生物技術(shù)制藥課件

生物藥物概論第一節(jié)生物藥物的來源、特性、分類與製備第二節(jié)人體來源的藥物第三節(jié)動(dòng)物來源的藥物第四節(jié)植物來源的藥物第五節(jié)海洋生物藥物第一節(jié)生物藥物的來源、特性、分類與製備蛋白質(zhì)、酶、核酸、激素、抗體、細(xì)胞因數(shù)等與代謝相關(guān)的物質(zhì)都可能成為藥物。一、來源1、生物藥物的定義：生物藥物是指運(yùn)用生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等的研究成果，從生物體、生物組織、細(xì)胞、體液等，綜合利用物理學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、生物技術(shù)和藥學(xué)等學(xué)科的原理和方法製造的一類用於預(yù)防、治療和診斷的製品。一、來源2、生物藥物的原料來源生物藥物原料以天然的生物材料為主，包括人體、動(dòng)物、植物、微生物和各種海洋生物等。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，有目的人工制得的生物原料成為當(dāng)前生物制藥原料的重要來源，如用免疫法制得的動(dòng)物原料、用基因工程技術(shù)制得的微生物或其他細(xì)胞原料等。二、生物藥物的特性1、藥理學(xué)特性（1）治療的針對性強(qiáng)治療的生理、生化機(jī)制合理，療效可靠。如細(xì)胞色素c為呼吸鏈的一個(gè)重要成員，用它治療因組織缺氧所引起的一系列疾病，效果顯著。（2）藥理活性高生物藥物是精製出來的高活性物質(zhì)，因此具有高效的藥理活性（3）毒副作用小，營養(yǎng)價(jià)值高（4）生物副作用常有發(fā)生二、生物藥物的特性2、在生產(chǎn)、製備中的特殊性（1）原料中的有效物質(zhì)含量低：雜質(zhì)種類、含量高，提取、純化工藝複雜。（2）穩(wěn)定性差：活性部位與空間構(gòu)象的理化影響因素（3）易腐敗：由於生物藥物原料都是營養(yǎng)價(jià)值高的物質(zhì)，因此對活性及無菌操作等要求嚴(yán)格二、生物藥物的特性（4）注射用藥有特殊要求：生物藥物由於易被胃腸道中的酶所分解，所以給藥途徑主要是注射用藥，因此對藥品製劑的均一性、安全性、穩(wěn)定性、有效性等都有嚴(yán)格要求。同時(shí)對其理化性質(zhì)、檢驗(yàn)方法、劑型、劑量、處方、貯存方式等亦有明確的要求。二、生物藥物的特性3、檢驗(yàn)上的特殊性由於生物藥物具有特殊的生理功能，因此生物藥物不僅要有理化檢驗(yàn)指標(biāo)，更要有生物活性檢驗(yàn)指標(biāo)。三、生物藥物的分類生物藥物的分類方法有以下三種：1、按藥物的化學(xué)本質(zhì)和化學(xué)特性來分；2、按原料來源來分類；3、按生理功能和臨床用途來分類1、按藥物的化學(xué)本質(zhì)和化學(xué)特性來分；生物藥物的有效成分多數(shù)是比較清楚的，因此有利於比較一類藥物的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)係、分離製備方法的特點(diǎn)和檢測方法的統(tǒng)一等。主要有：（1）氨基酸及其衍生物類藥物；（2）多肽和蛋白質(zhì)類藥物；（3）酶和輔酶類藥物：酶類按其功能分為消化酶類、消炎酶類、心腦血管疾病治療酶類、抗腫瘤酶類、氧化還原酶類等，一部分輔酶亦屬於核酸類藥物。（4）核酸及其降解物和衍生物類藥物；（5）糖類藥物：以粘多糖為主；（6）脂類藥物：主要有脂肪和脂肪酸類、磷脂類、膽酸類、固醇類、卟啉類等；（7）細(xì)胞生長因數(shù)類；（8）生物製品類：從微生物、原蟲、動(dòng)物或人體材料直接製備或用現(xiàn)代生物技術(shù)、化學(xué)方法製成作為預(yù)防、治療、診斷特定傳染病或其他疾病的製劑，統(tǒng)稱為生物製品2、按原料的來源分類按原料來源分類，有利於對不同原料進(jìn)行綜合利用、開發(fā)研究。對於生物技術(shù)藥物來說，不同原料來源的生物藥物對生物技術(shù)的要求有所不同。分類如下：（1）人體組織來源的生物藥物：主要有人血液製品類、人胎盤製品類、人尿製品類；（2）動(dòng)物組織來源的生物藥物：動(dòng)物的臟器、其他小動(dòng)物制得的藥物如蛇毒、蜂毒等。（3）植物組織來源的生物藥物：中草藥、有效成分；（4）微生物來源的藥物：抗生素、酶、氨基酸、維生素等；（5）海洋生物來源的藥物；3、按生理功能和用途分類生物藥物廣泛用作醫(yī)療用品，在醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、保健醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都發(fā)揮著重要作用，大致分四類：（1）治療藥物：對疑難雜癥如腫瘤、愛滋病、免疫性疾病、內(nèi)分泌障礙等具有特殊的作用；（2）預(yù)防藥物：對傳染病的預(yù)防；（3）診斷藥物：免疫診斷試劑、單克隆抗體診斷試劑、酶診斷試劑、放射性診斷藥物和基因診斷藥物等；某些生物活性物質(zhì)亦是檢測疾病的指標(biāo)，如穀草轉(zhuǎn)氨酶等；（4）其他生物醫(yī)藥用品：生物藥物在其他方面應(yīng)用也很廣泛：如生化試劑、保健品、化妝品、食品、醫(yī)用材料等。四、生物藥物的製備生物藥物的提取與分離方法因?yàn)樵牧稀⑺幬锏姆N類和性質(zhì)不同而有很大差異。這裏作簡要介紹：1、生物藥物原料的選擇、預(yù)處理與保存方法；2、生物藥物的提?。?、蛋白質(zhì)類藥物的分離純化方法；4、核酸類藥物的分離純化；5、糖類藥物的分離純化方法6、脂類藥物的分離純化方法；7、氨基酸類藥物的分離純化方法1、生物藥物原料的選擇、預(yù)處理與保存方法（1）原料選擇選擇原則主要為：有效成分含量高、原料來源豐富，易得；原料中雜質(zhì)含量少；原料成本低等；另外植物原料採收具有季節(jié)性、微生物原料要注意微生物生長的對數(shù)期、動(dòng)物原料有的要注意動(dòng)物的年齡與性別。（2）原料的預(yù)處理與保存：動(dòng)物原料採集後要立即處理，去除結(jié)締組織、脂肪組織等，並迅速冷凍貯存。植物原料確定後，要擇時(shí)採集並就地去除不用的的部分，有用部分保鮮處理，收集微生物時(shí)要及時(shí)將菌細(xì)胞與培養(yǎng)液分開，進(jìn)行保鮮處理。1、生物藥物原料的選擇、預(yù)處理與保存方法原料的保存方法主要有：（1）冷凍法，該法適用於所有生物原料。常用-40℃速凍。（2）有機(jī)溶劑脫水法。常用的有機(jī)溶劑是丙酮。該法適用於原料少而價(jià)值高、有機(jī)溶劑對活性物質(zhì)沒有破壞作用的原料，如腦垂體等。（3）防腐劑保鮮。常用乙醇、苯酚等。該法適用於液體原料，如發(fā)酵液、提取液等。2、生物藥物的提?。?）生物組織和細(xì)胞的破碎常用的破碎方法一是磨切法，使用的設(shè)備有組織搗碎機(jī)、膠體磨、勻漿器、勻質(zhì)機(jī)、球磨機(jī)、乳缽等；二是壓力法，有加壓和減壓兩種；三是反復(fù)凍融法，該方法設(shè)備簡便，活性保持好，用時(shí)較長；四是超聲波振盪破碎法，該法破碎效果較好，對活性有損失；五是自溶法或酶解法，用得較少。2、生物藥物的提?。?）提取生物組織與細(xì)胞破碎後要立即進(jìn)行提取。提取時(shí)，首先要根據(jù)活性物質(zhì)的性質(zhì)，選擇提取試劑。提取試劑主要有：水、緩衝溶液、鹽溶液、乙醇、其他有機(jī)溶劑（如氯仿、丙酮等）。其次是考慮提取溶劑的用量及提取次數(shù)、提取時(shí)間。三是注意提取的溫度、pH、變性劑等因素。3、蛋白質(zhì)類藥物的分離純化方法所說的蛋白質(zhì)類藥物包括蛋白質(zhì)、多肽和酶類等藥物。分離純化方法主要有：（1）沉澱法蛋白質(zhì)、酶的初步純化往往用沉澱法。其原理是使蛋白質(zhì)膠體顆粒破碎，從而沉澱蛋白質(zhì)。常用的有鹽析法、有機(jī)溶劑沉澱法、等電點(diǎn)沉澱法、與靶物質(zhì)結(jié)合沉澱法（如抗原—抗體）等。（2）按分子大小分離的方法有超濾法和透析法（即膜分離法）、凝膠層析法、超速離心法等。其中膜分離法可用於生物大分子的濃縮、分級和脫鹽。3、蛋白質(zhì)類藥物的分離純化方法（3）按分子所帶電荷進(jìn)行分離的方法氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶均為兩性電解質(zhì)。根據(jù)它們的等電點(diǎn)不同，調(diào)節(jié)pH值進(jìn)行交換、電泳、等電聚焦法等。（4）親和層析法大部分生物活性物質(zhì)都有其作用的靶物質(zhì)，如酶與底物（或抑制劑）、抗原與抗體、激素與受體等。書中提到的疏水相互作用層析方法以及很多其他書中未提到的方法也可以進(jìn)行蛋白質(zhì)分離和純化。4、核酸類藥物的分離純化方法核酸類藥物生產(chǎn)方法主要有提取法和發(fā)酵法。提取法生產(chǎn)DNA和RNA的主要技術(shù)是，先提取核酸和蛋白質(zhì)複合物，再解離核酸與蛋白質(zhì)，然後分離RNA與DNA。發(fā)酵法主要用於生產(chǎn)單核苷酸。5、糖類藥物的分離純化方法（1）提取方法非降解法適用於從含一種粘多糖的動(dòng)物組織中提取粘多糖，提取採用的溶劑是水或鹽溶液。降解法適用於從組織中提取結(jié)合比較牢固的粘多糖。如從軟骨中分離提取硫酸軟骨素，就是用堿處理進(jìn)行降解。又如用酶處理法可提取與蛋白質(zhì)結(jié)合的多糖5、糖類藥物的分離純化方法（2）分離方法常用的分離方法是沉澱法和離子交換層析法。乙醇沉澱法是從提取液中沉澱多糖最簡易方法，也適用於分級分離。4~5倍體積的乙醇可以使任何結(jié)締組織中的粘多糖完全沉澱。用季銨化合物也可沉澱粘多糖。粘多糖的聚陰離子能與某些陽離子表面活性劑結(jié)合成不溶於水的鹽，如CTAB等離子交換層析法。粘多糖的聚陰離子能夠很快地被陰離子交換劑吸附和分離，如DowexI-X2離子交換樹脂、DEAE-離子交換纖維素等。洗脫可用NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫。6、脂類藥物的分離純化方法（1）提取方法：脂類自然狀態(tài)下是以結(jié)合形式存在的。非極性脂是與其他脂質(zhì)分子或蛋白分子的疏水區(qū)相結(jié)合的。提取脂質(zhì)藥物就是要選擇適當(dāng)?shù)娜軇﹣砥茐倪@種結(jié)合鍵，將脂質(zhì)溶解出來。常用的溶劑有組合溶劑，醇是其中的主要成分，此外還有氯仿、甲醇、水等。6、脂類藥物的分離純化方法（2）純化方法：沉澱法：由於不同脂質(zhì)在丙酮中溶解度不同，故常用它進(jìn)行沉澱；吸附層析法：常用吸附劑有矽膠、氧化鋁等。它是通過極性和離子力等把各種化合物結(jié)合到固體吸附劑上。洗脫一般用極性逐漸增大的洗脫液來進(jìn)行，非極性的先流出；離子交換層析法：脂質(zhì)分子的存在有非解離、兩性離子和酸式解離三種狀態(tài)，根據(jù)它們在一定pH條件下解離情況，選擇適當(dāng)?shù)碾x子交換劑可將它們提純，如TEAE-纖維素對分離脂肪酸和膽汁酸等特別有效。7、氨基酸類藥物的分離純化方法(1)氨基酸的生產(chǎn)方法蛋白質(zhì)水解法：酸水解、堿水解和酶水解三種。用鹽酸水解為常用方法，其優(yōu)點(diǎn)是水解迅速完全，產(chǎn)物全部是L-型氨基酸，缺點(diǎn)是色氨酸全部被破壞，絲氨酸等部分被破壞；堿水解較容易產(chǎn)生消旋作用，較少應(yīng)用。酶水解法水解不夠完全。發(fā)酵法：發(fā)酵法主要是選育特異產(chǎn)生某種氨基酸的菌株，經(jīng)過發(fā)酵後，從培養(yǎng)液中提純氨基酸。(1)氨基酸的生產(chǎn)方法化學(xué)合成與酶促合成法：化學(xué)合成法一般得到的是DL-型氨基酸，尚需要對異構(gòu)體拆分；酶促合成法也是酶工程在醫(yī)藥工業(yè)上應(yīng)用的一個(gè)內(nèi)容，優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)工藝簡單，轉(zhuǎn)化率高，副產(chǎn)物少，容易提純等。（2）氨基酸的分離方法常用的氨基酸分離提純方法有沉澱法、吸附法和離子交換法。沉澱法；根據(jù)形成沉澱的原理不同分為兩種：一種是依據(jù)不同氨基酸在水中或其他溶劑中的溶解度差異進(jìn)行分離。另一是用特殊試劑沉澱某種氨基酸，如用鄰二甲苯-4-磺酸與亮氨酸形成不溶性鹽沉澱，再用氨水分解，使亮氨酸游離出來。吸附法；這是利用吸附劑根據(jù)氨基酸吸附力的差異進(jìn)行氨基酸分離的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分離就是利用活性碳對其吸附的原理（2）氨基酸的分離方法離子交換法：氨基酸是兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下，不同氨基酸帶電性質(zhì)及解離狀態(tài)是不同的，因此在離子交換劑上被吸附的強(qiáng)度不同。常用的離子交換劑為強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂，洗脫主要用pH梯度洗脫。第二節(jié)人體來源的藥物一、人體來源藥物的特點(diǎn)與研究意義二、人體來源藥物的種類與用途三、人體來源藥物的製備實(shí)例四、人體藥物的研究前景一、人體來源藥物的特點(diǎn)與研究意義1、人體來源的生物藥物特點(diǎn)（1）安全性好：需要保證來源於健康人（2）效價(jià)高，療效可靠；因?yàn)榧兌雀撸?）穩(wěn)定性好：可以加工成凍幹試劑，10℃以下可保存2年以上，利於運(yùn)輸、貯存和使用2、研究意義（1）資源的有限性：人體來源是有限的（2）意義：從藥學(xué)角度研究清楚人體來源的結(jié)構(gòu)和功能，對於使用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)藥物具有重大意義，如胰島素的生產(chǎn)。二、人體來源藥物的種類與用途1、人血液製品：全血製品、血液成分製品、血漿成分製品和體液細(xì)胞內(nèi)成分製品等。血液成分製品包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和血漿。這類成分主要通過離心、過濾技術(shù)獲得。(1)紅細(xì)胞製劑：凡在需要提高血液攜氧能力和補(bǔ)充血紅蛋白，而又不需要補(bǔ)充維持血容量的場合，均可輸用“壓積紅細(xì)胞”等紅細(xì)胞製劑。壓積紅細(xì)胞、少含白細(xì)胞的壓積紅細(xì)胞、冰凍貯藏紅細(xì)胞。1、人血液製品（2）白細(xì)胞濃縮液：輸注白細(xì)胞療法，一般在腫瘤病人經(jīng)細(xì)胞藥物治療後，處於骨髓細(xì)胞抑制期間遭受感染且各種抗菌素治療無效情況下採用，療效顯著。白細(xì)胞（粒細(xì)胞）成分需用單采粒細(xì)胞技術(shù)自供血者血循環(huán)中採集。用過濾法或離心法得到的細(xì)胞存活率均較低。改進(jìn)的連續(xù)離心法可將粒細(xì)胞得率提高一倍。注意輸注HLA組織抗原相溶的白細(xì)胞，離體白細(xì)胞的保存問題，白細(xì)胞是IFN

的重要原料（一般是將抗凝後的全血離心，然後取出白細(xì)胞層）。1、人血液製品（3）血小板製劑：血小板的分離和使用在國外已經(jīng)比較普遍，中國尚未推廣使用。血小板製劑的適應(yīng)病癥為白血病、淋巴瘤及其他腫瘤因治療而導(dǎo)致的骨髓抑制癥狀。需要注意的是人體輸注血小板往往會(huì)產(chǎn)生抗體，還會(huì)引起短期的粒細(xì)胞減少。採用單人的血小板，最好應(yīng)用HLA相容的單人血小板輸注，可延緩、減少這種破壞作用。1、人血液製品（4）新鮮冰凍血漿（FFP）：新鮮冰凍血漿可有效地保存血漿中各種生物活性成分的功能。FFP產(chǎn)品規(guī)定自采血到血漿冰凍的時(shí)間不超過8小時(shí)，在-30℃以下保存。FFP可在許多臨床疾病中使用，包括先天性或獲得性凝血因數(shù)缺乏癥、免疫球蛋白缺乏癥等。2、血漿的綜合利用血漿情況表2-1專案含量（%）血漿占人體體重的量血漿占全血的量血漿中水分占血漿的量血漿中蛋白質(zhì)占血漿的量白蛋白+IgG占血漿總蛋白的量其他百餘種微量蛋白成分占血漿總蛋白的量IgA+IgM+Fg+Tr+1AT+Hpx+1AG占血漿總蛋白的量85092656~72510由表2-1可見，血漿蛋白成分中主要是Alb和IgG，含量中等（指含量在100~1000mg/dl）的成分有IgA、IgM、纖維蛋白原（Fg）、補(bǔ)體C3、轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tr）、巨球蛋白（

2M）、觸珠蛋白（Hp）、1抗胰蛋白酶（1AT），血色素結(jié)合蛋白（HpX）和1-AGP等十種。此外還有百餘種小量和微量的蛋白質(zhì)和多肽成分。下麵分別論述具有不同生理功能的幾個(gè)主要成分。2、血漿的綜合利用2、血漿的綜合利用（1）轉(zhuǎn)輸?shù)鞍最?；這是一類對能在血液迴圈中對機(jī)體的營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、激素、藥物等進(jìn)行轉(zhuǎn)輸?shù)难獫{蛋白。白蛋白、前白蛋白、類脂蛋白、觸珠蛋白、血紅蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、銅藍(lán)蛋白、轉(zhuǎn)鈷胺蛋白、GC蛋白。（2）免疫球蛋白（3）凝血系統(tǒng)蛋白：包括與凝血有關(guān)的蛋白質(zhì)、酶或因數(shù)等；第二類是與溶纖有關(guān)的酶，如纖溶酶原，被尿激酶活化後成為具有酶活性的纖溶酶，具有溶栓作用。蛋白C為新近發(fā)現(xiàn)的抗凝系統(tǒng)中的一種主要蛋白。它可被凝血酶啟動(dòng)，活化後的蛋白C能作用於活化的因數(shù)V和VIII，起到抗凝作用，該類蛋白大部分為微量或超微量。2、血漿的綜合利用（4）補(bǔ)體系統(tǒng)蛋白：補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體主要防禦體系之一，在許多生物學(xué)反應(yīng)中，如吞噬、調(diào)理、趨化和細(xì)胞溶解等，均起重要作用。另一方面補(bǔ)體在自身免疫性疾病及迴圈免疫複合物性疾病中，起著損傷機(jī)體的作用。（5）蛋白酶抑制物類：主要有1-抗胰蛋白酶、1抗糜蛋白酶（1X）、間胰酶抑制物、抗凝血酶III等。3、人體液細(xì)胞中的活性物質(zhì)人體液細(xì)胞包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板、成纖維細(xì)胞等，細(xì)胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)具有極重要的生理功能。用人體液細(xì)胞生產(chǎn)的活性物質(zhì)主要有干擾素、白細(xì)胞介素-2、超氧化物歧化酶等少數(shù)幾個(gè)品種。對於體液細(xì)胞中生長因數(shù)等的研究的主要意義在於搞清楚結(jié)構(gòu)和功能，以便用於生物技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。體液細(xì)胞的直接使用是其主要用途。4、人類來源的其他原料的利用（1）人胎盤的應(yīng)用：可得到人胎盤丙種球蛋白、人胎盤白蛋白、人胎盤RNA酶抑制劑等，也可從胎盤中提取絨膜促性激素（HCG）和絨膜促乳激素（HCS）等。（2）人尿的綜合利用：從健康男性尿液中可以製備尿激酶、激肽釋放酶、尿抑胃素、蛋白酶抑制劑、睡眠因數(shù)、集落刺激因數(shù)（CSF）和表皮生長因數(shù)（EGF）等。從妊娠婦女與絕經(jīng)期婦女的尿中，可製備HCG等。5、細(xì)胞因數(shù)（1）特點(diǎn)和生理作用：細(xì)胞因數(shù)系在體內(nèi)或體外對效應(yīng)細(xì)胞的生長、增殖和分化起調(diào)控作用的一類物質(zhì)。許多生長因數(shù)在靶細(xì)胞上有特異性受體，這類因數(shù)包括細(xì)胞生長因數(shù)和細(xì)胞生長抑制因數(shù)。在臨床上，細(xì)胞因數(shù)可促進(jìn)受損組織的恢復(fù)，但對正常組織無作用。（2）主要種類：已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因數(shù)在100種以上，大部分是從動(dòng)物原料中制得，書中給出了一部分細(xì)胞因數(shù)。6、人體激素激素主要有蛋白激素、多肽激素、氨基酸衍生物激素和脂類激素。激素分子很少是大分子蛋白質(zhì)，因數(shù)很少有免疫反應(yīng)。如今激素的生產(chǎn)是以動(dòng)物原料提取為主，近年來，用半合成法和基因工程法來生產(chǎn)激素發(fā)展很快，用這些方法生產(chǎn)人胰島素已取得成功。三、人體來源藥物的製備實(shí)例1、人血漿白蛋白製備工藝要點(diǎn)：絡(luò)合（利凡諾沉澱）：血漿在攪拌下用NaHCO3調(diào)節(jié)pH至8.6，加入等體積的2%利凡諾溶液，充分?jǐn)嚢栳犰o置2~4h，分離上清與絡(luò)合物沉澱。解離：在沉澱中加滅菌蒸餾水。用0.5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至弱酸性，加NaCl至0.15%~0.2%，攪拌下解離。(2-ethoxy-6,9-diaminoacidinelactate)加熱去雜蛋白：充分解離後，65℃恒溫1h，離心分離出上清液。熱處理（60℃，10h）：滅活病毒檢驗(yàn)方法：凍幹品為白色疏鬆物體。白蛋白含量占95%以上，水分<1%，水溶後pH為6.6~7.2，硫酸銨殘留量<0.01%，細(xì)菌學(xué)和熱源質(zhì)檢測合格。三、人體來源藥物的製備實(shí)例2、尿激酶的製備工藝要點(diǎn)：男性尿，8h內(nèi)處理。調(diào)尿液pH6.5以下，電導(dǎo)20~30M/，細(xì)菌數(shù)1000個(gè)/ml以下。矽藻土吸附：1%矽藻土，5℃下吸附1h洗脫：以5℃冷水洗滌後，以0.02%氨水內(nèi)含0.1mol/lNaCl的溶液洗脫，洗脫液由清轉(zhuǎn)渾時(shí)開始收集。除熱源、色素：上述收集液用飽和NaH2PO4調(diào)pH8.0，加NaCl調(diào)電導(dǎo)至22M/，通過DEAE-SephadexA50層析柱，收集流出活性部分CM-C濃縮：上述收集液用1mol/LHAc調(diào)pH至4.2，用蒸餾水調(diào)電導(dǎo)至16~17M/，通過CM-C柱。然後用10倍體積的pH4.2的HAc-NaAc緩衝液洗滌，然後以0.1%氨水0.1mol/LNaCl溶液洗脫尿激酶。收集活性組分，雜質(zhì)被吸附。產(chǎn)品品質(zhì)：無色澄清液或白色凍乾粉末。酶活力>15000IU/mg蛋白質(zhì)四、人體來源藥物的研究前景1、可進(jìn)一步開發(fā)新產(chǎn)品：血液、胎盤等2、用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)人類活性物質(zhì)第三節(jié)動(dòng)物來源的藥物一、動(dòng)物來源藥物的特點(diǎn)二、動(dòng)物來源藥物的種類與用途三、動(dòng)物來源藥物的製備實(shí)例四、前景一、動(dòng)物來源藥物的特點(diǎn)具有生物藥物的共同特點(diǎn)，來源豐富種屬間差異的考慮二、動(dòng)物來源藥物的種類與用途1、動(dòng)物多肽與蛋白質(zhì)類藥物多肽類主要有：多肽激素如垂體激素（促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH、促黑激素MSH、催產(chǎn)素OT、加壓素AVP等）、下丘腦激素、甲狀腺激素、胰島素、胃腸道激素胸腺激素等；多肽類細(xì)胞因數(shù)蛋白類藥物有：蛋白質(zhì)激素、血漿蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)類細(xì)胞因數(shù)、粘蛋白、膠原蛋白以及其他如硫酸魚精蛋白、胰蛋白酶抑制劑等。二、動(dòng)物來源藥物的種類與用途2、動(dòng)物酶與輔酶類藥物有促消化酶類、消炎酶類、治療心腦血管疾病的相關(guān)酶（纖溶酶、尿激酶、蚓激酶、鏈激酶、凝血酶等）、抗腫瘤的酶（L-門冬醯胺酶等）、與氧化還原電子傳遞有關(guān)的治療酶（細(xì)胞色素C、超氧化物歧化酶等）除輔酶Q10、輔酶A外，大部分輔酶由發(fā)酵法得到。二、動(dòng)物來源藥物的種類與用途3、動(dòng)物核酸類藥物（1）組成與作用核酸由核苷酸組成，核苷酸由堿基、戊糖和磷酸三部分組成。戊糖與堿基組成的單元叫核苷。核酸類藥物主要有：核酸、核苷酸、核苷、堿基及其衍生物。在癌癥、肝炎、抗放射性、心臟病方面有重要作用。（2）種類與用途見書中表2-11二、動(dòng)物來源藥物的種類與用途4、動(dòng)物糖類藥物以粘多糖類為主，廣義的粘多糖包括粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等。粘多糖有中性和酸性粘多糖，主要分佈於在動(dòng)物的骨、軟骨、皮、角、血管、腸、滑膜液、腦、角膜、肺、肝、心、尿等原料中。書中給出幾種重要的粘多糖：甲殼質(zhì)、硫酸軟骨素、肝素及透明質(zhì)酸。動(dòng)物粘多糖主要分離步驟大致是：原料處理、提取（降解和非降解法），去除粘多糖，脫色、脫蛋白等，純化，用乙醇沉澱，季銨鹽絡(luò)合沉澱，離子交換、分子篩、親和層析等。二、動(dòng)物來源藥物的種類與用途5、動(dòng)物脂類藥物（1）種類及分佈主要包括脂肪酸及其衍生物、磷脂類、膽酸類、卟啉及其衍生物等。（2）製備方法提取法、水解法、生物轉(zhuǎn)化法化學(xué)合成或半合成法二、動(dòng)物來源藥物的種類與用途6、動(dòng)物細(xì)胞因數(shù)書中表2-14列出了來源於動(dòng)物的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因數(shù)三、動(dòng)物來源藥物的製備實(shí)例1、胰島素的製備2、超氧化物歧化酶（SOD）的製備3、用肝臟生產(chǎn)RNA4、提取法制備腺苷三磷酸（ATP）5、肝素鈉的製備6、前列腺素E2（PGE2）的製備7、表皮細(xì)胞生長因數(shù)（EGF）的製備四、動(dòng)物來源藥物的研究前景1、動(dòng)物資源中活性成分的深入研究與擴(kuò)大開發(fā)2、現(xiàn)代生物技術(shù)在動(dòng)物研究中的應(yīng)用：抗體工程、基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程等3、動(dòng)物藥物的分子改造、化學(xué)合成與新藥設(shè)計(jì)第四節(jié)植物來源的藥物一、植物來源藥物的特點(diǎn)二、植物來源藥物的種類與用途三、植物來源藥物的製備實(shí)例四、前景一、植物來源藥物的特點(diǎn)種類多結(jié)構(gòu)複雜小分子大分子二、植物來源藥物的種類與用途1、植物中的天然有機(jī)化合物：糖和糖苷類、苯丙素類、醌類、黃酮類、鞣質(zhì)、萜類、甾體、生物鹼（表2-15）2、植物蛋白類、多肽、酶類生理活性物質(zhì)的種類和作用：由於免疫方面的原因，這類藥物多用於口服和外用。3、植物糖類藥物：單糖類、聚糖類、糖的衍生物。4、植物脂類藥物：脂肪和脂肪酸類、磷脂類、固醇類。三、植物來源藥物的製備實(shí)例1、植物超氧化物歧化酶（SOD）的製備2、肌糖或肌醇的製備3、植物不飽和脂肪酸的製備四、植物藥物來源藥物的研究前景1、植物細(xì)胞培養(yǎng)研究2、植物組織培養(yǎng)3、天然藥用植物中有效成分的分離、純化，結(jié)構(gòu)和功能的確定。第五節(jié)海洋生物藥物一、海洋生物藥物的研究進(jìn)展二、海洋生物及海洋生物藥物的種類和用途：海藻、腔腸動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物、魚類、爬行動(dòng)物三、海洋生物藥物的製備實(shí)例：黃海葵強(qiáng)心肽A製備、甲殼質(zhì)的製備四、海洋生物藥物的研究進(jìn)展：對當(dāng)前比較常見疾病的預(yù)防和治療，開發(fā)新的海洋醫(yī)用生物材料。五、生物技術(shù)在海洋藥物研究與發(fā)展中的重要作用。五、生物技術(shù)在海洋藥物研究與發(fā)展中的重要作用。1、細(xì)胞工程、基因工程、酶工程2、開發(fā)海洋生物基因工程藥物3、開發(fā)海洋生物細(xì)胞工程藥物4、加強(qiáng)海洋微生物藥物的開發(fā)5、住研究內(nèi)容：用基因工程技術(shù)研究抗腫瘤藥物?；蚬こ讨扑?/p>

第三講基因工程制藥第一節(jié)概述第二節(jié)基因藥物生產(chǎn)的基本過程第三節(jié)目的基因的獲得第四節(jié)基因表達(dá)第五節(jié)基因工程菌的穩(wěn)定性第六節(jié)基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)第七節(jié)基因工程菌發(fā)酵第八節(jié)基因工程藥物的分離純化第九節(jié)基因工程藥物的品質(zhì)控制第十節(jié)基因工程藥物製造實(shí)例第一節(jié)概述生物技術(shù)的核心就是基因工程，基因工程技術(shù)最成功的應(yīng)用就是用於生物治療的新型生物藥物的研製。傳統(tǒng)生物藥物由於來源及製備上的困難、價(jià)格等因素的影響，此外在製備過程可能受到的病毒、衣原體、支原體等的感染等問題，促使人們尋求安全、實(shí)用、療效可靠的新方法來製備生物藥物?；蚬こ陶谥饾u顯示其在生物技術(shù)藥物製備上的優(yōu)勢。應(yīng)用基因工程技術(shù)可十分方便且有效地解決上述提到的問題，從量、質(zhì)上都可以得到改進(jìn)，且可以創(chuàng)造全新物質(zhì)。如今，癌癥、病毒性疾病、心血管疾病以及內(nèi)分泌等方面的預(yù)防、治療和診斷已可通過基因工程技術(shù)獲得。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)：（1）可以大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細(xì)胞因數(shù)等），為臨床使用提供有效的保障；（2）可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用範(fàn)圍；（3）利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)：（4）內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不足之處，可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除。如白細(xì)胞介素-2的第125位半胱氨酸是游離的，有可能引起-S-S-鍵的錯(cuò)配而導(dǎo)致活性下降，如將此半胱氨酸改為絲氨酸或丙氨酸，白細(xì)胞介素-2的活性以及熱穩(wěn)定性均有提高；（5）利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源?；蚬こ碳夹g(shù)可將不同種類和用途的基因，在原核細(xì)胞中表達(dá)的特性使其不僅在醫(yī)藥，而且在很多行業(yè)中都會(huì)有重要的應(yīng)用。第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程基因工程技術(shù)就是將重組對象的目的基因插入載體，拼接後轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建工程菌（或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，並使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行複製和表達(dá)的技術(shù)。基因工程藥物製造的主要程式是：目的基因的克隆，構(gòu)建DNA重組體，將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌，工程菌的發(fā)酵，外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，產(chǎn)品的檢驗(yàn)等。以上程式中的每個(gè)階段都包含若干細(xì)緻的步驟，這些程式和步驟將會(huì)隨研究和生產(chǎn)條件的不同而改變。獲得目的基因組建重組質(zhì)粒培養(yǎng)工程菌構(gòu)建基因工程菌或細(xì)胞產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定包裝成品檢定基因工程藥物製備的一般過程基因工程藥物生產(chǎn)的上游和下游上游：主要指的是目的基因分離、工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建。上游階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成；下游：主要指的是從工程菌（或細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、品質(zhì)控制等。工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建中重要的工具該過程中重要的工具便是酶：限制性內(nèi)切酶和連接酶是將所需目的基因插入適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)?；蚴删w中並轉(zhuǎn)入大腸桿菌或其他宿主菌（細(xì)胞）大量複製目的基因過程中的重要工具。同時(shí)為保證目的基因的正確性，對目的基因要進(jìn)行限制性內(nèi)切酶和核苷酸序列分析?；虮磉_(dá)系統(tǒng)就是上述的工程菌或細(xì)胞，有原核生物和真核生物兩類表達(dá)系統(tǒng)；選擇基因表達(dá)的系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)蛋白質(zhì)的功能，其次要考慮的是表達(dá)量的多少和分離純化的難易。下游階段在產(chǎn)業(yè)化中是極其重要的下游階段是將實(shí)驗(yàn)室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研製，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的製備技術(shù)，生物感測器等一系列儀器儀錶的設(shè)計(jì)和製造，電子電腦的優(yōu)化控制等。工程菌的發(fā)酵工藝不同於傳統(tǒng)的抗生素和氨基酸發(fā)酵，需要對影響目的基因表達(dá)的因素進(jìn)行分析，對各種影響因素進(jìn)行優(yōu)化，建立適於目的基因高效表達(dá)的發(fā)酵工藝，同時(shí)建立一系列相應(yīng)的分離純化、品質(zhì)控制、產(chǎn)品保存等技術(shù)。第三節(jié)目的基因的獲得對於目的基因的獲得需要根據(jù)目的基因的來源採取適當(dāng)?shù)姆椒?。對於真核?xì)胞來源的目的基因，是不能直接進(jìn)行分離的。真核細(xì)胞中單拷貝基因僅是染色體DNA中的很小一部分，即使多拷貝基因也是極少的，因此從染色體中分離純化目的基因是很困難的。另外，原核表達(dá)系統(tǒng)是有局限性的，主要是由於真核基因的內(nèi)含子及基因的後翻譯過程，所以真核系統(tǒng)得到了相應(yīng)發(fā)展。第三節(jié)目的基因的獲得目前克隆真核基因常用的方法有逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法一、逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然後進(jìn)行cDNA的克隆表達(dá)。為了克隆編碼某種特異蛋白質(zhì)多肽的DNA序列，可從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取mRNA，以其為範(fàn)本，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白質(zhì)mRNA的互補(bǔ)DNA（cDNA第一鏈），再以cDNA第一鏈為範(fàn)本，在逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA序列。cDNA與範(fàn)本mRNA序列嚴(yán)格互補(bǔ)，而不含內(nèi)含子。第三節(jié)目的基因的獲得一、逆轉(zhuǎn)錄法1、mRNA的純化2、cDNA第一鏈的合成3、cDNA第二鏈的合成4、cDNA克隆5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞6、cDNA文庫的鑒定7、目的cDNA克隆的分離和鑒定cDNA克隆示意圖mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNADNA多聚酶IKlenow片段逆轉(zhuǎn)錄酶ds-cDNAds-cDNA1、mRNA的純化分離純化目的基因的mRNA是極其困難的，細(xì)胞內(nèi)含有3種以上的RNA，mRNA占細(xì)胞內(nèi)總RNA總量的2%~5%，相對分子品質(zhì)大小很不一致，由幾百到幾千個(gè)核苷酸組成。在真核細(xì)胞中mRNA的3‘末端常常含有一多聚腺苷酸polyA組成的末端，長達(dá)20~250個(gè)腺苷酸，可採用OligodT-纖維素，以親和層析法將mRNA從細(xì)胞總RNA中分離出來。洗脫方法是高濃度鹽溶液使mRNA特異結(jié)合於寡聚dT，再以低鹽溶液和蒸餾水將其洗脫，經(jīng)過兩次寡聚dT，可得到較純的mRNA。2、cDNA第一鏈的合成一般mRNA都帶有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。在合成反應(yīng)體系中加入一種放射性標(biāo)記的dNTP，在反應(yīng)中以及反應(yīng)後可通過測定放射性標(biāo)記的dNTP摻入量，計(jì)算出cDNA的合成效率；在凝膠電泳後，進(jìn)行放射自顯影分析產(chǎn)物的分子大小，探索最佳反應(yīng)條件。一次好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可使寡聚dT選出的mRNA有5%~30%被拷貝。3、cDNA第二鏈的合成先用堿解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然後以cDNA第一鏈為範(fàn)本合成第二鏈。由於第一鏈cDNA鏈3‘末端往往形成一個(gè)髮夾形結(jié)構(gòu)，所以，可以從這一點(diǎn)開始合成cDNA第二鏈。此反應(yīng)是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1專一性切除單鏈DNA，因此用它可以切除髮夾結(jié)構(gòu)。髮夾結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)切除後，雙鏈cDNA分子的大小常用變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測定。4、cDNA克隆用於cDNA克隆的載體有兩類：質(zhì)粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌體DNA（如

gt10、

gt11等）。根據(jù)重組後插入的cDNA是否能夠表達(dá)、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)，又將載體分為表達(dá)型和非表達(dá)型載體。pUC及gt11為表達(dá)型載體，在cDNA插入位置的上游具有啟動(dòng)基因順序；而pBR322及gt10為非表達(dá)型載體。在cDNA克隆操作中應(yīng)該根據(jù)不同的需要選擇適當(dāng)?shù)妮d體。cDNA插入片段小於10kb，可選質(zhì)粒載體，如大於10kb則應(yīng)選用噬菌體DNA為載體。選用表達(dá)型載體可以增加目的基因的篩選方法，有利於目的基因的篩選。cDNA文庫R.Young和R.Davis設(shè)計(jì)的

gt10和gt11是噬菌體克隆載體，可用於構(gòu)建cDNA文庫。一方面它們具有較高的克隆效率，1ngcDNA可產(chǎn)生5000個(gè)克隆，另一方面又可容納較大分子量的外源DNA片段。因?yàn)楹Y選噬菌斑在技術(shù)操作上較篩選細(xì)菌菌落更方便，因此gt10和gt11類載體在構(gòu)建文庫時(shí)優(yōu)於質(zhì)粒載體pBR322。

gt10載體在合適的宿主中，

gt10載體對於未攜帶cDNA的噬菌體的裂解生長有很強(qiáng)的生物學(xué)選擇作用。cDNA插入到gt10中可使噬菌體阻礙物基因（cI）失活。當(dāng)用大腸桿菌c600的突變型hflA（高頻溶原性）作為宿主時(shí)，只有攜帶cDNA插入片段的噬菌體可形成噬菌斑，而在非突變型大腸桿菌c600宿主菌中，帶與不帶cDNA插入片段的噬菌體都可形成噬菌斑。

gt11載體

gt11則沒有類似gt10載體的選擇作用，但它是蛋白質(zhì)表達(dá)的cDNA克隆載體。

gt11的宿主菌是大腸桿菌Y1090。

gt11中cDNA插入片段是克隆在-半乳糖苷酶基因編碼區(qū)（lacZ）的羧基端，在含IPTG（isopropylthio--D-galactoside,異丙基硫代--D-半乳糖苷）和X-gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside,5-溴-4氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）的平板上，帶cDNA插入片段的gt11可形成清晰的無色噬菌斑，未帶cDNA插入片段的gt11則形成藍(lán)色噬菌斑。cDNA插入片段的翻轉(zhuǎn)產(chǎn)物可表達(dá)成半乳糖苷酶-cDNA融合蛋白。cDNA片段與載體的連接方法一：加同聚尾連接，用3‘末端去氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化，使載體與cDNA的3’末端帶上互補(bǔ)的同型多聚體序列，如載體加上polyC（或A）的尾巴，則cDNA加上polyG（或T）的尾巴，這兩種粘性末端只能使載體與cDNA連接而不能自我環(huán)化，借助同型多聚體的退火作用形成重組分子，最後用T4DNA連接酶封口。方法二：加人工接頭連接，用T4DNA連接酶在平末端接上人工接頭可以使DNA發(fā)生連接。所謂人工接頭是指人工合成的、連接在目的基因兩端的含有某些限制酶切位點(diǎn)的寡核苷酸片段。cDNA連上人工接頭後，用該種限制酶酶切就可得到粘性末端，從而能夠與載體連接；cDNA中也可能也帶有同樣的限制酶切點(diǎn)，為了保護(hù)cDNA不受限制酶破壞，可在加接頭前用甲基化酶修飾這些限制酶切位點(diǎn)。5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞體外包裝的噬菌體，感染感受態(tài)大腸桿菌形成噬菌斑；或轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌使質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。6、cDNA文庫的鑒定根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑顏色改變法。然後採用凝膠電泳、分子雜交、DNA序列分析測定等方法進(jìn)行進(jìn)一步篩選和鑒定。7、目的cDNA克隆的分離和鑒定從cDNA文庫中分離特異的cDNA克隆，主要採用：（1）核酸探針雜交法。用層析和高分辨電泳等技術(shù)純化微克量的目的蛋白質(zhì)，根據(jù)目的蛋白質(zhì)純品的氨基酸序列分析結(jié)果，人工合成相應(yīng)的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫中分離特異cDNA克隆。（2）免疫反應(yīng)鑒定法。在既無可供選擇的基因表型特徵，又無合適探針的情況下，本法是重要途徑。用表達(dá)型載體構(gòu)建的cDNA文庫，可用免疫學(xué)方法分組逐一鑒定各cDNA的表達(dá)產(chǎn)物，即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找相應(yīng)的特異cDNA克隆。分離得到含有目的基因的陽性克隆後，必須對其作進(jìn)一步的驗(yàn)證和鑒定，主要是進(jìn)行限制酶圖譜的繪製、雜交分析、基因定位、基因測序以及確定基因的轉(zhuǎn)錄方向、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)等。1985，PCR發(fā)明以後，RT-PCR得到了廣泛的應(yīng)用。二、化學(xué)合成法人工化學(xué)合成的限制：一不能合成太長的基因，50~60bp；二是人工合成時(shí)，遺傳密碼的簡並性可導(dǎo)致中性突變；三是費(fèi)用較高。第四節(jié)基因表達(dá)進(jìn)行基因研究，我們主要關(guān)心的是目的基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。因此在進(jìn)行基因表達(dá)設(shè)計(jì)時(shí)，需綜合考慮各種影響因素以建立最佳基因表達(dá)體系。一、宿主細(xì)胞的選擇對於宿主細(xì)胞其應(yīng)該：容易獲得較高濃度的細(xì)胞；能利用易得廉價(jià)原料；不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；容易進(jìn)行代謝調(diào)控；容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作；產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取純化?；虮磉_(dá)有兩類宿主細(xì)胞：一類是原核細(xì)胞，目前常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈黴菌等；另一類是真核細(xì)胞，常用的有酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。1、原核細(xì)胞-1（1）大腸桿菌大腸桿菌表達(dá)基因工程產(chǎn)物的形式：細(xì)胞不溶性表達(dá)（包含體）、細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)等，極少數(shù)情況下還可分泌到細(xì)胞外表達(dá)。不同的表達(dá)形式具有不同的表達(dá)水準(zhǔn)，且雜質(zhì)的含量和種類也會(huì)變化。大腸桿菌中的表達(dá)的特點(diǎn)：①不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物；②分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，產(chǎn)物須在下遊處理過程中經(jīng)過變性和複性處理才能恢復(fù)其生物活性；③不存在翻譯後修飾作用；④翻譯通常從甲硫氨酸的AUG密碼子開始，故目的蛋白質(zhì)的N端常多餘一個(gè)甲硫氨酸殘基，容易引起免疫反應(yīng)；⑤產(chǎn)生的內(nèi)毒素難以除去；⑥產(chǎn)生的蛋白質(zhì)酶會(huì)破壞蛋白質(zhì)。1、原核細(xì)胞-2（2）枯草芽孢桿菌分泌能力強(qiáng)，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包含體。該菌也不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化，另外由於它有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會(huì)對產(chǎn)物進(jìn)行不同程度的降解，因此在外源基因克隆表達(dá)的應(yīng)用中受到影響。1、原核細(xì)胞-3（3）鏈黴菌其是重要的工業(yè)微生物，近年來作為外源基因表達(dá)體系正日益受到人們的重視。其主要特點(diǎn)是：不致病、使用安全，分泌能力強(qiáng)，可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力，變鉛青鏈黴菌限制修飾能力弱，可以作為理想的受體菌?，F(xiàn)已構(gòu)建了一系列有效的載體，下游培養(yǎng)工藝也已經(jīng)成熟。2、真核細(xì)胞-1（1）酵母特點(diǎn)：①真核生物細(xì)胞，故有後翻譯過程；②基因組小，僅為大腸桿菌的4倍；③世代時(shí)間短，有單倍體和雙倍體兩種形式；④基因操作與原核生物相似；⑤可以建立有分泌功能的表達(dá)系統(tǒng)，將產(chǎn)物分泌出胞外，分離純化工藝相對簡單。在各種酵母中以釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的應(yīng)用歷史最為悠久，研究資料也最豐富。2、真核細(xì)胞-2（2）絲狀真菌近年來，，已在約30種以上絲狀真菌中建立了DNA轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其特點(diǎn)是：有很強(qiáng)的蛋白分泌能力；能正確進(jìn)行翻譯後加工，包括肽剪切和糖基化等，而且其糖基化方式與高等真核生物相似；絲狀真菌（如麯黴等）等又確認(rèn)是安全菌株，有成熟的發(fā)酵和後處理工藝。2、真核細(xì)胞-3（3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞由於外源基因的表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)成分完全由人控制，從而使產(chǎn)物純化變得容易。哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的基因產(chǎn)物是糖基化的，接近或類似於天然產(chǎn)物。但動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)慢，產(chǎn)率低，且培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度較稀。二、大腸桿菌中的基因表達(dá)1、載體表達(dá)載體必須具備的條件（1）載體能獨(dú)立地進(jìn)行複製：分嚴(yán)緊型和鬆弛型，前者在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)僅1~3個(gè)，後者在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)可高達(dá)3000個(gè)。（2）應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，以利於外源基因的克隆、鑒定和篩選，且克隆位點(diǎn)位於啟動(dòng)子序列後，以便外源基因表達(dá)。（3）應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA酶所識(shí)別。表達(dá)載體必須具備的條件（4）應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。阻遏子的阻遏作用可以由物理（如溫度）、化學(xué)（如IPTG、IAA等）因素進(jìn)行調(diào)節(jié)，因而可人為地選擇啟動(dòng)子啟始轉(zhuǎn)錄mRNA的時(shí)機(jī)，以獲得外源蛋白質(zhì)表達(dá)合成的最佳時(shí)機(jī)。外源基因的高效表達(dá)往往會(huì)抑制宿主細(xì)胞的生長、增殖，而阻遏子可使宿主細(xì)胞免除此不良影響。表達(dá)載體必須具備的條件（5）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無關(guān)的基因，同時(shí)，很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，由於強(qiáng)啟動(dòng)子所致的高水準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反過來還會(huì)影響質(zhì)粒DNA本身的複製，從而引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定或脫質(zhì)粒現(xiàn)象，因此表達(dá)載體需在外源基因的下游安置一個(gè)強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子，以克服由質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄引進(jìn)的質(zhì)粒不穩(wěn)定。表達(dá)載體必須具備的條件（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列（Shine-Dalgarnosequence），以便轉(zhuǎn)錄後能順利翻譯。大家可以翻到書本73面，其中介紹了兩個(gè)基因工程藥物研究中常用的表達(dá)載體。pBV220系統(tǒng)和pET系統(tǒng)。2、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素（1）外源基因的拷貝數(shù)（2）外源基因的表達(dá)效率：啟動(dòng)子的強(qiáng)度、核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性、SD序列和起始密碼ATG的間距、密碼子的組成等都會(huì)不同程度地影響外源基因的表達(dá)效率。（3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：①組建融合蛋白；②利用大腸桿菌的信號肽或真核多肽中自身的信號肽；③採用位點(diǎn)突變的方法；④選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞，可能會(huì)減弱表達(dá)產(chǎn)物的降解。如黃嘌呤核苷（Ion）是大腸桿菌合成蛋白酶的主要底物，Ion-營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌不能合成黃嘌呤核苷，從而不能合成蛋白酶，減少了表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞體內(nèi)的降解。2、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素（4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷外源基因的表達(dá)產(chǎn)物屬於異己物質(zhì)，並可能對宿主細(xì)胞有毒性。調(diào)節(jié)表達(dá)物質(zhì)的積累與細(xì)胞的生長和代謝之間的平衡有利於外源基因的高效表達(dá)。另外通過將細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，或?qū)⑺拗骷?xì)胞的生長與重組質(zhì)粒的複製分開兩種手段也可以減輕細(xì)胞代謝的負(fù)荷。形成不溶性的包含體可以降低表達(dá)產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的毒害作用2、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素（5）工程菌的培養(yǎng)條件除宿主、載體和克隆基因三者之間的關(guān)係影響外源基因的高水準(zhǔn)表達(dá)外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。以後會(huì)對其進(jìn)行詳細(xì)的介紹。3、真核基因早大腸桿菌中的表達(dá)形式（1）融合蛋白的形式（2）非融合蛋白的形式：指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含任何細(xì)菌多肽序列。為此，表達(dá)非融合蛋白的操縱子必須改建成：細(xì)菌或噬菌體的啟動(dòng)子—細(xì)菌的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）—真核基因的起始密碼子—結(jié)構(gòu)基因—終止密碼。要表達(dá)非融合蛋白，要求SD序列與翻譯起始密碼ATG之間的距離要適合，SD序列與翻譯起始密碼ATG之間即使只改變2~3個(gè)堿基，表達(dá)效率也會(huì)受到很大的影響。非融合蛋白易被蛋白酶破壞，其N端常帶有甲硫氨酸，可引起人免疫反應(yīng)。3、真核基因早大腸桿菌中的表達(dá)形式（3）分泌型表達(dá)蛋白藥物基因：外源蛋白的表達(dá)是通過將外源基因融合到編碼原核蛋白信號肽序列的下游來實(shí)現(xiàn)的。利用大腸桿菌的信號肽，構(gòu)建分泌型表達(dá)質(zhì)粒，常用的信號肽有鹼性磷酸酶信號肽（phoA）、膜外周質(zhì)蛋白信號肽（OmpA）、霍亂弧菌毒素B亞單位（CTXB）等。特點(diǎn)：一些可被胞內(nèi)蛋白酶所降解的蛋白質(zhì)在周質(zhì)中是穩(wěn)定的；由於有些蛋白質(zhì)能按一定的方式折疊，所以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)無活性的蛋白質(zhì)分泌表達(dá)時(shí)卻具有活性；蛋白信號肽和編碼序列之間能被切割，因而分泌蛋白質(zhì)不含起始密碼ATG所編碼的甲硫氨酸等。但是，產(chǎn)量不高、信號肽不被切割或不在特定位置上切割等。三、酵母中的基因表達(dá)酵母表達(dá)系統(tǒng)是隨著酵母質(zhì)粒和酵母轉(zhuǎn)化技術(shù)的建立而逐步發(fā)展起來的，其與其它表達(dá)系統(tǒng)一樣，包括載體、啟動(dòng)子等控制序列和宿主細(xì)胞3個(gè)部分。1、載體——（1）載體的複製序列（1）載體的複製序列：根據(jù)來自酵母的複製序列的構(gòu)成和特性。載體可以分為四大類：①Yep類（yeastepisomalplasmid，酵母附加體質(zhì)粒），這類載體的複製序列為酵母2質(zhì)粒成分。2質(zhì)粒是多數(shù)釀酒酵母中天然存在的質(zhì)粒，長6.3kb，可獨(dú)立複製。將2質(zhì)粒中複製起點(diǎn)區(qū)及REp3基因區(qū)的序列引入載體，就足以維持在大多數(shù)酵母株系中的複製能力。以2質(zhì)粒為基礎(chǔ)的載體，因具有較高的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)化頻率和穩(wěn)定性而被廣泛使用。②Ypp類（yeastreplicationplasmid，酵母複製型質(zhì)粒）此類載體的複製序列是非2來源的自主複製序列（autonomousreplicationsequence，ARS），可來自酵母染色體，也可來自其他生物。此類載體穩(wěn)定性差，拷貝數(shù)也少，轉(zhuǎn)化頻率為103~105/gDNA。1、載體——（1）載體的複製序列③YCp；類（yeastcentromericplasmid，酵母著絲粒質(zhì)粒）此類載體的複製序列也屬於ARS，並且含有酵母染色體中心粒成分，有的還引入酵母染色體端粒成分。它們作為一種類似染色體的單位參與細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂，在子代細(xì)胞中精確地分配，因此有很好的穩(wěn)定性。但它們的拷貝數(shù)只有1個(gè)，轉(zhuǎn)化頻率為103~104/gDNA。1、載體——（1）載體的複製序列④YIp類（yeastinteegrativeplasmid，酵母整合型質(zhì)粒），此類載體含有可與酵母染色體重組的序列，可以完全整合到染色體中。因此它依靠酵母染色體進(jìn)行複製，具有很好的穩(wěn)定性。拷貝數(shù)只有一個(gè)，轉(zhuǎn)化頻率為1~100/gDNA。1、載體——（2）克隆載體從大腸桿菌中製備質(zhì)粒比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和製備大部分是通過大腸桿菌進(jìn)行的，只有在最後階段才轉(zhuǎn)入酵母中，這就要求酵母載體也同時(shí)具有在大腸桿菌中複製和增殖的能力。為此，向酵母載體中引入大腸桿菌質(zhì)粒pBR322的ori部分和Ampr或Tetr部分，這樣構(gòu)成的載體同時(shí)帶有細(xì)菌和酵母的複製原點(diǎn)和選擇標(biāo)記。酵母最常使用的選擇性標(biāo)記是某些氨基酸或核苷酸合成酶系基因，也可以是利用抗性基因作為選擇性標(biāo)記?？寺≥d體既可以在細(xì)菌中進(jìn)行質(zhì)粒複製和表型選擇，又能在酵母中進(jìn)行質(zhì)粒複製和表型選擇。1、載體——（3）表達(dá)載體將酵母菌的啟動(dòng)子和終止子等有關(guān)控制序列引入載體的適當(dāng)位點(diǎn)後，就構(gòu)成了酵母菌的表達(dá)載體。酵母菌的表達(dá)載體有兩類：普通表達(dá)載體和精確表達(dá)載體，前者只能方便地引入外源基因並進(jìn)行表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對其N末端氨基酸是否增減並無嚴(yán)格要求。後者要求在啟動(dòng)子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶點(diǎn)，以利於接入外源基因，並使他在表達(dá)後加工後N末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無多餘的氨基酸，也無缺失的氨基酸2、影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素（1）外源基因的拷貝數(shù)外源基因通常是由多拷貝的質(zhì)粒載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的，質(zhì)粒的拷貝數(shù)及其在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性對外源基因的表達(dá)起決定作用。有些質(zhì)粒在導(dǎo)入宿主細(xì)胞後，在傳代培養(yǎng)中很快丟失，不能用於工業(yè)生產(chǎn)。通過整合質(zhì)粒，將外源基因整合到宿主染色體上，雖然很穩(wěn)定，但通常只有一個(gè)拷貝，不能高效表達(dá)。高穩(wěn)定的高拷貝數(shù)的質(zhì)粒可使外源基因高效表達(dá)，但高拷貝數(shù)通常會(huì)引起細(xì)胞生長量的降低；而單拷貝數(shù)的質(zhì)粒對細(xì)胞的最大生長沒有影響，因而也能達(dá)到高效表達(dá)。（2）外源基因的表達(dá)效率—啟動(dòng)子外源基因在酵母中表達(dá)的效率主要與啟動(dòng)子、分泌信號和終止序列有關(guān)。①啟動(dòng)子“表達(dá)框架”。啟動(dòng)子是由上游啟動(dòng)序列和保留的近端啟動(dòng)子組成。近端啟動(dòng)子含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄所必需的TATA序列和mRNA起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)—起始密碼子。終止區(qū)含有終止mRNA轉(zhuǎn)錄所需的信號。（2）外源基因的表達(dá)效率—啟動(dòng)子在酵母菌中經(jīng)常利用的啟動(dòng)子有組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，不同啟動(dòng)子對不同外源基因的表達(dá)水準(zhǔn)的調(diào)節(jié)作用明顯不同。啟動(dòng)子類型所用的基因基因符號組成型磷酸甘油酸激酶PGK烯醇酶ENOL3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH乙醇脫氫酶1ADH1磷酸三糖異構(gòu)酶TRI資訊素-因數(shù)

MF

1誘導(dǎo)型細(xì)胞色素CCYC1酸性磷酸脂酶

PHO5半乳糖激酶

GAL1

UDP-D-半乳糖-4-差向酶

GAL10（2）外源基因的表達(dá)效率—啟動(dòng)子②分泌信號的效率。分泌信號包括信號肽部分以及前導(dǎo)肽部分的編碼序列，它幫助後面的表達(dá)產(chǎn)物分泌出酵母細(xì)胞，並在適當(dāng)?shù)牟课挥砂麅?nèi)蛋白酶加工切斷表達(dá)產(chǎn)物和前導(dǎo)肽之間的肽鍵，產(chǎn)生正確的表達(dá)產(chǎn)物。分泌信號是酵母菌表達(dá)蛋白的起始分泌、糖基化和蛋白折疊加工等不可缺少的因素。③終止序列的影響：終止序列保證產(chǎn)物（mRNA）在適當(dāng)部位終止和加上polyA尾部，這樣形成的mRNA可能比較穩(wěn)定並被有效地翻譯。在酵母中表達(dá)的人工合成基因一般不含終止序列，必須借用外加的終止序列或載體上現(xiàn)有的終止序列。常用的外加終止序列有ADH1、CYC1、MF

1和PGK。（3）外源蛋白的糖基化外源蛋白在酵母細(xì)胞中可發(fā)生N-糖苷鍵（天冬醯胺連接）和O-糖苷鍵（絲氨酸或蘇氨酸連接）的兩種不同的糖基化，與哺乳動(dòng)物中發(fā)生的糖基化相同。外源蛋白經(jīng)釀酒酵母合成、氨基末端修飾、二硫鍵形成、蛋白質(zhì)折疊和糖基化後，可靠有效地以活性型分泌到培養(yǎng)基中，而且某些蛋白質(zhì)糖基化後更加穩(wěn)定，便於分離精製。（4）宿主菌株的影響不同的酵母菌株及其生理狀況對外源基因的表達(dá)有明顯的影響。表達(dá)用的酵母宿主菌株應(yīng)具備下列要求：①菌體生長力強(qiáng)；②菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱；③菌株性能穩(wěn)定，常用的幾乎是突變株，避免使用回復(fù)突變率高的不穩(wěn)定體系；最好使用二倍體或多倍體菌株；④分泌能力強(qiáng)。四、動(dòng)物中的基因表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)物類似於天然產(chǎn)物，容易分離純化缺點(diǎn)：動(dòng)物細(xì)胞生長慢，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高培養(yǎng)液濃度較小。書中第82頁表3-2對大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞3類主要基因工程表達(dá)體系簡要進(jìn)行了比較。第五節(jié)基因工程菌的穩(wěn)定性一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因工程菌的質(zhì)粒由於分裂的原因而不穩(wěn)定；質(zhì)粒的拷貝數(shù)所決定的不穩(wěn)定；培養(yǎng)條件：比生長速率控制；質(zhì)粒穩(wěn)定性分析方法：先在不含抗性標(biāo)記培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再於含抗性標(biāo)記培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)比值計(jì)算質(zhì)粒的穩(wěn)定性。二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法為提高培養(yǎng)過程中質(zhì)粒的穩(wěn)定性，一般採用兩階段法，第一階段先使菌體生長至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。在培養(yǎng)基中加入選擇性壓力如抗生素等，以抑制質(zhì)粒丟失菌的生長，也是提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法。採用適當(dāng)?shù)牟僮鞣绞娇墒构こ叹L速率具有優(yōu)勢，並使工程菌和質(zhì)粒丟失菌生長競爭趨於極端化?？烧{(diào)控的環(huán)境參數(shù)為溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度。通過間隙供氧和改變稀釋速率都可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。第六節(jié)基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)菌體生長是菌體各成分尤其是生物大分子——核酸和蛋白質(zhì)合成的綜合表現(xiàn)，通常用比生長速率表示。碳源、補(bǔ)料或稀釋速率可調(diào)控菌體生長。控制菌體生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物的積累、提高外源蛋白產(chǎn)率方面都具有一定的意義。一、菌體的生長和能量的關(guān)係二、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)係第七節(jié)基因工程菌發(fā)酵基因工程菌的培養(yǎng)過程主要包括：①通過搖瓶操作瞭解工程菌生長的基礎(chǔ)條件，如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分以及碳氮比，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對受體細(xì)胞的影響；②通過培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制的方案和順序。一、基因工程菌的培養(yǎng)方式1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)2、連續(xù)培養(yǎng)3、透析培養(yǎng)4、固定化培養(yǎng)二、基因工程菌的發(fā)酵工藝探索基因工程菌的培養(yǎng)影響因素，並進(jìn)行優(yōu)化或改進(jìn)：1、培養(yǎng)基：選擇好2、接種量的影響：確定接種量是否優(yōu)化；3、溫度：選擇適當(dāng)?shù)臏囟?、溶解氧的影響5、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的選擇6、pH的影響三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備參見書本第91頁第八節(jié)基因工程藥物的分離純化生物技術(shù)產(chǎn)品一般是活性肽或蛋白質(zhì)，它們具有如下特點(diǎn)：①初始物料中含量低；②基體組成複雜；③穩(wěn)定性差；④種類多，包括大、中、小分子、結(jié)構(gòu)簡單或複雜的有機(jī)化合物，以及結(jié)構(gòu)複雜而又性質(zhì)各異的生物活性物質(zhì)；⑤應(yīng)用面廣，要求品質(zhì)、純度高，無菌無熱源等。一、建立分離純化工藝的根據(jù)1、含目的產(chǎn)物的起始物料的特點(diǎn)2、物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)3、目的產(chǎn)物特性4、產(chǎn)品品質(zhì)要求二、分離純化的基本過程一般包括如下幾個(gè)方面的過程：細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。書中給出了流程示意圖（圖3-7）。三、分離純化的技術(shù)分離純化要求：條件溫和、選擇性好收率高、兩個(gè)技術(shù)之間能直接銜接以及整個(gè)過程要快，能滿足高生產(chǎn)率的要求。1、細(xì)胞破碎與固液分離：收集—破碎—固液分離：離心、萃取、膜技術(shù)等2、目的產(chǎn)物的分離純化：色譜方法3、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除：主要是DNA、熱原質(zhì)和病毒。四、選擇分離純化方法的依據(jù)1、根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇（分泌型、可溶性2、根據(jù)單元之間的銜接來選擇：正確選擇分離純化的次序；3、根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇：穩(wěn)定性和重複性、儘量少步驟、組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)、儘量少的使用試劑、時(shí)間盡可能短、工藝和技術(shù)必須高效、高收率。第九節(jié)基因工程藥物的品質(zhì)控制一、原材料的控制二、培養(yǎng)過程的品質(zhì)控制三、純化工藝的品質(zhì)控制四、目標(biāo)產(chǎn)品的品質(zhì)控制五、產(chǎn)品的保存；低溫、穩(wěn)定pH下保存、高濃度保存、加保護(hù)劑；另外固態(tài)保存比液態(tài)穩(wěn)定，因此最好辦法是製成乾粉或晶體。第十節(jié)基因工程藥物製造示例抗體制藥第一節(jié)概述第二節(jié)單克隆抗體第三節(jié)鼠源性單克隆抗體的改造第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程第五節(jié)抗體診斷試劑第六節(jié)抗體治療藥物第一節(jié)概述1890年：Behring和北裏柴三郎等發(fā)現(xiàn)了白喉抗毒素，並建立了血清療法，開抗體制藥之先河。1937年：Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種（）球蛋白、乙種（）球蛋白和丙種（）球蛋白，並證明抗體活性主要存在於丙種球蛋白組分。20世紀(jì)60年代初期：抗原決定簇，精製單價(jià)血清。1975年：K?hler和Milstein等，單克隆抗體，其具有高度特異性、均一性，以及來源穩(wěn)定可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)。1984年：人-鼠嵌合抗體1984年至今：單克隆抗體的鼠源性及分子過大的問題得以解決，可僅作為與抗原特異性結(jié)合試劑。單克隆抗體的應(yīng)用用於疾病的診斷和治療：如利用單克隆抗體檢測與某些疾病相關(guān)的抗原，輔助臨床診斷，或用放射性核素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像，進(jìn)行免疫鑒定。用於臨床治療，如針對T淋巴細(xì)胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體，用作免疫抑制劑。單克隆抗體還可作為載體製備導(dǎo)向藥物。但是要解決以下兩個(gè)問題：（1）鼠源性單克隆抗體的免疫原性；（2）完整的抗體分子分子量過大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度。單克隆抗體的應(yīng)用基因工程技術(shù)為解決這兩個(gè)問題提供了可能。已通過基因工程技術(shù)，製備出改形抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識(shí)別單位等很多類型的抗體或抗體單位。基本消除了單克隆抗體的鼠源性，相對分子品質(zhì)只有完整抗體分子的1/80~1/3，而且鼠源性單克隆抗體的生物學(xué)活性如啟動(dòng)補(bǔ)體、促進(jìn)吞噬功能（免疫調(diào)理）、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等，只保留同抗原特異性結(jié)合的活性。第二節(jié)單克隆抗體單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而生產(chǎn)的。由於這種抗體是針對一個(gè)抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，因此稱為單克隆抗體。它是結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體。製備的一般流程見下圖。單克隆抗體和

多克隆抗體的製備抗原脾B淋巴細(xì)胞融合融合淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞克隆1克隆2克隆3克隆4第二節(jié)單克隆抗體一、抗原與動(dòng)物免疫二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)三、篩選陽性克隆與克隆化四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定五、單克隆抗體的大量製備六、單克隆抗體的純化一、抗原與動(dòng)物免疫（1）製備用於動(dòng)物免疫的適當(dāng)抗原?；瘜W(xué)合成抗原，如精製的地高辛。多數(shù)情況下抗原物質(zhì)只能得到部分純化，甚至是極不純的混合物，如部分純化的干擾素。通過克隆化選出最適當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w。在製備惡性腫瘤細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體時(shí)，情況較複雜，需用整個(gè)腫瘤細(xì)胞做為免疫原，經(jīng)過篩選、克隆化，製備出僅存在於腫瘤細(xì)胞而不存在於正常細(xì)胞上的表面標(biāo)誌分子上的單克隆抗體。一、抗原與動(dòng)物免疫（2）穩(wěn)定的雜交瘤的獲得因免疫動(dòng)物品系和骨髓瘤細(xì)胞在種系發(fā)生上距離越遠(yuǎn)，產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定，故一般採用與骨髓瘤供體同一品系的動(dòng)物進(jìn)行免疫。目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來自BALB/c小鼠和Lou大鼠，因此免疫動(dòng)物也多採用相應(yīng)的品系，最常用的也是BALB/c小鼠。選擇動(dòng)物時(shí)應(yīng)考慮到動(dòng)物品系的免疫應(yīng)答基因（Ir）對抗原免疫應(yīng)答的影響。不同品系的小鼠與大鼠在對某類抗原的免疫應(yīng)答上是不同的。書中表4-1是骨髓瘤細(xì)胞系一覽表，可以參考。一、抗原與動(dòng)物免疫（3）免疫方法：體內(nèi)免疫法和體外免疫法體內(nèi)免疫法：適用於免疫原性強(qiáng)、抗原量較多時(shí)應(yīng)用，一般用8~12周齡的雌性鼠。顆粒性抗原（如細(xì)菌、細(xì)胞抗原）的免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔107個(gè)細(xì)胞進(jìn)行初次免疫，間隔1~3周，再追加免疫1~2次，可溶性抗原則按每只小鼠10~100

g抗原與福氏完全佐劑等量混合後注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行初次免疫，間隔2~4周，再用不加佐劑的原抗原追加免疫1~2次。一般在採集脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最後一次抗原，其目的是使對應(yīng)的B淋巴細(xì)胞克隆受到可靠的最大限度的刺激，使其迅速地增殖分裂，因?yàn)榧?xì)胞融合後增殖最好的細(xì)胞是迅速分裂的細(xì)胞。有人認(rèn)為在常規(guī)免疫的基礎(chǔ)上用脾內(nèi)免疫法做追加免疫較佳。一、抗原與動(dòng)物免疫（3）免疫方法：體內(nèi)免疫法和體外免疫法體外免疫法：用於不能採用體內(nèi)免疫法的情況下，如製備人源性單克隆抗體，或者抗原的免疫原性極弱且能引起免疫抑制時(shí)使用。體外免疫法所需要的抗原量少，一般只需幾個(gè)

g，免疫期短，僅4~5天，干擾因素少，已成功製備出針對多種抗原的單克隆抗體，但融合後產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞株不夠穩(wěn)定。其基本方法是用4~8周齡BALB/c小鼠的脾臟製成單個(gè)細(xì)胞懸液，再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá)0.5~5g/ml，在5%CO2、37℃下培養(yǎng)4~5天，再分離脾臟細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合。二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)（1）細(xì)胞融合基本方法：取適量脾細(xì)胞（1×108）與骨髓瘤細(xì)胞（2×107~3×107）進(jìn)行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，時(shí)間控制在2min以內(nèi)，然後用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。（2）用於融合的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備條件：融合率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長期穩(wěn)定等特點(diǎn)。書中表4-1列舉了主要的骨髓瘤細(xì)胞系，其中SP2/0、P3.653細(xì)胞本身不分泌抗體，細(xì)胞融合後產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞只分泌均一的、完全來自脾細(xì)胞的抗體分子，它們是目前較為理想的可供融合的骨髓瘤細(xì)胞。特別是SP2/0細(xì)胞系還具有容易培養(yǎng)、融合率高等特點(diǎn)，被國內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室廣泛採用。二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)（3）誘導(dǎo)劑PEG的影響：PEG分子量以及濃度越大，促融率越高。但其粘度和對細(xì)胞的毒性也隨之增大。目前常用的PEG的濃度為40%~50%，相對分子品質(zhì)以4000為佳。但相對分子量400~6000，濃度在10%~50%範(fàn)圍之間的PEG都能使細(xì)胞融合。為了提高融合率，在PEG溶液中加入二甲基亞碸(DMSO），以提高細(xì)胞接觸的緊密性，增加融合率。但是，PEG和DMSO都對細(xì)胞有毒性，必須嚴(yán)格限制它們和細(xì)胞的接觸時(shí)間，可通過低速離心5min使細(xì)胞接觸更為緊密，然後用新配製的培養(yǎng)液來稀釋藥物並洗滌細(xì)胞。二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)（4）培養(yǎng)基的正確選擇：常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配製的。其中氨基喋呤（A）能阻斷DNA合成的主要途徑，瘤-瘤融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞在這樣的條件下，幾天內(nèi)亦迅速死亡。由於SP2/0等骨髓瘤細(xì)胞都是次黃嘌呤（H）鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT）缺乏株，脾細(xì)胞中卻有這種酶，因此脾-瘤融合的雜交瘤細(xì)胞可利用HGPRT酶，用次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）合成DNA，使雜交瘤細(xì)胞得以生長二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)（5）選擇性培養(yǎng)方法：通常將融合的細(xì)胞懸浮於HAT的培養(yǎng)液（配方見書中表4-2），加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)，根據(jù)情況每2~3天換液一次。換液時(shí)吸去1/2~2/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液。在融合後7天內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，殺死瘤-瘤融合細(xì)胞後，第7~14天改用HT培養(yǎng)液，14天以後用普通的RPMI1640 完全培養(yǎng)液（配方書中表4-3），從融合後8~9天就可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測，篩選出產(chǎn)生抗體的陽性克隆。二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)（6）飼養(yǎng)細(xì)胞：由於在最適的條件下大約有105個(gè)脾細(xì)胞才能形成一個(gè)雜交瘤細(xì)胞，大量瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中相繼死亡，單個(gè)或少數(shù)的雜交瘤細(xì)胞多半不能存活，所以通常要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等。一般認(rèn)為飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放某些生長刺激因數(shù)，並能滿足雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還能清除死亡細(xì)胞，故應(yīng)用的較多。三、篩選陽性克隆與克隆化（1）篩選陽性克?。阂?yàn)楫a(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細(xì)胞只占所有脾細(xì)胞的5%左右，所以要進(jìn)行每孔培養(yǎng)上清的抗體活性的篩選工作，以選擇出陽性克隆，然後進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。為了儘快地篩選出陽性克隆，必須採用微量、快速、特異、敏感、簡便並一次能檢測大批標(biāo)本的方法。常用的檢測方法有免疫酶技術(shù)、免疫螢光技術(shù)和放射免疫技術(shù)等。一般來說，免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)均適用於可溶性抗原及顆粒性抗原的抗體檢測。免疫螢光技術(shù)適用於細(xì)胞抗原的抗體檢測，特別是製備以檢測患者活檢組織標(biāo)本為目的的抗體時(shí)，免疫螢光法更有意義，在篩選抗體的同時(shí)，還能對所識(shí)別的抗原進(jìn)行定位判定。1、精製破傷風(fēng)毒素抗原（）吸附（約10

g/ml，4℃，3h）洗滌2、加雜交瘤培養(yǎng)上清液（）（4℃，1h）3、加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體（）（4℃，1h）洗滌洗滌4、加酶作用底物，呈色孔為陽性克隆孔ELISA用於破傷風(fēng)抗體的篩選三、篩選陽性克隆與克隆化（2）克隆化——有限稀釋法和軟瓊脂法篩選出來的陽性克隆中，可能含有不分泌抗體的細(xì)胞或有多株分泌抗體的細(xì)胞，而且剛剛?cè)诤汐@得的雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，染色體容易丟失，因此應(yīng)儘早克隆化。一般融合後獲得的雜交瘤細(xì)胞要經(jīng)過大約3次的克隆化，才能達(dá)到100%孔內(nèi)均為抗體陽性細(xì)胞克隆。常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。有限稀釋法是把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋後，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每個(gè)孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。第一次克隆化時(shí)也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以後的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。由於單個(gè)細(xì)胞難以存活，克隆化時(shí)也需加入飼養(yǎng)細(xì)胞輔助其生長。三、篩選陽性克隆與克隆化（2）克隆化——有限稀釋法和軟瓊脂法軟瓊脂