成分的研究等。它具有吸附快，解吸率高、吸附容量大、洗脫率高、樹脂再生簡便等優(yōu)點(diǎn)。大孔樹脂吸附分離操作步驟：（1）樹脂的預(yù)處理目的是為了保證制劑最后用藥安全。樹脂中含有殘留的未聚合單體，致孔劑，分散劑和防腐劑對人體有害。預(yù)處理的方法：乙醇浸泡24h-用乙醇洗至流出液與水1：5不渾濁一用水洗至無醇味一5%HCl通過樹脂柱，浸泡2-4h~水洗至中性一2%NaOH通過樹脂柱，浸泡2-4h~水洗至中性，備用。（2）上樣將樣品溶于少量水中，以一定的流速加到柱的上端進(jìn)行吸附。上樣液以澄清為好，上樣前要配合一定的處理工作，如上樣液的預(yù)先沉淀、濾過處理，pH調(diào)節(jié)，使部分雜質(zhì)在處理過程中除去，以免堵塞樹脂床或在洗脫中混入成品。上樣方法主要有濕法和干法兩種。（3） 洗脫先用水清洗以除去樹脂表面或內(nèi)部還殘留的許多非極性或水溶性大的強(qiáng)極性雜質(zhì)（多糖或無機(jī)鹽），然后用所選洗脫劑在一定的溫度下以一定的流速進(jìn)行洗脫。（4） 再生再生的目的：除去洗脫后殘留的強(qiáng)吸附性雜質(zhì)，以免影響下一次使用過程中對于分離成分的吸附。再生的方法：95%乙醇洗脫至無色，再用2%鹽酸浸泡，用水洗至中性，再用2%NaOH浸泡，再用水洗至中性。注意：再生后樹脂可反復(fù)進(jìn)行使用，若停止不用時間過長，可用大于10%的NaCl溶液浸泡，以免細(xì)菌在樹脂中繁殖。一般純化某一品種的樹脂，當(dāng)其吸附量下降30%以上不宜再使用。三、 試劑及儀器儀器：紫外可見分光光度計，電子天平，恒溫水浴振蕩器，玻璃層析柱，恒流泵試劑：AB-8大孔樹脂，大豆異黃酮，無水乙醇，鹽酸，氫氧化鈉四、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、樹脂的預(yù)處理用95%乙醇浸泡AB-8樹脂24h后用去離子水洗至中性。然后用5%HC1溶液浸泡3h，用去離子水以洗至中性；再以5％NaOH溶液浸泡3h，水洗至中性后備用。2、 大豆異黃酮的定量檢測方法將純品大豆異黃酮配制成100仇g/mL的溶液，分別取0.1mL,0.2mL,0.3mL,0.4mL,0.5mL.0.6mL,0.7mL,0.8mL的上述大豆異黃酮溶液，加水稀釋至5mL，采用紫外分光光度法，在261nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、 靜態(tài)吸附等溫線的測定準(zhǔn)確稱取濕樹脂10g置于三角燒瓶中，加入50mLl%的大豆異黃酮溶液，放置于恒溫水浴振蕩器，控制溫度30°C，吸附時間為lOmin,20min,30min,40min,50min,60min,90min,120min,150min時分別取1mL樣液測吸光度，然后以時間t為橫坐標(biāo)，C/CO為縱坐標(biāo)繪制吸附等溫線（C為不同時間取樣溶液的濃度，CO為初始樣液的濃度）。4、 動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)在玻璃層析柱中裝填10g濕樹脂，選C/C0=0.05所用的時間為穿透時間，樣液濃度10mg/mL，流速v=20d/min,以吸附時間為橫坐標(biāo)，C/CO為縱坐標(biāo)繪制穿透曲線。計算平衡吸附量。5、 動態(tài)洗脫實(shí)驗(yàn)對上述達(dá)到動態(tài)吸附平衡的樹脂柱