生物電子顯微技術(shù)課件

生物電子顯微技術(shù)

ELECTRONMICROSCOPYFORBIOLOGY引言顯微技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展電子顯微技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀電子顯微技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展趨勢關(guān)於電子顯微技術(shù)含義的探討如何學(xué)好這門課我的困惑：電子顯微鏡不僅不是萬能的，而且功能十分有限。如何面對新設(shè)備的發(fā)明給生物學(xué)研究帶來的新契機(jī)？我們的課程應(yīng)如何改革？生物電子顯微技術(shù)課程問卷調(diào)查表姓名：本人照片專業(yè)：現(xiàn)任職務(wù)：學(xué)號：聯(lián)繫方式：電話Email你為什麼要選修本課程你對本課程授課內(nèi)容的建議第一階段：16-17世紀(jì)

引言顯微技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展早在17世紀(jì)，人類首次通過玻璃透鏡觀察到了水中的微生物。單式顯微鏡的應(yīng)用使某些科學(xué)家和工匠在觀察微觀世界方面成為先驅(qū)。人類對於微觀世界的觀察提高到了微米的尺度，動(dòng)、植物解剖學(xué)也由此產(chǎn)生。Leeuwenhoek(荷蘭，1632-1723)觀察並記錄了多種植物、微生物和動(dòng)物細(xì)胞。1665年，R.Hooke用自製的顯微鏡觀察軟木（木栓質(zhì)），發(fā)現(xiàn)其是由排列緊密的蜂窩狀小室構(gòu)成的，他把這些小室命名為“細(xì)胞”(cell)。到了19世紀(jì)，複式光學(xué)顯微鏡的應(yīng)用使醫(yī)學(xué)和生物學(xué)取得了很大進(jìn)步，但由於光波波長對解析度的限制，光學(xué)顯微鏡的放大倍數(shù)還不能滿足科學(xué)家探索微觀世界的需要。為了克服這些限制，19世紀(jì)—20世紀(jì)初，對複式光學(xué)顯微鏡進(jìn)行了一系列改進(jìn)，發(fā)展出螢光顯微鏡、暗視野顯微鏡、干涉相差顯微鏡、偏振光顯微鏡、紫外光顯微鏡、X-射線顯微鏡等，但是……單式顯微鏡第二階段：18-19世紀(jì)體視顯微鏡載物臺(tái)物鏡目鏡物鏡調(diào)節(jié)器焦距調(diào)節(jié)器光源焦距調(diào)節(jié)器聚光鏡複式顯微鏡落射式螢光顯微鏡（正置）倒置螢光顯微鏡第二階段：18-19世紀(jì)

引言顯微鏡要應(yīng)用於生物學(xué)研究，僅有好的設(shè)備還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，必須發(fā)展一系列與之相應(yīng)的固定技術(shù)、製片技術(shù)、染色技術(shù)等。18-19世紀(jì)，以石蠟切片為代表的製片技術(shù)日臻成熟，可以將不同生物的組織切成3-50微米厚的切片已清楚地觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。如果要使製片的以永久保存，還必須將材料固定以殺死組織，醇類、醛類、有機(jī)酸等多種固定劑被廣泛應(yīng)用。為了使材料更容易觀察，許多生物染料也被廣泛應(yīng)用，可以將材料染色成各種顏色。冰凍切片、冰凍取代等多種低溫處理技術(shù)的應(yīng)用較好地解決了對生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)標(biāo)記觀察問題。但是仍然不能實(shí)現(xiàn)永久的活體觀察。螢光顯微鏡的產(chǎn)生是顯微技術(shù)發(fā)展的重要事件。螢光顯微技術(shù)的發(fā)展使顯微觀察產(chǎn)生了革命性變化。由於螢光染料靈敏、低毒，超活染色成為可能。免疫學(xué)、放射性示蹤、分子標(biāo)記等可與之相結(jié)合。近期又發(fā)展出多種鐳射共聚焦顯微技術(shù)(LaserScanningConfocalMicroscopy,LSCM)，使我們在較高解析度下即時(shí)觀察生物活體成為可能。全內(nèi)反射螢光顯微鏡(TIRFM)圖像：可以清楚地觀察單分子、細(xì)胞膜等。全內(nèi)反射螢光顯微鏡(TIRFM)圖像：可以進(jìn)行連續(xù)的動(dòng)態(tài)分析螢光顯微鏡和顯微技術(shù)的發(fā)展是目前最為有用，並且具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ脑O(shè)備和技術(shù)方法。利用相差-干涉顯微鏡(PCM/DICM)能夠提高不經(jīng)染色材料的反差，還能增加材料的立體感，經(jīng)過適當(dāng)?shù)谋４嫣幚砜梢杂渺杜臄z活體錄影。酵母菌落明場相差微分干涉第三階段：20世紀(jì)

引言1931年，德國人盧斯卡(E.Ruska)和諾爾(M.Knoll)根據(jù)磁場可以會(huì)聚電子束這一原理發(fā)明了世界上第一臺(tái)（透射）電子顯微鏡。1939年，SIMENS公司生產(chǎn)了第一臺(tái)透射電子顯微鏡（TransmissionElectronMicroscope,TEM）樣機(jī)，但由於二戰(zhàn)，45年以後透射電子顯微鏡才真正廣泛用於科研，進(jìn)入50年代後才廣泛用於生物學(xué)研究。透射電子顯微鏡的原理同光學(xué)顯微鏡相同:用電子束而非可見光作為光源，電子的行為與光波相似，但是其波長比光波的波長小幾百倍，這就使電子顯微鏡的解析度大大提高；用一組磁偏轉(zhuǎn)線圈作為“透鏡”，在透射電子顯微鏡中，磁場的作用類似於光學(xué)顯微鏡中的透鏡?，F(xiàn)在的透射電子顯微鏡放大倍數(shù)可達(dá)50萬倍。1965年，第一臺(tái)商用掃描電子顯微鏡(ScanningElectronMicroscope,SEM)問世。它主要是用來研究固態(tài)物體的表面形貌，它可以得到固體表面的三維效果圖像。放大倍數(shù)可達(dá)15萬倍。透射電子顯微鏡(TEM)TransmissionElectronMicroscope掃描電子顯微鏡(SEM)ScanningElectronMicroscope第三階段：20世紀(jì)

引言1958年，我國成功地研製了第一臺(tái)電子顯微鏡。80年代改革開放後，利用世界銀行貸款等專案資助，各種型號的電子顯微鏡被大量購置引進(jìn)，很多現(xiàn)仍在使用。50年代以來，隨著醛類-鋨酸固定劑、超薄切片技術(shù)、重金屬染色劑、臨界點(diǎn)乾燥技術(shù)等一系列材料處理技術(shù)的日臻完善，TEM和SEM在生物學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。將常規(guī)的超微形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)觀察事業(yè)提高到了納米尺度。低溫冷凍斷裂、冰凍蝕刻等技術(shù)的發(fā)展使超微形態(tài)、結(jié)構(gòu)觀察擺脫了固定帶來的假像困擾。高壓電子顯微鏡的應(yīng)用大大提高了解析度。數(shù)碼技術(shù)的應(yīng)用更大大擴(kuò)展了電子顯微鏡的功能。環(huán)境掃描電子顯微鏡(EnvironmentalScanningElectronMicroscope

)初步克服了鏡筒真空環(huán)境對材料處理和觀察的限制。多種染料偶聯(lián)技術(shù)的發(fā)展使超微細(xì)胞化學(xué)染色成為可能。但是，時(shí)至今日，我們?nèi)匀粺o法在電子顯微鏡下看到動(dòng)態(tài)的彩色圖像。第四階段：20世紀(jì)後期

引言1982年，IBM蘇黎世公司的工程師賓尼格(G.Binning)和羅勒(H.Rohrer)發(fā)明了掃描隧道顯微鏡(ScanningTunnelingMicroscope,STM)

。1988年中國科學(xué)院白春禮和姚俊恩研製出了我國的第一臺(tái)掃描隧道顯微鏡。掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope,SPM）是一種研究物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的全新技術(shù)，其放大倍數(shù)可達(dá)上億倍，解析度可以達(dá)到埃級。它採用尖端只有一個(gè)原子的特殊探針對物質(zhì)表面進(jìn)行逐行掃描來獲得原子尺度的圖像，它也可以用探針對單個(gè)原子和分子進(jìn)行操縱，對材料表面進(jìn)行微加工。

引言AFMimagingofsingletranslocatingcomplexesReferences:R.Seidel,etal.Real-TimeObservationofDNATranslocationbytheTypeIRestriction-ModificationEnzymeEcoR124I.NatureStruct.Mol.Biol.11(9),838(2004)DNA的AFM圖象及軟體後處理

AFM(AtomicForceMicroscopy)在生物材料研究中的應(yīng)用AFM(AtomicForceMicroscopy)在生物材料研究中的應(yīng)用themechanicsofcellmigrationandcelldivisionTime-courseoftheactivationofahumanplateletonglassimagedwiththeAFM.ImagesA-Hshowacompletesequenceoftheactivationonglass.Imagesintheupperrowshowthesmallcorrugationsonthecellsurface,imagesbelowshowthelargecorrugations(height).ThissequenceillustratesnicelythattheAFMcanprobenon-invasivelybiologicalprocesses,inthiscaseonthecellularlevel.(From:Biophys.J.(1994)66(5)1328-1334

)Fixedcell–AFMwithDIC.Heightimage.Deflectionimage

HeightimageIntactRedBloodCellImagedwiththeExplorerLifeSciencesAFM.ErythrocytestructureafterincubationwithchitooligosaccharidesAFM(AtomicForceMicroscopy)在生物材料研究中的應(yīng)用TheMFP-3D-CF?byAsylumResearch

IntegratedConfocal/AtomicForceMicroscopySystemTheMFP-3D-CFintegratedwiththeOlympusFluoView?laserscanningconfocal.MFP-3D-CFFigure1:MixedpollengrainsimagedwithOlympusFluoView1000andMFP-3D-CF.Left:Confocalfluorescence(red,green)withtransmittedlight(grayscale).ShadowoftheAFMcantileverisatmiddleleft.Right:96μmAFMscan(amplitudechannel).Duetotheheightofthepollengrains,onlythetopsurfacesofthetallestgrainsareinrange.Figure2:LivingcellsimagedwithNikonC1andMFP-3D-CF.

A:Confocalfluorescence(red,green)andtransmittedlight(grayscale),133μmscan,orthogonalview.B&C:AmplitudeAFMimages,90μmscan,takenfromafive-hoursequence.Thereisa2:09hourtimelapsebetweenimageBandC.ImagescourtesyofM.BanaszakHollandB.Orr,U.Michigan.Bone-marrow-derivedmastcellswereallowedtospreadonapolylysine-coatedcoverslipconfocalimageAFMtopography3DimageMovieAFM(AtomicForceMicroscopy)在生物材料研究中的應(yīng)用AFMSurface3DPROvs.StandardvisualizationtechniqueAFMcellstandard2DheightimageAFMcellstandardpseudo3DheightimageAFMcellrenderedwithScienceGLsoftwareasphotorealistic3DheightimageAFMcellourrealistic3Dheightimage.AFM(AtomicForceMicroscopy)

在生物材料研究中的應(yīng)用AFMamplitudeimageofthemuscleofcat'smiteOtodectescynotis.

Thecontrastcoversamplitudevariationinthe1-3nmrange.Sizeofthewholeimageequals4.6microns.NadejdaBorisovnaMatsko,InstitutfürangewandtePhysik,ETHZürich.

ThehighqualityDiatomediamondknivesarenotjustperfectforproducingultrathinandsemi-thinsections,butalsoforsurfacingsectioningofallkindsofbiologicalandindustrialspecimensforAFMinvestigation.InsteadofasectionasforTEM,thespecimensurfaceisinvestigatedusingAFM.ReferencesP.H.Vallotton,M.M.Denn,B.A.WoodandM.B.Salmeron:Comparisonofmedical-gradeultrahighmolecularweightpolyethylenemicrosctructurebyAFMandTEM.J.Biomater.Sci.PolymerEdn.,Vol6,No.7,pp.609-620,1994.N.MatskoandM.Müller:AFMofbiologicalmaterialembeddedinepoxiresin.JournalofStructuralBiology146,pp.334-343,2004.AFM(AtomicForceMicroscopy)在生物材料研究中的應(yīng)用第四階段：20世紀(jì)後期

引言納米科學(xué)與技術(shù)Nano-science&technology納米科學(xué)與技術(shù)Nano-science&technology表面刻有微型字母矽片經(jīng)過放大的微型納米字母香港中文大學(xué)教授郝少康(S.K.Hark)在掃描電子顯微鏡下觀看二氧化矽納米絲時(shí)，一幅金色向日葵的畫面呈現(xiàn)在他的眼前。與植物不同，它們的“肥料”是鎵和金催化劑，能讓它們長到長度只有幾微米，同時(shí)直徑保持在10納米左右。郝少康教授給這幅獲獎(jiǎng)作品著色，令它們與真實(shí)的向日葵看上去更加相似。覆蓋在多孔矽模具上的聚合體的掃描電子顯微鏡圖片納米機(jī)器人

《自然》雜誌2001年發(fā)表了日本科學(xué)家的論文稱，他們使用鐳射技術(shù)，用合成樹脂製成了迄今為止世界上最小的?！粋€(gè)大小相當(dāng)於紅血球的微雕牛，體長只有10微米，高7微米。在製造過程中，大阪大學(xué)的科學(xué)家使用兩股鐳射射線照射合成樹脂溶液，溶液中只有被兩股鐳射射線交叉照射到的那部分樹脂才凝固起來，形成雕塑件的“部件”，這樣的部件的精度為120納米。科學(xué)家不是突發(fā)美學(xué)興趣或?yàn)榱藴p輕研究工作的繁重才“改行”做雕塑的，他們這樣做是為今後使用納米技術(shù)製造能在血管中移動(dòng)的“納米機(jī)器”做準(zhǔn)備。一名參與這個(gè)研究的華裔科學(xué)家孫洪波頗有詩情地說：“我們希望，這個(gè)牛能拉著裝有藥物的車，在血管中運(yùn)動(dòng)”。那麼，為什麼要雕塑出一個(gè)牛呢？這是因?yàn)榕Ｓ泻芗獾募饨?，周身既有平滑部分，又有彎度很大的部分，對製作技術(shù)提出了挑戰(zhàn)，能完美造出“納米牛”，也就能造出各樣的納米機(jī)器。其實(shí)，與此同時(shí)，大阪的科學(xué)家用同樣的方法已經(jīng)造出了一個(gè)“納米彈簧”，自然該彈簧也是迄今為止人類製造的最小的彈簧，它能在鐳射作用下像普通的金屬彈簧一樣振動(dòng)，科學(xué)家希望，這樣的彈簧能成為將來納米機(jī)器的部件。納米牛

引言20世紀(jì)電子顯微技術(shù)的興起，為人類獲得新型材料以及促進(jìn)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展創(chuàng)造了條件，應(yīng)用廣泛的納米材料就是在電子顯微技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，肝炎病毒也是通過電子顯微鏡觀察到的，它為21世紀(jì)科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。1986年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)授予了電子顯微鏡的發(fā)明者盧斯卡和掃描隧道顯微鏡的發(fā)明者賓尼格和羅勒，他們的發(fā)明使科學(xué)家有了一雙能看見原子的眼睛，為人類探索微觀世界做出了巨大貢獻(xiàn)。

20世紀(jì)重大發(fā)明之一。電子顯微技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

引言現(xiàn)在，隨著電腦技術(shù)的發(fā)展，電子顯微鏡技術(shù)和功能也日益進(jìn)步，放大倍數(shù)已超過1000多萬倍，並在材料、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。電子顯微鏡可以獲得許多引人入勝的顯微圖像，其逼真度和立體感令許多外行著迷。利用連續(xù)超微切片技術(shù)與數(shù)碼技術(shù)相結(jié)合，已經(jīng)可以方便地完成對於超微結(jié)構(gòu)的三維重構(gòu)。並且可以添加假色彩。利用掃描探針顯微鏡(SPM)可以實(shí)現(xiàn)對於原子和分子的加工操作，並能在常壓、液體環(huán)境下進(jìn)行觀察，為生物學(xué)研究提供了廣闊的發(fā)展空間。整體(無損傷)掃描成像技術(shù)的發(fā)展勢頭強(qiáng)勁，CT、核磁共振、PET、γ-刀等已經(jīng)成為電子顯微結(jié)構(gòu)觀察和操作的新軍。X-射線微區(qū)分析等與電子顯微鏡偶聯(lián)的分析儀器，使超微觀察提升到定量水準(zhǔn)。環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM)

引言解析度太高並不一定是優(yōu)點(diǎn)：生物學(xué)研究所需的解析度在1—100nm已經(jīng)能夠滿足要求，?這一級的解析度只適用於材料物理學(xué)和化學(xué)等研究。解析度越大，圖像定位和釋義越困難，因此超微形態(tài)和結(jié)構(gòu)研究永遠(yuǎn)離不開顯微形態(tài)和結(jié)構(gòu)研究基礎(chǔ)。如何擴(kuò)大資訊量：圖像的放大倍數(shù)越大，能反應(yīng)的局部資訊量就越小，因此，在準(zhǔn)確定位的前提下如何擴(kuò)大資訊量是所有生物學(xué)研究者面臨的共同問題。超微形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能研究成本如此昂貴，沒有充足的經(jīng)費(fèi)保障和豐富的基礎(chǔ)研究經(jīng)驗(yàn)往往會(huì)得出片面的結(jié)論。尚難以進(jìn)行結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)觀察：利用原子力顯微鏡(AFM)原則上可以實(shí)現(xiàn)對於生物活體材料的形態(tài)觀察，但實(shí)際操作則比較困難，而且在低解析度下圖像的品質(zhì)很差。X-射線斷層掃描、核磁共振等掃描成像方式的解析度很低，高精度的結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)觀察幾乎無法進(jìn)行。電子顯微技術(shù)用於生物學(xué)研究所面臨的主要問題

引言電子顯微技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展趨勢電子顯微鏡是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、農(nóng)林和材料科學(xué)等領(lǐng)域進(jìn)行科學(xué)研究的重要工具，電子顯微鏡技術(shù)已成為上述各領(lǐng)域研究工作者應(yīng)掌握的一項(xiàng)基本技能。通過電子顯微鏡，人們可以觀察到氣味分子進(jìn)入蝴蝶觸鬚的途徑。材料科學(xué)家利用電子顯微鏡可以從原子尺度研究得到材料的微觀結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分的資訊。生理學(xué)家可以通過電子顯微鏡對神經(jīng)組織進(jìn)行研究，還可以動(dòng)態(tài)觀察病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程。用顯微鏡檢查電腦晶片製造過程中的焊接裂縫會(huì)十分清楚。……1998年，北京大學(xué)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)在1μ2金板上刻寫李白的唐詩；2002年，日本科學(xué)家用SPM刻出了1μ3大小的矽質(zhì)牛?！瓝?jù)稱，日本科學(xué)家已經(jīng)將AFM集成到了一只蟎蟲的背上，晶片實(shí)驗(yàn)室（Labonchip）也已經(jīng)不再是設(shè)想。生物感測器是否在不久的將來也可以用於成像技術(shù)？？……趨勢：傳統(tǒng)的以電子顯微鏡為中心的電子顯微技術(shù)已經(jīng)不再是一門單純的成像技術(shù)，已經(jīng)與分析技術(shù)、操縱技術(shù)等密切聯(lián)繫在一起。SPM、新型螢光顯微鏡、斷層掃描等的出現(xiàn)更加促成了這種結(jié)合。雖然這些技術(shù)有些還剛剛開始用於生物科學(xué)研究，技術(shù)方法尚未形成成熟的體系，但是這些重要工具給我們今後的研究帶來的機(jī)遇絕對不應(yīng)忽視，因此電子顯微鏡技術(shù)的概念應(yīng)該有所擴(kuò)展。新一輪技術(shù)綜合已見端倪。細(xì)胞操控系統(tǒng)、生物光子學(xué)(biophotonics)等新名詞地提出就反映了這種綜合。

光學(xué)

生物科學(xué)

光-生物相互作用—光生物學(xué)

photobiology光與細(xì)胞相互作用光與組織相互作用生物高聚物光過程活體光激發(fā)活體光譜分析光學(xué)活體檢測單分子探測

生物光子學(xué)生物成像生物感測器微陣列技術(shù)流式細(xì)胞分析光活化治療鐳射輔助組織工程鐳射鑷和光剪納米生物光子學(xué)光子學(xué)生物材料

引言新型螢光顯微鏡：DSU轉(zhuǎn)盤式共聚焦+IX81電動(dòng)螢光顯微鏡

OLYMPUS

FV1000鐳射共聚焦顯微鏡

MVX10宏觀螢光變倍顯微鏡OLYMPUSIX2全內(nèi)反射螢光顯微鏡

引言電子顯微技術(shù)的含義？概念：顯微技術(shù)(Microscopy)—在顯微和超微水準(zhǔn)上研究生物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及相關(guān)生理功能和生命活動(dòng)現(xiàn)象的材料製備、察和分析的技術(shù)與方法。何謂電子顯微技術(shù)(ElectronMicroscopy)?

引言電子顯微鏡與相關(guān)技術(shù)：樣品製備技術(shù)染色技術(shù)分析技術(shù)SPM超微操作技術(shù)各種螢光顯微技術(shù)：細(xì)胞組織化學(xué)、共聚焦螢光(共軛、雙光子、多光子、全內(nèi)反射、轉(zhuǎn)盤式鐳射共聚焦)等鐳射顯微操作技術(shù)：鐳射輔助組織工程、鐳射鑷和光鉗等斷層掃描技術(shù)：CT、ECT、PET核磁共振等其他分析技術(shù)：顯微傅裏葉變換紅外光譜分析、顯微分光光度分析、流式細(xì)胞儀等生物感測器微陣列技術(shù)成像技術(shù)操作技術(shù)分析技術(shù)何謂電子顯微技術(shù)？流式細(xì)胞技術(shù)

引言課後作業(yè)A1.上網(wǎng)搜索或查閱其他資料，列出你認(rèn)為能用於生物形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能觀察研究的所有方法。2.列表簡要說明這些方法的應(yīng)用實(shí)例。3.你認(rèn)為哪些設(shè)備、技術(shù)和方法比較有用？或者哪些是你比較感興趣的？4.記錄並向老師和同學(xué)推薦你認(rèn)為比較好的參考書或網(wǎng)站。

引言如何學(xué)好這門課？理論與實(shí)驗(yàn)密切結(jié)合，根據(jù)研究問題設(shè)定目標(biāo)。理論為應(yīng)用服務(wù)。掌握規(guī)律，自如地設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)體系。周次授課內(nèi)容備註1引言顯微技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展2引言電子顯微技術(shù)的現(xiàn)狀、含義等3材料製備技術(shù)超薄切片技術(shù)參觀4掃描電子顯微樣品製備技術(shù)，冷凍蝕刻（斷裂）技術(shù)5電子顯微染色技術(shù)6電子顯微染色技術(shù)7生物大分子樣品製備，SPM樣品製備，其他8觀察與分析技術(shù)掃描電子顯微鏡，透射電子顯微鏡9透射電子顯微鏡，X-射線微區(qū)分析等參觀10SPM，螢光顯微技術(shù)11螢光顯微技術(shù)，鐳射共聚焦技術(shù)參觀12鐳射共聚焦技術(shù)，顯微光譜分析13斷層掃描技術(shù)，顯微操作技術(shù)14實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與創(chuàng)新15實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與創(chuàng)新16總結(jié)與考試17總結(jié)與考試課堂講授。參觀儀器操作。查閱資料，分析瞭解研究應(yīng)用實(shí)例和實(shí)驗(yàn)體系設(shè)計(jì)。主要參考書目：1.陳力編著,生物電子顯微術(shù)教程.北京師範(fàn)大學(xué)出版社,1998.16開本,定價(jià)16元。2.PrasadP.N.,何賽靈譯,生物光子學(xué)導(dǎo)論.浙江大學(xué)出版社,2006.大32開本,定價(jià)59元。3.付洪蘭編著,實(shí)用電子顯微鏡技術(shù).高教出版社,2004.定價(jià)20元。4.張景強(qiáng)等編,生物電子顯微術(shù).中山大學(xué)出版社,1986。5.林鈞安等編著,實(shí)用生物電子顯微術(shù).遼寧科技出版社,1989。6.黃蘭友等編著,電子顯微鏡與電子光學(xué).科學(xué)技術(shù)出版社,1991。7.程時(shí)編著,生物醫(yī)學(xué)電子顯微技術(shù).北醫(yī),協(xié)和醫(yī)科大,1991。8.MeekG.A.編著,生物學(xué)工作者實(shí)用生物電子顯微術(shù).(英),1976。9.GanhanW.,IntroductionofCytohistochemistryofPlant,1972。10.唐孝威等編著,分子影像與單分子檢測技術(shù).化工出版社,2004。11NunezR.(瑞士),劉秉慈等譯,流式細(xì)胞術(shù)原理與科研應(yīng)用簡明手冊.化工出版社,2005。12.電子顯微技術(shù)學(xué)報(bào)(雜誌)?13.ExperimentalUltrastructure(雜誌)?14.StainTechnology(雜誌)15.Protoplasma(雜誌)材料製備技術(shù)超薄切片技術(shù)用於電子顯微鏡觀察的染色技術(shù)超高壓電子顯微鏡樣品製備技術(shù)掃描電子顯微鏡樣品製備技術(shù)冷凍制樣技術(shù)生物大分子樣品製備SPM樣品製備

材料製備技術(shù)超薄切片技術(shù)(TheTechniquesofUltrathinSection)透射電子顯微鏡(TEM)TransmissionElectronMicroscope超薄切片(薄切片ultrathinsection)是指厚度小於100nm(一般在20-80nm)的切片。超薄切片可用於TEM觀察，進(jìn)行一般超微結(jié)構(gòu)、電鏡細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡、電鏡放射自顯影、x-射線微區(qū)元素分析等觀察。薄切片(半薄切片thinsection)厚度0.5-3μm。厚切片(section)厚度5-25μm。

材料製備技術(shù)普通超薄切片普通超薄切片技術(shù)是指不需要特殊冷凍條件的常規(guī)包埋—切片技術(shù)。其主要操作流程見右圖蘭框部分。材料一般需要固定。以環(huán)氧樹脂（塑膠）或GMA（有機(jī)玻璃）等包埋硬化後切片，經(jīng)常規(guī)的電子染色後觀察。用於常規(guī)材料的一般超微結(jié)構(gòu)、電鏡細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡、電鏡放射自顯影、x-射線微區(qū)元素分析等觀察。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)製作超薄切片的主要技術(shù)路線材料培育取材固定保存製片整體染色脫水透明包埋切片染色觀察記錄/拍攝/測量/測定/統(tǒng)計(jì)分析活體觀察孵育(染色)特殊染色劑設(shè)計(jì)與製備免疫耦連放射耦連螢光耦連其他標(biāo)記

材料製備技術(shù)普通超薄切片普通超薄切片的材料製備是由石蠟切片技術(shù)衍發(fā)而來，其主要技術(shù)原理和步驟都與石蠟切片的製作過程相似，只是對固定、包埋和染色藥品、載片工具、切片機(jī)、刀具等進(jìn)行了改進(jìn)，使之達(dá)到固定相更加精細(xì)，包埋劑硬度更高、透明度更好等要求，以利於進(jìn)行切片和觀察。材料的製備是用電子顯微鏡進(jìn)行研究的基礎(chǔ)工作。其工作品質(zhì)直接影響觀察和分析研究效果，步步操作都需要仔細(xì)認(rèn)真。普通超薄切片操作的重要注意事項(xiàng)：選擇合適的固定劑、固定條件和固定方法，儘量使固定相保持材料的生理狀態(tài)圖像，避免造成贗像。做好基礎(chǔ)顯微觀察，適當(dāng)選擇材料，準(zhǔn)確定位。正確選擇刀具，避免劃痕等損傷。避免染色過程中的污染。

材料製備技術(shù)普通超薄切片取材和固定材料方法要求植物組織選好所用組織，用潔淨(jìng)的解剖刀、雙面刀片等切取組織塊。必要時(shí)先進(jìn)行顯微解剖，切取後立即投入固定液中，必要時(shí)抽氣。1mm3大小縱橫切面要準(zhǔn)確動(dòng)物組織麻醉動(dòng)物後迅速解剖，選取和切取組織塊。同上低等生物單細(xì)胞生物和小型生物體要先經(jīng)離心收集，以適當(dāng)緩衝液沖洗，再離心收集—固定—離心收集—經(jīng)瓊脂包埋法凝聚後切塊。瓊脂塊切成1mm3大小防止收縮人工培養(yǎng)細(xì)胞同上同上取材的方法注意事項(xiàng)準(zhǔn)：準(zhǔn)確切取所用部位的橫切面和縱切面，為切片打好基礎(chǔ)?？欤喝〔牟僮饕杆?，儘快投入固定過程，以免材料變質(zhì)。輕：取材操作要輕切、輕壓、輕捏，刀片要鋒利而且清潔，減少損傷和污染。優(yōu)：選取優(yōu)質(zhì)材料，使用新鮮、優(yōu)質(zhì)的固定液和取材工具。

材料製備技術(shù)普通超薄切片取材和固定定位：從取材開始就做好材料的定位。將來要竊取哪個(gè)方向的切面，就將材料的這個(gè)方向留得長一些。留足材料邊緣。杜絕斜切面。對於難以滲透和染色的材料，取材要小，必要時(shí)預(yù)先進(jìn)行顯微解剖，選取關(guān)鍵部位。以被子植物莖尖縱切為例剝掉週邊葉片、葉原基準(zhǔn)確切取縱橫切面，留足邊緣，使縱向較長。材料將來在包埋塊中的放置位置切片方向緩衝液的選擇和配製：由於電子顯微圖像的解析度高，要求結(jié)構(gòu)保存得十分精細(xì)，稍有形變即刻被觀察到，因此在材料製備過程的前期一般均需使用緩衝液配製固定液、沖洗材料等，以維持pH在細(xì)胞的生理範(fàn)圍內(nèi)。必要時(shí)還需加入NaCl、蔗糖等調(diào)節(jié)溶液濃度以控制滲透壓。緩衝液pH一般在7.0—7.4之間。也可根據(jù)材料需求調(diào)到6.8以下或7.6以上。最常用的是磷酸鹽緩衝液（一般結(jié)構(gòu)觀察）和二甲胂酸鹽緩衝液（細(xì)胞化學(xué)觀察）。有時(shí)也使用醋酸巴比妥鈉緩衝液和三甲基吡啶緩衝液。緩衝液的配方往往是根據(jù)自己的具體要求而定。磷酸緩衝液等一般先配成A、B儲(chǔ)備液，臨用時(shí)混合。4℃冷藏保存。

材料製備技術(shù)普通超薄切片取材和固定固定過程—實(shí)際上包含了兩個(gè)不同步驟，一個(gè)是“殺生”(killing)，即把材料殺死；另一個(gè)是“固定”(fixation)，即使生命現(xiàn)象突然地永遠(yuǎn)停止，使細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)儘量保持在原來進(jìn)行正常生理活動(dòng)的狀態(tài)。良好的固定液必須具備下列條件：1.必須能迅速滲入植物組織的各個(gè)細(xì)胞中，將原生質(zhì)殺死，並固定起來。(關(guān)鍵在於“迅速”，快殺死才能使之盡可能地保持原來的狀態(tài)。)2.不能因造成原生質(zhì)過度的沉澱、變性、甚至自溶等等而破壞原有的結(jié)構(gòu)，儘量不造成結(jié)構(gòu)的假像。3.不能因固定引起原生質(zhì)體、細(xì)胞等劇烈收縮或膨脹，造成人為的變形，影響形態(tài)甚至破壞結(jié)構(gòu)。4.增加細(xì)胞對各種滲透壓變化的抵抗力，不至因固定以後的處理，而使原生質(zhì)變形。5.增加組織或細(xì)胞中內(nèi)含物的折光程度，使不同結(jié)構(gòu)觀察中更容易區(qū)別。6.增加植物組織對染料的著色能力，使之更易被染色。7.使組織適度硬化，以便於切片。

材料製備技術(shù)普通超薄切片取材和固定能夠很好保存超微結(jié)構(gòu)的主要固定劑戊二醛的固定機(jī)理主要是與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，不沉澱蛋白質(zhì)，而使之形成凝膠狀態(tài)，因此可以使細(xì)胞中大多數(shù)結(jié)構(gòu)（尤其是以蛋白質(zhì)為主的結(jié)構(gòu)）達(dá)到精細(xì)的固定狀態(tài)。由於戊二醛滲透速度較快，穿透力強(qiáng)；能夠很好地固定細(xì)胞基質(zhì)、核蛋白、糖蛋白、細(xì)胞骨架、膜蛋白系統(tǒng)等，因此是進(jìn)行一般超微結(jié)構(gòu)觀察時(shí)最為常用的固定劑，做前固定用。商品戊二醛為淺黃色液體，有甜香味，pH4.5-5.0。戊二醛應(yīng)在4℃避光保存，要儘量使用新鮮藥品。長期存放或保存不善時(shí)顏色會(huì)變深，當(dāng)酸度下降到pH3.5以下時(shí)，說明其大部分已經(jīng)變成了戊二酸，會(huì)引起比較嚴(yán)重的固定贗像，即不易再使用；有時(shí)新購買的戊二醛也會(huì)出現(xiàn)酸度過大的現(xiàn)象，即為劣質(zhì)產(chǎn)品，不可用於超微結(jié)構(gòu)研究。戊二醛固定液為單純固定液，使用濃度2-3%(1-5%)。一般以磷酸緩衝液配製。戊二醛是還原劑，不能與鋨酸等氧化劑混用，也不能用醋酸巴比妥緩衝液配製。最好在臨用前配製，用棕色瓶盛，

4℃冰箱中保存。固定時(shí)間幾分鐘-數(shù)周，根據(jù)材料和試驗(yàn)條件要求而定。固定溫度4℃-室溫。有很多報(bào)導(dǎo)顯示，4℃時(shí)不宜保存細(xì)胞骨架，固定12小時(shí)以上可能出現(xiàn)贗像。戊二醛分子式C5H8O2,分子量(W)100.12。滲透速率0.34K，滲透速度較快，穿透力強(qiáng)。甲醛

材料製備技術(shù)普通超薄切片取材和固定分子式CH2O,為無色有刺激氣味氣體，市售商品為福馬林（37%甲醛溶液）容易形成多聚甲醛(CH2On)沉澱，並含甲酸等雜質(zhì)，因而會(huì)影響固定品質(zhì)，超微結(jié)構(gòu)研究中不能使用。超微結(jié)構(gòu)研究中使用純淨(jìng)的多聚甲醛（白色固體）解聚配製，使用前新配，不宜久放。一般使用2-4%的濃度，配製方法是：儲(chǔ)備液A:40%甲醛水溶液。稱多聚甲醛20g,加入50mL重蒸餾水。（解聚：在通風(fēng)條件下，65℃，在充分?jǐn)嚢锠顟B(tài)下，加入幾滴濃NaOH使溶液變透明即可。）儲(chǔ)備液B:0.2mol/L緩衝液（磷酸鹽緩衝液或二甲胂酸鹽緩衝液)

工作液：取液A10mL，液B50mL，即重蒸餾水至100mL

必要時(shí)可加入葡萄糖或蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓，14%w/v。甲醛的滲透速度和穿透能力比戊二醛更強(qiáng)，也更容易被氧化，更不穩(wěn)定。能夠很好地保存樣品中的酶活性，因此常用作電鏡細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡和臨床速檢，做前固定用。固定時(shí)間在30分鐘-幾小時(shí)內(nèi)，固定溫度以4℃為佳。

材料製備技術(shù)普通超薄切片取材和固定四氧化鋨（鋨酸）osmicacid，OsO4，分子量(W)254.2。滲透速率0.2K。為淡黃色的結(jié)晶體，具有特殊臭味，結(jié)晶在41℃溶解，不易溶於水，在水中溶解度為7%，其水溶液為過鋨酸H3OsO3，氧化性強(qiáng)，易揮發(fā)。鋨酸是最好的酯類固定劑，能夠很好地固定膜結(jié)構(gòu)。但對於碳水化合物和核酸的固定能力不強(qiáng)。因此常與醛類固定劑作雙重固定，作後固定劑。固定是借助其氧化作用，與脂肪、蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)和化學(xué)反應(yīng)。還原後形成鋨黑OsO2

，使固定相變成黑色，並能增加電子反差，因此兼有染色作用。滲透速度較醛類慢，穿透力較弱。大於1mm3的材料往往固定不透。鋨酸為劇毒品，連續(xù)吸入其蒸氣0.5μg即可永久喪失嗅覺，對皮膚和粘膜都有刺激作用。配製時(shí)需格外小心，戴好口罩、防護(hù)眼鏡，在通風(fēng)處配製。廢液要密封後集中處置，不能亂倒。鋨酸是強(qiáng)氧化劑，極易被還原成鋨黑而失效。由於價(jià)格昂貴（0.5g/安瓿，1400元，只能配製50mL固定液），因此在配製過程中容器、器皿要絕對乾淨(jìng)；配好的溶液要用棕色瓶盛放，外面包上黑紙，封緊瓶口，放在冰箱中冷藏保存。如果小心配製、保存和使用，配好的溶液一般也只能保存半個(gè)月。溶液一旦變成黑褐色就不能再用了。鋨酸固定液的配製方法：1.將棕色磨口試劑瓶、一支比瓶子長而且較粗的玻璃棒、盛鋨酸的安瓿(0.5g或1g包裝，事先用砂輪在縊縮處劃割，注意不能割破)一起放入洗液中浸泡12小時(shí)。將電鍍鑷子用洗液洗刷乾淨(jìng)。將以上物品流水沖洗10分鐘-1小時(shí)，再用重蒸餾水浸泡1小時(shí)後，烘乾備用。2.將安瓿放入瓶中，用玻璃棒倒破安瓿（或蓋上瓶口後用力將安瓿晃破），立即加入潔淨(jìng)的緩衝液，配製成1%的鋨酸溶液。3.將試劑瓶用不透明黑紙包嚴(yán)，瓶口處以3層濾紙包裹，用皮筋紮緊，放在冰箱冷藏室上層保存。注意：鋨酸難以溶解，新配固定液一般需放置一天以上後才可使用。長期不用時(shí)也可以乾淨(jìng)塑膠試劑瓶配置，冷凍保藏。取材和固定

高錳酸鉀50年代鋨酸未廣泛用於電鏡材料處理之前，對於酯類的固定多採用高錳酸鉀為固定劑。高錳酸鉀雖然能較好地固定膜結(jié)構(gòu)，但是對蛋白質(zhì)的固定能力較差，超微結(jié)構(gòu)圖像只能顯示膜，中間灰度不豐富，缺乏層次感，以後便很少使用了。高錳酸鉀固定鋨酸固定高錳酸鉀固定鋨酸固定

材料製備技術(shù)普通超薄切片取材和固定材料方法植物組織切塊直接浸沒固定。必要時(shí)抽氣。動(dòng)物組織浸沒固定、灌流固定或原位固定。低等生物、人工培養(yǎng)細(xì)胞離心收集—固定—離心收集—瓊脂包埋法凝聚後切塊。一般結(jié)構(gòu)觀察雙重固定，（有時(shí)用到多重固定）細(xì)胞化學(xué)材料單固定固定的方法固定中常用的容器、器皿和工具：螺紋指管（針劑瓶）、刀片、鑷子等。離心機(jī)、冰箱、抽氣機(jī)（也可用注射器代替）。雙重固定的操作：取材—前固定—洗滌—後固定—洗滌—脫水----洗滌是必須過程：前固定後的洗滌目的是洗去還原性的前固定劑，以免減弱後固定劑的效力。後固定後的洗滌是為了防止後固定劑使脫水劑氧化變黑，從而影響固定效果。

材料製備技術(shù)普通超薄切片脫水和滲透脫水的目的—1.去除材料中的游離水。

2.使包埋劑容易滲透入材料。

3.使材料利於切片和觀察。脫水的方法—將脫水劑配成不同梯度濃度，逐級脫水。系列脫水劑用蒸餾水或重蒸餾水配置即可，不再需要用緩衝液。脫水劑—最常用的是乙醇(C2H5OH)和丙酮(C3H6O)。另外，甲醇、乙二醇、叔丁醇、聚乙二醇、環(huán)氧丙烷等也常使用（性質(zhì)見表）。名稱結(jié)構(gòu)式沸點(diǎn)℃比重溶解度甲醇CH3OH650.792極易溶乙醇CH3CH2OH78.30.789極易溶乙二醇HOCH2CH2OH1971.113極易溶叔丁醇(CH3)3COH830.789極易溶丙酮CH3COCH3560.792易溶環(huán)氧丙烷(氧化丙烯)CH3COCH易溶聚乙二醇H(OCH2CH2O)nH（低聚）易溶

材料製備技術(shù)普通超薄切片脫水和滲透滲透的目的—去除材料中的脫水劑。使包埋劑均勻滲透入材料。滲透的方法—將滲透劑與未聚合的包埋劑配成不同梯度濃度，逐級滲透，最後至純包埋劑。必要時(shí)先經(jīng)“過渡”—用滲透劑置換脫水劑。滲透劑—因包埋劑不同而不同。（見表）滲透劑包埋劑環(huán)氧丙烷環(huán)氧樹脂類、GMA二甲苯GMA聚乙二醇(GMA)GMA脫水—滲透流程後固定材料沖洗後30%脫水劑50%脫水劑70%脫水劑80%脫水劑90%脫水劑純脫水劑純脫水劑滲透劑過渡滲透劑：包埋劑=3：11：11：3純包埋劑流水沖洗5-10分鐘，蒸餾水浸泡5分鐘，除去鋨黑。10-20分鐘。4℃。10-20分鐘，或稍長。4℃。10-20分鐘，可過夜。4℃。10-20分鐘。室溫。10-20分鐘。室溫。儘量空幹材料。各10-40分鐘。室溫。要使用純淨(jìng)未吸潮的藥品。15-30分鐘。室溫。使用環(huán)氧丙烷時(shí)間不宜過長。各30-60分鐘。室溫。要使用充分混勻的混合液。處理時(shí)間可逐級加長。增加溫度、搖晃或攪拌(慢速)包埋劑中不必加催化劑。1-2小時(shí)以上。室溫。

材料製備技術(shù)普通超薄切片包埋和聚合所需物品：包埋容器包埋模具醫(yī)用膠囊和包埋架恒溫箱(40-70℃)、冰箱、紫外燈。磁力攪拌器、天平等。1ml注射器、燒杯等玻璃器皿。包埋的目的—用軟體材料充填在生物材料中，並使之經(jīng)特定處理而硬質(zhì)化，製成能夠用於進(jìn)行切片的包埋塊。包埋的方法—將未聚合的包埋劑完全引入浸潤材料後，以高溫或紫外光照射等條件處理，使之聚合硬化。包埋劑—用於電鏡切片的主要包括兩類：環(huán)氧樹脂類和有機(jī)玻璃類。包埋模具

材料製備技術(shù)包埋和聚合Epon812樹脂（環(huán)氧樹脂）

環(huán)氧樹脂是脂溶性包埋劑。淡黃色、粘度比較高，稍具特有臭味的液體，不溶於水和酒精，常用的有Epon812、ERL-4206或國產(chǎn)環(huán)氧樹脂618＃等單體，固化劑(有機(jī)酸酐,如基內(nèi)亞甲基四氧鄰苯二甲酸酐，簡稱MNA；和十二烷基琥珀酸酐，簡稱DDSA等)，以及聚合反應(yīng)加速劑(胺類，如2.3.4-二甲氨基甲基苯酚：簡稱DMP-30)將以上各藥品按一定比例混合，配成包埋劑。①配方：A液：B液：Epon81262mlEpon812100mlDDSA100mlMNA89ml②少量配方：因包埋劑久存會(huì)凝固變質(zhì)，一般應(yīng)少量配製，用量為：A液：B液：Epon81210mlEpon81216mlDDSA16mlMNA14mlA液混合液質(zhì)軟，B液混合液質(zhì)硬；根據(jù)A液與B液的混合比，A液比例越多硬度越低，B液比例越多硬度越高。根據(jù)室溫和樣品本身的硬度的需要按不同比例混合來調(diào)節(jié)硬度(表)。DMP-30的含量為混合液全量1.5-1.7%，用注射器準(zhǔn)確地滴入。A、B液混合加入DMP-30後必須攪拌均勻(15-20分鐘)，否則會(huì)影響切片品質(zhì)。A液、B液可在冰箱中存放約一周，注意防潮。加入DMP-30的混合液常溫下也很容易聚合，不能久存。DDSA和MNA都是有機(jī)酸酐，極易吸水變成相應(yīng)的有機(jī)酸，無法聚合，因此保存及操作時(shí)都應(yīng)注意防潮。

季節(jié)A液B液冬季55春秋季37夏季28包埋和聚合

材料製備技術(shù)ERL-4206（Spurr樹脂,環(huán)氧樹脂）618#樹脂（國產(chǎn)）配法與Epon812相似。此樹脂較粘稠，可以用DDSA或MNA調(diào)整硬度，以DBP（鄰苯甲酸二丁酯）增塑。這種包埋劑的特點(diǎn)是粘度低，滲透性較強(qiáng)，常用於處理不好滲透的材料（如含樹脂的裸子植物等）的包埋。其缺點(diǎn)是製成的切片電子反差弱，超微結(jié)構(gòu)圖像反差不如Epon812

。這種包埋劑容易吸潮變軟，包埋前後都應(yīng)注意防潮。這種包埋劑以VCD（vinylcyclohexenedioxide）為單體，加入：增塑劑D.E.R.736(diglycidyletherofpolypropyleneglycol)，固化劑NSA（nonenylsuccinicanhydride）加速劑DMAE（dimethylaminoethanol）混合均勻後使用。配法與Epon812相似。Spurr樹脂的配方（單位：克或毫升）成分標(biāo)準(zhǔn)硬度用量較硬用量較軟用量VCD101010D.E.R.736647NSA262626DMAE0.40.40.4樹脂的固化(聚合)：Epon812:37℃,12小時(shí)—45℃,12-48小時(shí)—60℃,24小時(shí)。聚合不好可延長至48小時(shí),或100℃1-2小時(shí)。Spurr:40℃,24-48小時(shí)—70℃溫箱中過夜。

材料製備技術(shù)包埋和聚合甲基丙烯醯酯類(有機(jī)玻璃)甲基丙烯酸酯類化合物是電鏡制樣中應(yīng)用最早的包埋劑，優(yōu)點(diǎn)是透明度高、粘度較低、水溶性強(qiáng)、容易滲透等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是聚合時(shí)發(fā)生收縮而容易引起組織損傷，同時(shí)在電子束轟擊下不穩(wěn)定。這些缺點(diǎn)對於在光學(xué)顯微鏡下觀察並不構(gòu)成嚴(yán)重的問題，因此廣泛用於半薄切片在光學(xué)顯微鏡下觀察。配方1：97%GMA(乙二醇甲基丙烯酸酯水溶液)7份(體積)甲基丙烯酸丁酯3份(體積)過氧化苯甲醯1.2-2%配方2：甲基丙烯酸丁酯8.0ml甲基丙烯酸甲酯2.0ml過氧化苯甲醯0.15克上述混合液可在攪拌均勻後放在80℃水浴中處理10-15分鐘，同時(shí)用玻璃棒攪拌，使發(fā)生初步的聚合(半聚合或子聚合)這樣可增加混合液的粘度，並且用半聚合的混合物進(jìn)行滲透和包埋可減少包埋後聚合產(chǎn)生的損傷。固化(聚合)：45℃,12-48小時(shí)。配方中甲酯多時(shí)較硬，丁酯多時(shí)較軟，故可用改變二者的比例的辦法來調(diào)節(jié)聚合後包埋塊的硬度。甲基丙烯酸酯類化合物出廠時(shí)加有阻止聚合的化合物即阻聚劑如對苯二酚等，這些化合物的存在對聚合有影響，因此事先應(yīng)將它們除去?？芍苯佑肎MA梯度溶液作脫水劑。無須過渡。

材料製備技術(shù)普通超薄切片包埋和聚合

其他包埋劑JB4GMA:半薄切片常用。套藥。4℃下經(jīng)紫外光照可聚合，水溶性好，易染色，消螢光。LK4M:低溫包埋劑。還有LowicrylK11M、LowicrylHM20、LowicrylHM23等。-70—-20℃下經(jīng)紫外光照可聚合，水溶性好，強(qiáng)電子反差。DurcupantGMA:

水溶性Epoxy樹脂。改良後用於超薄切片。HPMA:

聚甲基丙烯酸羥丙酯。

水溶性

脂溶性Araldite:能與水溶性包埋劑混溶，可配合使用。國產(chǎn)600#:與618#相似。粘度很低(4-6厘泊,25℃)，所以材料可直接放入包埋劑中進(jìn)行滲透。

國產(chǎn)711#:與618#相似。

材料製備技術(shù)普通超薄切片超薄切片基本流程

制刀修塊

(定位)

切片(展片)粘片染色制刀機(jī)錐形修塊機(jī)銅網(wǎng)玻璃刀LKB超薄切片機(jī)

材料製備技術(shù)製成的玻璃刀制玻璃刀材料制玻璃刀操作12345刀刃水槽平面

制刀過程夾緊玻璃材料。均勻用力。適當(dāng)調(diào)整刀刃角度。水槽密封。

定位（修塊）將材料精確的定位是進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)研究的關(guān)鍵步驟之一，定位不精會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論，必須高度重視單細(xì)胞、孢子、花粉等材料要選取材料密集處切片。多細(xì)胞材料要儘量切到準(zhǔn)確的縱、橫切面。組織的切面除要切到準(zhǔn)確的縱、橫切面外，還應(yīng)修塊到你所需要的部位附近。用修塊機(jī)切取半薄切片來判斷所需部位。小型材料如難以定位，須先經(jīng)顯微操作剝出後再包埋。包埋模具預(yù)切片至材料邊緣定位修塊錐形修塊機(jī)半薄切片至所需位置半薄切片顯微鏡檢1.0mm09955-AB$1207.91700.383.0mm09972-AB$2019.951106.406.0mm09897-AB$3238.011715.43美國SPISupplies鑽石刀具及報(bào)價(jià)NewKnife

Resharpening

AFMDiamondKnifeforUltraandCryoExtremelysmoothsamplesurfacesBestpossiblestructurepreservationThehighqualityDiatomediamondknivesarenotjustperfectforproducingultrathinandsemi-thinsections,butalsoforsurfacingsectioningofallkindsofbiologicalandindustrialspecimensforAFMinvestigation.InsteadofasectionasforTEM,thespecimensurfaceisinvestigatedusingAFM.InordertoachievethebestresultsforAFMinvestigation,onlythehighestqualitydiamondknivesshouldbeused.DiatomeultraAFMandcryoAFMknivesarespeciallytestedtoensurethattheymeettheincreasedqualityrequirementsofAFMinvestigation.Theyproduceextremelysmoothsamplesurfacesandguaranteethebestpossiblestructurepreservation.Availablein35°withacuttingrangeof10-100nmin2mmand3mmsizes.OrderingInformation

1,825.0030-AFM-UDRresharpen

3,010.0030-AFM-UDLnew3.0mm35°

Ultra-AFMDiamondKnife

1,825.0030-AFM-CDRresharpen

3,010.0030-AFM-CDLnew3.0mm35°

Cryo-AFMDiamondKnife

1,275.0020-AFM-UDRresharpen

2,300.0020-AFM-UDLnew2.0mm35°

Ultra-AFMDiamondKnife

1,275.0020-AFM-CDRresharpen

2,300.0020-AFM-CDLnew2.0mm35°

Cryo-AFMDiamondKnife

Price$ItemIDKnifemmAngleDescriptionReferencesP.H.Vallotton,M.M.Denn,B.A.WoodandM.B.Salmeron:Comparisonofmedical-gradeultrahighmolecularweightpolyethylenemicrosctructurebyAFMandTEM.J.Biomater.Sci.PolymerEdn.,Vol6,No.7,pp.609-620,1994.N.MatskoandM.Müller:AFMofbiologicalmaterialembeddedinepoxiresin.

JournalofStructuralBiology146,pp.334-343,2004.錐形修塊機(jī)LKBPyramiton11800切片轉(zhuǎn)輪進(jìn)樣轉(zhuǎn)輪切片厚度調(diào)節(jié)桿刀夾照明螢光燈通用夾頭半薄切片製作方法適當(dāng)調(diào)節(jié)切片厚度(0.5-3μm)，單純製作半薄切片時(shí)包埋劑以GMA為好。切取的薄片直接平鋪在載玻片水滴面上，放在70℃攤片機(jī)或小型溫臺(tái)上展片。水滴烤幹後切片會(huì)牢牢地貼在玻片上，無須使用粘片劑。將染料滴加在切片上直接染色，然後清洗掉多餘染料即可。完全乾燥後即可封固，封固方法同石蠟切片。也可不封固。GMA半薄切片適合各種染色，環(huán)氧樹脂半薄切片可選擇：

材料製備技術(shù)亞甲蘭–––天青溶液配方：亞甲蘭0.13克天青Ⅱ0.02克甘油10毫升甲醇10毫升磷酸緩衝液(pH6.9)30毫升蒸餾水50毫升鹼性品紅配方：鹼性品紅0.1克50%乙醇10毫升蒸餾水200毫升將亞甲蘭–天青染液滴在切片上，在60℃條件下染色，染色時(shí)間一般為10-30分鐘(據(jù)材料性質(zhì)而定)—沖洗後，用濾紙吸幹水分，再滴染鹼性品紅(溫室)對染3-5分鐘—用水沖洗後即可在顯微鏡下檢查效果。細(xì)胞壁和澱粉粒染成鮮紅色，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核仁等染成不同程度的蘭綠色。

也要以用蘇木精－番紅染液進(jìn)行染色。攤烤片機(jī)小型恒溫臺(tái)

材料製備技術(shù)

切片(展片)準(zhǔn)備工作：新制玻璃刀備用;修塊定位;準(zhǔn)備好載網(wǎng)用載網(wǎng)來承托超薄切片，進(jìn)行後續(xù)的染色和觀察過程。載網(wǎng)通用規(guī)格：直徑3mm，1-400目。材質(zhì)：銅、不銹鋼、金、鎳、鉑等。載網(wǎng)的清洗：新舊載網(wǎng)使用前均要清洗。目的是去灰塵和除靜電。以利於撈片。新載網(wǎng)：95%酒精浸泡10分鐘，重蒸餾水沖洗，晾乾。舊載網(wǎng)再利用前：氯仿法清洗：氯仿浸泡幾天，經(jīng)?；蝿?dòng)，完全除掉舊材料後—用重蒸餾水沖洗掉氯仿—純酒精洗滌—放在鋪有乾淨(jìng)濾紙的帶蓋的培養(yǎng)皿晾乾。灼燒法：30mL小坩堝中倒入95%酒精，平放在小託盤、石棉網(wǎng)或陶瓷墊上—點(diǎn)燃酒精，尖頭鑷子（鐘錶鑷子或遊絲鑷子）夾住舊銅網(wǎng)，在火焰藍(lán)色部分灼燒片刻，鬆開鑷子讓銅網(wǎng)直接落入小坩堝中—燒完後蓋滅火焰—用重蒸餾水沖洗載網(wǎng)幾次—純酒精洗滌—放在鋪有乾淨(jìng)濾紙的帶蓋的培養(yǎng)皿晾乾。

材料製備技術(shù)載網(wǎng)的覆膜：載網(wǎng)目數(shù)越少對材料的遮擋越少，但在載網(wǎng)孔隙過大時(shí)，小的切片往往難以撈起和被撐住，切片邊緣沒有附著物時(shí)切片也容易在電子束轟擊下發(fā)生捲曲。常採用在載網(wǎng)上附加一層膜作為支撐。最常用的是孚爾瓦膜(Formvarfilm)，也可以用火棉膠膜+碳膜。孚爾瓦覆膜的製作方法小燒杯中配製0.2-0.5%的孚爾瓦/氯仿溶液。取乾淨(jìng)載玻片浸入溶液約3cm。勻速抽出。自然風(fēng)乾後，用鋒利的針尖或刀片劃痕。注意防塵。大燒杯或水槽中注滿蒸餾水。將載玻片稍傾斜緩緩插入水中，使孚爾瓦膜漂在水面上並與玻片分離。將洗淨(jìng)的銅網(wǎng)均勻擺放在孚爾瓦膜上，用鑷子輕壓使之粘牢。用乾淨(jìng)的載玻片或?yàn)V紙將膜粘起，放入培養(yǎng)皿(加蓋)晾乾。

材料製備技術(shù)超薄切片對操作的精度要求高。超薄切片機(jī)採用熱膨脹技術(shù)進(jìn)刀；機(jī)器最好安放在一樓，並配有超穩(wěn)工作臺(tái)和穩(wěn)壓電源，以減少振動(dòng)等造成的誤差。操作程式開機(jī)—接通電源(1),電源指示燈點(diǎn)亮並聽到蜂鳴聲。松一下樣品壁(2)再鎖住,聽到蜂鳴聲,校準(zhǔn)樣品壁。打開照明燈(3),調(diào)節(jié)好光的角度,(螢光燈用於照明,白熾燈用於檢查刀口)。安放樣品,玻璃刀(4),加緊。調(diào)好到的位置和刀角(2-6°)。用體視顯微鏡對刀。選擇刀口(自右向左)。旋轉(zhuǎn)粗調(diào)(5)進(jìn)刀,使樣品貼近刀口(可調(diào)整範(fàn)圍10mm);再用細(xì)調(diào)(6)繼續(xù)調(diào)近,使樣品與刀之間留極小間隙。手動(dòng)試切。每順時(shí)針旋轉(zhuǎn)2-4格切一下(7),直到切出完整切片。鬆開樣品壁(2)。用注射器(8)向刀上的水槽中加重蒸水,使水面與刀口平齊。調(diào)整螢光燈,使從體視鏡中看到的水面干涉光呈乳白色。112234563678

材料製備技術(shù)操作程式再次調(diào)整新刀口。轉(zhuǎn)到自動(dòng)切片(9),選擇刀速(9)和切片厚度(10)

。開始自動(dòng)切片後，隨時(shí)觀察，判斷切片厚度（表）,適當(dāng)調(diào)整。自動(dòng)切片開始後一般不要再動(dòng)粗細(xì)調(diào)旋鈕。粘片：切出一定量切片後，關(guān)閉自動(dòng)進(jìn)刀。載網(wǎng)覆膜面向下，輕輕粘起切片。吸掉鑷子上的多餘水分，膜面向上放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿，或樣品盒中晾乾備用。注意做好標(biāo)記。切完一塊樣品，換樣品時(shí)打開電吹風(fēng)冷卻機(jī)芯，以保持練好的持續(xù)切片能力。切完片後，鎖住樣品壁，取下樣品夾頭，打掃臺(tái)面，關(guān)閉電源。910切片顏色相當(dāng)厚度(nm)品質(zhì)暗灰10-30切片發(fā)散，不可用。銀灰30-50較好，尤其適合做細(xì)胞化學(xué)觀察米色50-70適合做一般結(jié)構(gòu)觀察。金黃色70-90可用做高壓電鏡觀察。紫色或藍(lán)綠色＞

100難以進(jìn)行一般觀察但可用做高壓電鏡。如何提高切片品質(zhì)的方法參見陳力編著,《生物電子顯微術(shù)教程》38-40頁?？梢耘cPC機(jī)連接控制。刀和樣品可弧形移動(dòng),且?guī)в懈髯缘木_驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，可全方位調(diào)節(jié)選擇切片位置。在底部、頂部和試樣內(nèi)擁有照明系統(tǒng),很方便找到樣品，選擇切片位置，觀察切片過程，切片計(jì)數(shù)器及進(jìn)樣累加器自動(dòng)控制。主要用於生物樣品的超薄切片，可使切片厚度達(dá)到20-50nm。技術(shù)參數(shù)：操作模式：手動(dòng)/自動(dòng)。切片速度：0.05-100mm/s,切片數(shù)顯示切片厚度：可在200nm中任選，可限位裝置和警告器。(1nm-100nm範(fàn)圍可以設(shè)定為1nm步進(jìn)增長；100nm-2500nm範(fàn)圍可設(shè)定為10nm步進(jìn)增長；2500nm-15000nm範(fàn)圍可設(shè)定為500nm步進(jìn)增長。)返還速度：3檔調(diào)節(jié),採用重力切割，無震動(dòng)。型號:UCT-GA-D/E-1/00是萊卡(LEICA)公司最新推出的一款切片機(jī)，新款超薄切片機(jī)UC6超薄切片機(jī)全新的UC6超薄切片機(jī)秉成徠卡超薄切片機(jī)的確高精度,堅(jiān)固耐用的品質(zhì),再加上多項(xiàng)創(chuàng)新的設(shè)計(jì),卓越功能,令用戶很輕易舒適地完成常溫/冷凍的超薄切片工作.UC6系列有UC6i,UC6b,UC6r和UC6rt可供選購.性能特點(diǎn)利用重力切片，不用馬達(dá)驅(qū)切片。內(nèi)置防震系統(tǒng)，保證無操作誤差。彩色觸屏控制器顯示操作提示，操作快速方便。人機(jī)工程設(shè)計(jì)，可左手/右手操作，輕鬆如意。選用中心式移動(dòng)顯微鏡，方便對玻璃刀/鑽石刀。LED照明，光亮度可調(diào)。選用中心式移動(dòng)顯微鏡，方便低水位常溫/冷凍切片。全馬達(dá)操控刀臺(tái)，X軸方向可測量，帶自動(dòng)修塊功能。

材料製備技術(shù)用於電子顯微鏡觀察的染色技術(shù)

在電子顯微鏡下只能獲得黑白圖像。增強(qiáng)圖像的反差是首先要解決的問題，這樣才能使結(jié)構(gòu)更清晰；增加中間灰度也是重要方面，這樣可以使圖像層次更加豐富，成像更加飽滿，更全面地反映結(jié)構(gòu)資訊。用於電子顯微鏡觀察的染色主要借助重金屬鹽類，通過增加結(jié)構(gòu)的吸收電子能力，使被染色處電子反差增強(qiáng)，圖像變黑而顯示染色。對於超薄切片的染色常規(guī)電子染色超微細(xì)胞化學(xué)染色無機(jī)離子的細(xì)胞化學(xué)碳水化合物的細(xì)胞化學(xué)脂類的細(xì)胞化學(xué)蛋白質(zhì)的細(xì)胞化學(xué)核酸的細(xì)胞化學(xué)結(jié)構(gòu)蛋白和總蛋白酶細(xì)胞化學(xué)免疫細(xì)胞化學(xué)放射免疫細(xì)胞化學(xué)

材料製備技術(shù)電子染色是指用重金屬鹽溶液處理樣品，使其與細(xì)胞中某些特定的成分結(jié)合，或使其吸附在某些特定的結(jié)構(gòu)上。在結(jié)合或吸附重金屬鹽染色劑的區(qū)域，由於其電子含量高，經(jīng)高壓電子束轟擊後，其散射電子的數(shù)量也高，在螢光屏上即呈現(xiàn)暗區(qū)。材料不同部位、不同成分對電子染色劑的結(jié)合或吸附能力不同，在螢光屏上成像的明暗（深淺）就不同，因此顯示出不同的層次和反差。重金屬鹽染色劑顆粒越細(xì)，電子圖像就越細(xì)緻。用於電子顯微染色的重金屬鹽類有：鈾鹽、鉛鹽、鋨鹽、錳鹽、鐵鹽、鐐鹽、銦鹽、鎢鹽、鑭鹽、鉈鹽、銀鹽、鉍鹽等。其中最常用的是鈾鹽和鉛鹽。清洗晾乾

材料製備技術(shù)常規(guī)電子染色以顯示細(xì)胞中所有結(jié)構(gòu)為目的的染色。用於超微形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察。常用檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾進(jìn)行複染色。技術(shù)流程檸檬酸鉛染色清洗醋酸雙氧鈾染色有報(bào)導(dǎo)指出：檸檬酸鉛染色之前保持銅網(wǎng)濕潤是減少鉛染色中污染的有效方法。醋酸雙氧鈾

UO2(CH3COO)2·2H2O螢光黃色粉末，見光易分解。有微量放射性。水溶解度7.7%。染色機(jī)理是通過雙氧鈾離子(UO2+)

與樣品中的羧基、磷醯基等結(jié)合，形成金屬複合物?？梢詫⒌鞍踪|(zhì)、DNA、糖蛋白等染色。染色液的配製方法：將3.85g醋酸雙氧鈾溶解於50mL50-70%的酒精中配成飽和溶液，pH3.5-4。充分溶解後過濾，盛於棕色試劑瓶中，4℃冰箱避光保存。染色方法：將乾淨(jìng)培養(yǎng)皿中加入溶解的石蠟(到培養(yǎng)皿容積的1/3即可)，冷卻凝固，製成蠟盤在蠟盤上滴加染液，製成數(shù)排小液滴在每個(gè)小液滴上放一片載網(wǎng)（有切片的一面朝下），室溫下染色20-60分鐘用鑷子夾住載網(wǎng)邊緣，用剪尖的小濾紙片吸掉多餘染液在重蒸餾水中緩緩抖動(dòng)洗滌，換1-2次新重蒸餾水再洗用滴管吸取重蒸餾水輕輕沖洗檸檬酸鉛染色。蠟盤滴染法示意圖

材料製備技術(shù)

材料製備技術(shù)檸檬酸鉛(枸櫞酸鉛)Pb3(C6H5O7)2染色中一般不用市售的檸檬酸鉛，而採用硝酸鉛和檸檬酸鈉新配。檸檬酸鈉可以螯和鉛離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。鉛鹽有毒。染色機(jī)理是：鉛離子對樣品中的某些陰離子活性基團(tuán)(硫氫基、磷酸基、咪唑基等)有更大的親和力，可以將細(xì)胞核、核蛋白顆粒很好地染色。鉛溶液很容易與二氧化碳反應(yīng)形成碳酸鉛沉澱，在染色過程中極易造成對切片的污染，是超薄切片染色中須避免的主要問題。染色液的配製方法：稱取硝酸鉛1.33g，檸檬酸鈉1.76g，依次放入50mL容量瓶中，加約30mL重蒸餾水，震搖30分鐘，使之形成乳白色懸濁液(形成檸檬酸鉛)。懸濁液中加入8mL1mol/L的氫氧化鈉溶液，使溶液變透明。加重蒸餾水至50mL定容。充分搖動(dòng)使之混合。(pH12)過濾到棕色試劑瓶中，密封瓶口。4℃冰箱保存。如何辨別超薄切片上的鉛污染顆粒？

材料製備技術(shù)檸檬酸鉛染色方法：在蠟盤周邊擺放氫氧化鈉顆粒，以吸收空氣中的CO2。染色人員戴好口罩，室內(nèi)通風(fēng)或增氧，禁止閒雜人員入室參觀、聊天。以小液滴法染色20-40分鐘，方法與鈾染色相同。滴加染液和擺放銅網(wǎng)時(shí)要儘量並住呼吸，操作完成後立即蓋好培養(yǎng)皿蓋。將銅網(wǎng)放入0.1mol/L的氫氧化鈉溶液中漂洗1-2秒鐘，除去樣品上多餘的染液；然後按與鈾染色法相同的方法清洗載網(wǎng)。吸去多餘水分後，將載網(wǎng)放在鋪有濾紙的乾淨(jìng)培養(yǎng)皿中晾乾。(加蓋防塵)防止鉛染色污染的主要措施：防止材料過多接觸CO2

。以氫氧化鈉顆粒吸附CO2

。染液配製中迅速操作，避免干擾；防止染液吸入過多的造成污染。染液密封、低溫儲(chǔ)藏。檸檬酸鉛液滴法染色示意圖氫氧化鈉顆粒醋酸雙氧鈾單一染色效果醋酸雙氧鈾+檸檬酸鉛複染色效果

材料製備技術(shù)用某種染色劑將細(xì)胞或組織中的某種或某類化學(xué)物質(zhì)染色；或?qū)⒓?xì)胞或組織經(jīng)化學(xué)處理後，使其某一部分起化學(xué)變化，從而產(chǎn)生材料的染色反應(yīng)，並通過顯微鏡來直接鑒定組織或細(xì)胞中含有物的性質(zhì)和位置的方法。被稱為“顯微化學(xué)”(Microchemistry)方法。顯微化學(xué)按照研究層次不同又可分為組織化學(xué)(Histochemistry)和細(xì)胞化學(xué)(Cytochemistry)

。由於二者往往難以區(qū)分，所以文獻(xiàn)中也常用細(xì)胞組織化學(xué)(Cytohistochemistry)

一詞來描述這類研究工作。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行的實(shí)際上多為組織化學(xué)研究，在超微結(jié)構(gòu)水準(zhǔn)上才能真正進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)研究。利用顯微化學(xué)手段進(jìn)行研究的一般目的，是要通過在生物體上原位地觀察某些物質(zhì)，進(jìn)而推斷其生理活動(dòng)過程和生理功能。近年來大量新染色劑、新方法和新技術(shù)手段的出現(xiàn)，使細(xì)胞化學(xué)研究工作出現(xiàn)了以下革新：染色精度提高，甚至可以對單分子成分進(jìn)行精確的染色。與IT技術(shù)結(jié)合，定量分析能力和獲取視頻圖像的能力大大加強(qiáng)。光切面精度的提高,操作更加方便。對材料的損耗更小。

材料製備技術(shù)核酸的電鏡細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)染色機(jī)理：基於孚爾根反應(yīng)的DNA染色法—以鹽酸水解使核酸暴露出遊離醛基，與銀離子結(jié)合形成電子緻密沉澱。用醋酸雙氧鈾、三氯化銦、鎢酸鈉、磷鎢酸鹽-吡啶黃複合物等使核酸直接染色?？赏瑫r(shí)或分別染色DNA和RNA