食品生物化學實驗教案

食品生物化學實驗教案實驗一、激活劑、抑制劑、溫度及pH對酶活性的影響（3學時）目的要求通過實驗加深對酶性質(zhì)的認識，了解測定α-淀粉酶活力的方法。二、實驗原理酶是生物體內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì)，通常稱為生物催化劑。酶催化的反應稱為酶促反應。生物催化劑催化生化反應時具有：催化效率好、有高度的專一性、反應條件溫和、催化活力與輔基，輔酶，金屬離子有關(guān)等特點。能提高酶活力的物質(zhì)，稱為激活劑。激活劑對酶的作用有一定的選擇性，其種類多為無機離子和簡單的有機化合物。使酶的活力中心的化學性質(zhì)發(fā)生變化，導致酶的催化作用受抑制或喪失的物質(zhì)稱為酶抑制劑。氯離子為唾液淀粉酶的激活劑，銅離子為其抑制劑。應注意的是激活劑和抑制劑不是絕對的，有些物質(zhì)在低濃度時為某種酶的激活劑，而在高濃度時則為該酶的抑制劑。如氯化鈉達到約30%濃度時可抑制唾液淀粉酶的活性。酶促反應中，反應速度達到最大值時的溫度和PH值稱為某種酶作用時的最適溫度和PH值。溫度對酶反應的影響是雙重的：一方面隨著溫度的增加，反應速度也增加，直至最大反應速度為止；另一方面隨著溫度的不斷升高，而使酶逐步變性從而使反應速度降低。同樣，反應中某一PH范圍內(nèi)酶活力可達最高，在最適PH的兩側(cè)活性驟然下降，其變化趨勢呈鐘形曲線變化。食品級α-淀粉酶是一種由微生物發(fā)酵生產(chǎn)而制備的微生物酶制劑，主要由枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉等微生物產(chǎn)生。但不同菌株產(chǎn)生的酶在耐熱性、酶促反應的最適溫度、PH、對淀粉的水解程度，以及產(chǎn)物的性質(zhì)等均有差異。α-淀粉酶屬水解酶，作為生物催化劑可隨機作用于直鏈淀粉分子內(nèi)部的α-1,4糖苷鍵，迅速地將直鏈淀粉分子切割為短鏈的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉與碘的反應逐漸消失，這種作用稱為液化作用，生產(chǎn)上又稱α-淀粉酶為液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支鏈的α-1,6糖苷鍵，因此最終水解產(chǎn)物是麥芽糖、葡萄糖和α-1,6鍵的寡糖。本實驗通過淀粉遇碘顯藍色，糊精按其分子量的大小遇碘顯紫藍、紫紅、紅棕色，較小的糊精（少于6個葡萄糖單位）遇碘不顯色的呈色反應，來追蹤α-淀粉酶作用于淀粉基質(zhì)的水解過程，從而了解酶的性質(zhì)以及動力學參數(shù)。三、激活劑和抑制劑對唾液淀粉酶活力的影響（一）試劑及材料1、1：30唾液淀粉酶配置用蒸餾水漱口，1min后收集唾液，以1：30倍蒸餾水稀釋。2、0.2%可溶性淀粉稱取可溶性淀粉0.2g，預加20mL蒸餾水調(diào)勻，然后倒入80mL沸水中，繼續(xù)煮沸至溶液透明，冷卻后補水至100mL。3、1%NaCl溶液稱取1.0g氯化鈉，加水溶解稀釋至100mL。4、1%CuSO4溶液稱取1.0g硫酸銅，加水溶解稀釋至100mL。5、標準稀碘液稱取11g碘，22g碘化鉀，置研缽中，加入適量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀釋定容至500mL。吸取2mL上述碘液，加入10g碘化鉀，用水稀釋至500mL。（二）儀器設(shè)備電熱恒溫水浴鍋。（三）操作方法取試管3根，編號后按下表配置實驗樣液。試管序號0.2%可溶性淀粉1%NaCl1%CuSO4蒸餾水混勻，放入37℃水浴中保溫10min。立即加入唾液淀粉酶。1：30唾液淀粉酶12.0mL1.0mL//1.0mL22.0mL/1.0mL/1.0mL32.0mL//1.0mL1.0mL用點滴管并不斷從試管中吸取樣液于比色白瓷板，用稀碘液檢驗試管內(nèi)淀粉被淀粉酶水解的程度，記錄各試管內(nèi)樣液遇碘不顯藍色的先后順序，解釋實驗現(xiàn)象的原因。四、溫度與PH值對α-液化淀粉酶活力的影響（一）試劑與材料1、2%可溶性淀粉溶液稱取可溶性淀粉2.0g（預先在105℃烘干），預加20mL蒸餾水調(diào)勻，然后傾入80mL沸水中煮沸至溶液透明，冷卻后定容至100mL。2、PH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0磷酸氫二鈉–檸檬酸緩沖溶液（1）0.2mol/mLNa2HPO4稱取35.60gNa2HPO4.2H2O，用水溶解定容至100mL。（2）使用酸度計，用檸檬酸調(diào)整至所需的PH值。3、供試酶液的制備稱取固體α-液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氫二鈉–檸檬酸緩沖溶液100mL(緩沖液的加入量視酶活力大小而定，控制酶解反應在5-10min內(nèi)完成)，于40℃恒溫水浴中活化0.5小時，然后用3000rpm/min離心機離心分離5min，酶提取液于冰箱保存，供試驗用。4、標準比色液甲液：稱取氯化鈷（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重鉻酸鉀0.4748g，溶解并定容至500mL。乙液：稱取鉻黑T40.00mg，溶解并定容至100mL。使用時取甲液40.0mL、乙液5.0mL，混合?；旌媳壬阂朔胖帽浔４妫褂?天后5、標準稀碘（二）儀器設(shè)備電熱恒溫水浴鍋。（三）操作方法1、用滴管吸取一定量標準比色液于白色瓷比色板空穴中，作為判斷酶解反應終點的標準色。2、不同溫度對α-液化淀粉酶活力的影響取4根25×200mm試管，按下表配制反應溶液。試管序號12342%可溶性淀粉20.0mL20.0mL20.0mL20.0mLPH6.0緩沖液5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL把四根試管分別放入50℃、60℃、70℃、80℃恒溫水浴中預熱10min分別加供試酶液0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL反應完成時間記錄（min）50℃60℃70℃80℃加入供試酶液后，立即用秒表或手表記時，充分要勻，定時用點滴管從各反應試管中分別吸取1-2滴反應液，滴入預先盛有2/3稀碘液的比色白瓷板孔穴內(nèi)，從淀粉遇碘顯色的變化情況，跟蹤淀粉在淀粉酶作用下被水解的過程，當穴內(nèi)顏色反應由紫色逐漸變?yōu)榧t棕色，與標準比色液的顏色相同時，即達反應終點，記錄酶解反應完成所需時間。3、不同PH值對α-液化淀粉酶活力的影響取5根Φ25×200mm試管，按下表配制反應溶液。試管序號2%可溶性淀粉緩沖溶液恒溫水浴60℃預熱10min。供試酶液反應完成時間記錄（min）120mLPH4.05.0mL0.5mL320mLPH6.05.0mL0.5mL520mLPH8.05.0mL0.5mL其它操作與溫度對酶活力影響實驗相同。五、結(jié)果計算和討論淀粉酶活力單位定義為在一定條件下，1g酶制劑1小時內(nèi)液化可溶性淀粉的克數(shù)。酶活力單位(U/g)=式中：20——可溶性淀粉的用量（mL）；t——酶解反應完成所需的時間（min）；0.5——測定時稀釋酶液用量（mL）；0.02——可溶性淀粉溶液的濃度（g/mL）；n——酶制劑稀釋倍數(shù)1、不同溫度對α-液化淀粉酶活力影響的結(jié)果記錄實驗結(jié)果50℃60℃70℃80℃酶活力（U/g）2、不同pH值對α-液化淀粉酶活力影響的結(jié)果記錄實驗結(jié)果pH4.0pH6.0pH7.0pH8.0酶活力（U/g）分別以PH值、溫度為橫坐標，以酶活力單位為縱坐標，繪制PH值—酶活力單位、溫度—酶活力單位圖。討論分析實驗結(jié)果。六、思考題1、從實驗操作技能方面考慮，做好本實驗的操作要點是什么？2、實驗過程中若激活劑或抑制劑的作用不明顯，如何調(diào)整實驗方案？3、進行酶的生化實驗必須考慮控制哪些條件？為什么？4、生化反應用酶前對酶進行活力進行測定，對實驗有何實際指導意義？5、酶在干燥狀態(tài)下與在水溶液中保存，它的活性受溫度的影響是否相同？實驗二、卵磷脂提取、鑒定及乳化特性試驗（2學時）目的要求學習提取卵磷脂的方法，了解卵磷脂的乳化特性性質(zhì)。實驗原理磷脂是分子中含磷酸的復合脂，分為磷酸甘油脂和鞘氨醇磷脂類，其醇類物質(zhì)分別為甘油和鞘氨醇。磷脂酰膽堿屬磷酸甘油脂，俗名為卵磷脂，在生物體內(nèi)以及食品工業(yè)應用中起著重要的作用。卵磷脂是一種在動、植物中分布及廣的磷脂，如植物的種子、動物的卵、腦及神經(jīng)組織均含有之，其中大豆中含量約為2.0%、卵黃中含量高達8%—10%、。卵磷脂在細胞中以游離態(tài)或與蛋白質(zhì)結(jié)合成不穩(wěn)定的化合物存在，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機溶劑，不溶于丙酮。本實驗采用乙醇提取蛋黃中的卵磷脂。純卵磷脂為白色的蠟狀物，與空氣接觸后，因結(jié)構(gòu)含不飽和脂肪酸被氧化后而呈黃色至黃棕色，粗制品中色素的存在可使之呈淡黃色。卵磷脂中的膽堿基在堿性條件下可分解成三甲胺，三甲胺有特異的魚腥味，利用此性質(zhì)可鑒別卵磷脂。在生物體中的作用是保持細胞膜的通透性，控制動物體內(nèi)脂肝代謝，防止脂肪肝的形成。在食品工業(yè)中廣泛充當乳化劑、抗氧化劑和營養(yǎng)添加劑。使互不相溶的兩種液體中的一種呈微滴狀分散在另一種液體中的作用稱為乳化劑。這兩種不同的液體稱為“相”，在體系中量大的稱為連續(xù)相，量小的為分散相，能使互不相溶的兩相中的一相分散在另一相中的物質(zhì)稱為乳化劑。由卵磷脂的分子結(jié)構(gòu)可知：卵磷脂分子中的R1脂肪酸為硬脂酸或軟脂酸，R2脂肪酸為油酸、亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸等不飽和脂肪酸。脂肪酸殘基端具有憎水性，其膽堿殘基端具親水性，因此是一種天然的乳化劑。在乳化過程中，當少量的油與乳化劑一起在大量水中用高速攪拌混合機混合，油滴將以微滴狀分散在水相中，在細滴的表面上乳化劑以親油的非極性端相對，而以其親水的極性端伸向水中。由于極性相斥，體系中微滴之間的斥力比相互間的引力要大，因而形成穩(wěn)定的乳濁液。乳濁液的穩(wěn)定性與系統(tǒng)中各組分間的比例、乳化劑種類及其用量、乳化的機械條件等密切相關(guān)。食品工業(yè)中可從大豆油精練過程中獲得廉價卵磷脂。三、試劑及材料1、95%乙醇2、10%NaOH溶液稱取10g氫氧化鈉，用蒸餾水溶解并稀釋至100mL。3、雞蛋4、花生油四、儀器設(shè)備1、電熱恒溫水浴鍋2、磁力攪拌器3、高速電動攪拌機4、攝像顯微系統(tǒng)（由電腦、攝像頭、顯微鏡、攝像控制軟件組成）五、操作方法（一）卵磷脂的提取選新鮮雞蛋一個，輕輕在雞蛋兩頭擊破一小孔，讓蛋清從小孔流出，破殼取出蛋黃置小燒杯內(nèi)，搗爛，攪拌下加入50℃95%乙醇60mL，，保溫提取5min，冷卻過濾，將濾液置于瓷蒸發(fā)皿，水浴蒸干，殘留物即為卵磷脂。（二）鑒定卵磷脂1、三甲胺試驗：取少量本實驗提取的卵磷脂于試管內(nèi)，加入2mL10%NaOH,混勻，水浴加熱，嗅之是否產(chǎn)生魚腥味。2、丙酮溶解試驗：加入約5ml丙酮于裝有卵磷脂提取物的瓷蒸發(fā)皿，不斷用玻棒攪拌卵磷脂觀察其在丙酮中的溶解情況。同時也是提純卵磷脂的過程。（三）乳化試驗：取5克卵黃蛋白加入250ml的燒杯中，加入95ml水，0.5g氯化鈉，用電動攪拌器攪勻后，在不斷攪拌下滴加植物油10ml，滴加完后，強烈攪拌5min使其分散成均勻的乳狀液，靜置10min，待泡沫大部分消除后取出10ml，加入少量水浴性紅色素染色，不斷攪拌直至染色均勻，取一滴乳狀液在顯微鏡下仔細觀察，被染色部分為水相，未被染色部分為油相，根據(jù)顯微鏡下觀察所得到的燃料分布，確定該乳狀液是屬于水包油型還是油包水型。六、實驗結(jié)果討論分析七、思考題向卵磷脂粗品添加丙酮的作用是什么？可去除何種雜質(zhì)？3、使用生物顯微鏡的操作要點是什么？實驗三、生物氧化與電子傳遞（2學時）一實驗目的與要求1.掌握電子在電子傳遞鏈中的傳遞過程；2.了解體外實驗中研究電子傳遞鏈的方法。二實驗原理生物氧化過程中代謝物脫下的氫由NAD+或FAD接受生成還原型NADH或FADH2，再經(jīng)一系列電子傳遞體傳遞，最后與氧結(jié)合生成水。這些存在于線粒體內(nèi)膜上的氧化還原酶及其輔酶依次排列，順序地起傳遞電子或電子和質(zhì)子的作用，稱為電子傳遞鏈或呼吸鏈。在體內(nèi)，代謝中間產(chǎn)物琥珀酸在線粒體琥珀酸脫氫酶（輔酶FAD）的作用下脫氫氧化生成延胡索酸，脫下的氫使FAD還原成FADH2，再經(jīng)電子傳遞鏈傳遞，即FADH2→Q→細胞色素（b→c1→c→aa3），最后與氧結(jié)合生成水。在體外實驗中，組織細胞生物氧化生成琥珀酸的量可采用在琥珀酸脫氫時伴有顏色變化的化合物作氫受體來研究。本實驗以2，6-二氯酚錠酚（DPI）為氫受體，藍色的DPI從還原型黃素蛋白（FADH2）接受電子，生成無色的還原型DPI·2H，藍色消失，其反應過程如下：琥珀酸+FAD→延胡索酸+FADH2DPI（藍色）+FADH2→DPI·2H（無色）+FAD根據(jù)褪色時間可測定生物氧化過程中各代謝物與琥珀酸之間在代謝途徑中的距離。三、試劑及材料磷酸鉀緩沖溶液（PBS，50mmol/L，pH7.4）：0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液500ml和0.2mol/L氫氧化鈉溶液395ml混合加水至2000ml。豬心，2，6-二氯酚錠酚（1.5mmol/LPBS），葡萄糖溶液（90mmol/LPBS），琥珀酸溶液（90mmol/LPBS），乳酸溶液（90mmol/LPBS），NAD+（5mmol/L磷酸鹽緩沖溶液）。四、儀器設(shè)備絞肉機，紗布，細砂，研缽，冰浴，恒溫水浴。五、操作方法1.心肌提取液的制備稱取絞碎的心肌糜3g，置250ml燒杯中，加冰冷的去離子水200ml，攪拌1min，靜置1min，小心傾去水層，同法洗滌3次后，以細紗布過濾并輕輕擠壓除去過多液體。將肉糜轉(zhuǎn)移至冰冷的研缽中，加等量細砂和PBS5ml，在冰浴中研磨至糊狀，再加PBS15ml，抽提（至少5min），雙層紗布過濾，濾液收集于試管，置冰浴中備用。2.底物的氧化取6支試管編號，按下表依次加入各試劑（單位ml）管號123456DPI0.50.50.50.50.50.5葡萄糖溶液0.50.5————琥珀酸溶液——0.50.5——乳酸溶液————0.50.5NAD+0.5—0.5—0.5—PBS0.51.00.51.00.51.0將試管搖勻后于37℃中保溫5min，加已經(jīng)37℃水浴預保溫5分鐘的心肌提取液各1ml，混勻并繼續(xù)保溫。3.觀察觀察各管顏色變化，記錄各管褪色時間，30min不褪色者記為不褪色。分析實驗結(jié)果所說明的問題。六、注意事項1.無色（還原型）DPI·2H與氧接觸可重新氧化成藍色的（氧化型）DPI，所以觀察本實驗結(jié)果時切勿振搖試管。2.體外實驗亦可用甲烯藍作為受氫體，再類似實驗條件下藍色的甲烯藍（氧化型）受氫還原成無色甲烯藍（還原型）。七、思考題1.名詞解釋：電子傳遞鏈；氧化磷酸化作用；解偶聯(lián)作用；高能化合物2.實驗結(jié)果記錄及分析3.討論下列問題：常見的呼吸鏈電子傳遞抑制劑有哪些？它們的作用機制是什么？實驗四、肝組織核酸的分離與鑒定（3學時）一、實驗目的與要求驗證核酸的分子組成，掌握核酸部分組分的鑒定方法。二、實驗原理組織細胞中的核酸（RNA和DNA）大部分以核蛋白的形式存在，遇酸（三氯醋酸）后核酸和蛋白質(zhì)均被沉淀下來，棄去上清液。沉淀中的核酸又可溶于熱的10％NaCl(生成核酸鈉)，而蛋白質(zhì)不溶，再棄去沉淀，在上清液中加入乙醇使核酸鈉以沉淀形式析出。RNA與DNA均可被硫酸水解成：磷酸、有機堿（嘌呤堿和嘧啶堿）及戊糖（核糖或脫氧核糖），這三類化合物可用下述方法鑒定。磷酸與鉬酸銨作用生成磷鉬酸，后者在氨萘酚磺酸作用下生成藍色的鉬藍。嘌呤堿與硝酸銀產(chǎn)生灰褐色的嘌呤銀化合物。核糖經(jīng)濃硫酸脫水生成糠醛，后者再與地衣酚（3,5-二羥基甲苯）縮合成綠色化合物。脫氧核糖經(jīng)濃硫酸脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊醛，它與二苯胺作用生成藍色化合物。實驗方法及步驟1.制備肝勻漿：將1只小白鼠用拉斷頸椎的方法處死，剖腹取出全部肝組織，用清水洗凈血污，并用濾紙吸干，然后用剪刀剪碎，加0.9％NaCl溶液2ml于研缽中制成勻漿。2.提取核酸：將全部勻漿置于小試管中，加入2％三氯醋酸2ml，用玻棒攪勻，靜置3分鐘。然后離心（3000r/min）3分鐘，棄上清液，于沉淀中加入10％NaCl溶液2ml，充分混勻，置沸水浴中加熱8分鐘，用玻棒邊加熱邊攪拌（防止玻管底破裂），使之充分生成核酸鈉。取出放冷，離心（3000r/min）3分鐘。將上清液倒入另一試管內(nèi)，逐滴加入95％冷乙醇2ml，邊加邊攪拌，待析出白色沉淀。靜置5分鐘后，再離心（3000r/min）5分鐘，傾去上清液，留沉淀備用。3.水解核酸：在上述沉淀（核酸鈉）中加入5％H2SO44ml，用玻璃棒攪勻，在沸水中加熱10分鐘，即得核酸水解液。4.核酸組分的鑒定：取大試管8支，編號，依次加入下列各試劑：管號試劑（滴）12345678核酸水解液20104205%H2SO42010420濃氨水10105%AgNO31010鉬酸銨試劑55氨[基]萘酚磺酸20203,5-二羥基甲苯66二苯胺3030搖勻后除3、4兩管需放置3分鐘后再置于沸水浴加熱3分鐘外，其它6管直接置于沸水浴5分鐘。比較1管與2管、3管與4管、5管與6管、7管與8管顏色的差異，并予以解釋。顏色（記錄）注：1.單號管為測定管，雙號管為對照管2.試劑的配制⑴2％三氯醋酸溶液⑵0.9％NaCl溶液⑶10％NaCl溶液⑷95％乙醇⑸5%H2SO4⑹5%AgNO3⑺鉬酸銨試劑：在20ml蒸餾水中溶解2.5g鉬酸銨，加5mol/LH2SO430ml，用蒸餾水稀釋至100ml。此試劑可在冰箱中保存30天。⑻氨[基]萘酚磺酸：取15％NaSO3溶液195ml（必須透明），加入0.5g純化的氨[基]萘酚磺酸（純白色）及20％NaSO3溶液5ml。并在熱水浴中攪拌使固體溶解（如不能全部溶解，再加20％NaSO3溶液數(shù)滴，但加入量不得超過1ml），置冷處可保存2～3周，如顏色變黃時，要重新配制。氨[基]萘酚磺酸（1,2,4-Aminonaphthal-Sulfonicacid）的純化方法：在100ml熱水（90℃）中溶解15gNaHSO4及1gNa2SO4，加1.5g商品氨[基]萘酚磺酸（暗紅色），攪拌使其大部分溶解（僅少量雜質(zhì)不溶解），趁熱過濾，再迅速使濾液冷卻。加1ml濃鹽酸（12mol/L）有白色氨[基]萘酚磺酸沉淀析出，過濾并用水洗滌固體數(shù)次，再用乙醇洗滌，直至純白色為止，最后用乙醚洗滌，并將固體放置在暗處，使乙醚揮發(fā)，將此提純的氨[基]萘酚磺酸置棕色瓶中保存。⑼二苯胺試劑：取純化后的二苯胺1g溶于100ml冰醋酸（AR）中，加入2.75ml濃硫酸，混勻。此試劑見光變綠色，應裝入棕色瓶置冰箱備用。此試劑須用前臨時配制。二苯胺的提純方法：在70％乙醇中重結(jié)晶兩次。⑽3,5-二羥甲苯試劑：取比重1.19HCl100ml加入FeCl3·6H2O100mg及純化后的二羥甲苯100mg，混勻溶解后，置于棕色瓶中備用。此試劑亦須用前臨時配制。3,5-二羥甲苯的提純方法：將市售品溶于煮沸的苯中，加少量活性炭脫色，過濾，再加少量己烷重結(jié)晶。實驗五、果蔬過氧化物酶活力測定（3學時）目的要求了解過氧化物酶的生物氧化作用，學習過氧化物酶的測定方法。二、實驗原理過氧化物酶屬氧化還原酶，能催化底物過氧化氫對某些物質(zhì)的氧化。反應中的供氫體可為各種多元酚（對–甲酚、愈創(chuàng)木酚、間苯二酚）或芳香族胺（苯胺、聯(lián)苯胺、鄰苯二胺）以及NADH2NADFH2。其作用機理可分為以下幾步：第一步形成酶–底物復合物Ⅰ過氧化物酶+H2O2→酶?復合物Ⅰ第二步酶?復合物Ⅰ轉(zhuǎn)變成褐色的酶?復合物Ⅱ酶?復合物Ⅰ+AH→酶?復合物Ⅱ+A第三步酶?復合物Ⅱ被還原，釋放酶酶?復合物Ⅱ+AH→過氧化物酶+A+H2O2AH表示還原形供氫體。在一定條件下，酶?復合物Ⅱ可生成產(chǎn)物（P）同時釋放出酶，亦可與過量的過氧化氫形成穩(wěn)定的復合物Ⅲ：酶?復合物Ⅱ+H2O2→酶?復合物Ⅲ本實驗以愈創(chuàng)木酚為供氫體，H2O2為氫的受體，愈創(chuàng)木酚在過氧化物酶催化作用下被氧化后，生成褐色的有色產(chǎn)物，根據(jù)酶活力大小與有色產(chǎn)物顏色的深淺成正比，在波長下測定其吸光值，可求出過氧化物酶的活力。以每分鐘吸光度的變化值表示過氧化物酶活力大小，即以A470/min.g鮮重計算。測定過氧化物的實際意義在于，過氧化物廣泛存在于植物組織中，在果蔬加工過程中的主要作用包括兩個方面：（1）過氧化物酶氧化作用與果蔬原料，特別是非酸性蔬菜在保藏期產(chǎn)生不良風味有關(guān)；（2）過氧化物酶屬最耐熱的酶類，在果蔬加工中果蔬中過氧化物酶活力大小常被用作衡量果蔬熱處理滅酶是否充分的指標，因為當果蔬中的過氧化物酶在熱燙中失活時，表明其它酶以活性形式存在的可能性以達到最小。三、試劑及材料1、30%過氧化氫。2、愈創(chuàng)木酚3、20mmol/L磷酸二氫鉀溶液稱取2.72g磷酸二氫鉀，用蒸餾水溶解并定容至100mL。4、100mmol/L磷酸PH6.0緩沖溶液吸取6.3mL磷酸加水至100mL，用氫氧化鈉調(diào)整至所需的PH。5、反應混合液取25mL磷酸緩沖溶液于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚140μl，于磁力攪拌器中攪拌至愈創(chuàng)木酚溶解，加入30%過氧化氫95μl，混勻置冰箱保存?zhèn)溆谩?、新鮮白菜梗。四、儀器設(shè)備可見光分光光度計。五、操作方法1、酶液提取取白菜梗10g，加入磷酸鹽溶液30mL，置于研缽中充分研磨，用磷酸鹽溶液定容至100mL，過濾備用。2、取兩根試管，其中一根試管加入反應混合液3.0mL，磷酸鹽溶液1.0mL，作為光度計調(diào)零對照；另一試管加入反應混合液3.0mL，酶液0.1mL，補充磷酸鹽溶液至總體積為4.0mL，迅速混勻。1分鐘后使用1cm玻璃比色皿，在470波長條件下測定其吸光值，連續(xù)測定5次，間隔時間均為1分鐘。記錄測試結(jié)果。測試時間（min）012345A470nm03、求吸光值y=ΔA470t+b回歸方程。4、溫度對過氧化物酶活力的影響實驗分別取10g白菜梗置于70℃、80℃、90℃、100℃溫度條件下熱燙處理3min，再按1操作方法置備酶液。按上述方法測定各吸光值，比較熱處理前后酶活力大小。六、結(jié)果計算與討論過氧化物酶活力=ΔA470100/(mV1)式中V1—測定時吸取供試酶液的體積(mL)m—提酶樣品重量(g)100—酶液稀釋總體積(mL)七、思考題過氧化物酶的作用機制是什么？測定其酶活力對食品果蔬加工有何實際意義？實驗操作要點是什么？實驗六、植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)氨基作用(3學時)一、實驗與要求掌握轉(zhuǎn)氨基作用的特點，了解轉(zhuǎn)氨酶的作用；學習紙層析基本技術(shù)。二、實驗原理植物體內(nèi)通過轉(zhuǎn)氨酶的作用，α-氨基酸上氨基可轉(zhuǎn)移到α-酮酸原來酮基的位置上，結(jié)果形成一種新的α-酮酸和一種新的α-氨基酸，所生成的氨基酸可用紙上層析法檢出。三、試劑和材料綠豆芽子葉及胚軸，0.1mol/L丙氨酸溶液，0.1mol/Lα-酮戊二酸溶液（用NaOH中和至pH7），含有0.4mol/L蔗糖的0.1mol/L磷酸緩沖液（pH8.0），磷酸緩沖液（pH7.5），正丁醇，甲酸，0.1mol/L谷氨酸溶液，0.1%～0.25%茚三酮丙酮溶液。四、實驗設(shè)備研缽，10ml量筒，離心機，試管，移液管，恒溫箱，漏斗，層析缸，層析紙，毛細管，吹風機。五、操作方法1酶液的提取取發(fā)芽2～3天的綠豆芽5g，放入研缽中，加2ml磷酸緩沖液（pH8.0）研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管。研缽再用該1ml緩沖溶液沖洗，并入離心管中，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液備用。2酶促反應取3支試管編號，按下表分別加入試劑和酶液（單位ml）管號0.1mol/Lα-酮戊二酸溶液0.1mol/L丙氨酸溶液酶液磷酸緩沖液（pH7.5）10.50.50.51.520.5—0.52.03—0.50.52.0將試管搖勻后置于37℃恒溫箱中保溫30min。取出后各加3滴30%三氯乙酸溶液終止酶反應，于沸水浴中加熱10min，使蛋白質(zhì)完全沉淀，冷卻后離心或過濾，取上清液或濾液備用。3層析取層析紙一張，在距底線2cm處用鉛筆劃一水平線，在線上等距離確定5個點，作為點樣位置，相鄰各點間距2.5cm。取上述上清液或濾液及谷氨酸、丙氨酸標準液分別點樣，反應液點5～6滴，標準液點2滴。每點一次用吹風機吹干后再點下一次。最后沿垂直于基線的方向?qū)V紙卷成圓筒，以線縫合，注意紙邊不能疊在一起或接觸。在層析缸中放入正丁醇、甲酸、水推動劑的混合試劑（15:3:2）。待缸內(nèi)蒸氣飽和后，將濾紙筒垂直放入，展層，待溶劑前沿上升至距濾紙前沿約2cm取出，用鉛筆標出前沿位置。吹干，剪斷縫線，以0.1%～0.25%茚三酮丙酮溶液噴霧，置烘箱（60℃）內(nèi)或用吹風機烘干后顯色。六、思考題1圖示或張貼層析圖，鑒定丙氨酸和α-酮戊二酸是否進行了轉(zhuǎn)氨基作用，并寫出相關(guān)的反應式。2實驗操作過程中，為何不能用手接觸濾紙？實驗七SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量（4學時）一、實驗目的學習SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的實驗原理，掌握相應的實驗技術(shù)。二、實驗原理聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（Acrylamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N–甲叉雙丙烯酰胺（Methylence-bisacry-lamide，簡稱Bis）在催化劑和加速劑的作用下聚合交聯(lián)形成的具有分子篩效應的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。凡以此凝膠為支持物的電泳均稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE）。凝膠篩孔大小、機械強度和透明度等物理參數(shù)，主要取決于凝膠濃度（T%）及交聯(lián)度（C%），隨著這兩個參數(shù)的改變，可獲得對待測分子進行分離、分辨的最適孔徑。T%=[(丙烯酰胺g+甲叉雙丙烯酰胺g)/總體積]×100C%=[甲叉雙丙烯酰胺g/(丙烯酰胺g+甲叉雙丙烯酰胺g)]×100丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。在連續(xù)系統(tǒng)中緩沖溶液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場的作用下主要靠電荷及分子篩效應得以分離；而在不連續(xù)系統(tǒng)中，不僅具有前兩種效應，還具有濃縮效應，使電泳具有良好的清晰度和分辨率。電泳時樣品的濃縮效應主要由以下原因產(chǎn)生：（1）凝膠孔徑的不連續(xù)。在不連續(xù)的PAGE中，電泳凝膠由上下兩層不同pH、不同孔徑的濃縮膠和分離膠組成，在電場的作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔的濃縮膠中泳動的速度快，當進入小孔分離膠時，其泳動過程受阻，因而在兩層凝膠交界處，由于凝膠孔徑的這種不連續(xù)性造成樣品位移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。（2）緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性。在Tris-甘氨酸緩沖體系中，各膠層中均含有HCl，HCl在任何pH溶液體系中均容易離解出Cl-，它在電場中遷移率最大；甘氨酸等電點為6.0，在pH6.8的濃縮膠中，離解度很低，僅有0.1%~1%的NH2CH2COO-，因而在電場中的遷移速度很慢；大部分蛋白質(zhì)pI在5.0左右，在此電泳環(huán)境中都以負離子形式存在。通電后，這三種負離子在濃縮膠中都向正極移動而且它們的泳動率按mdach>mpap>mqaq排序（有效遷移率等于遷移率m與離解度a的乘積）。于是蛋白質(zhì)就在快、慢離子形成的界面處，被壓縮成極窄的區(qū)帶。（3）是由電位梯度的不連續(xù)性所至。電泳開始后，由于Cl_-的遷移率最大，很快超過蛋白質(zhì)，因此在快離子后面，形成一個離子濃度低的電導區(qū)，由此產(chǎn)生一個高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢甘氨酸離子在快離子后面加速移動，當快離子和慢離子的移動速度相等的穩(wěn)定狀態(tài)建立后，由于蛋白質(zhì)的有效遷移率正好介于快、慢離子之間而被濃縮形成一狹小的區(qū)帶。當樣品進入分離膠后，凝膠pH變?yōu)?.8，此時甘氨酸解離度大大增加，其有效遷移率也因此加大，并超過所有蛋白質(zhì)分子。這樣，快慢離子的界面（由溴酚藍指示劑標記）總是跑在被分離的蛋白質(zhì)樣品之前，不再存在不連續(xù)的高電勢梯度區(qū)域。于是，蛋白質(zhì)樣品在一個均一的電勢梯度和均一的pH條件下，通過凝膠的分子篩作用，根據(jù)各種蛋白質(zhì)所帶的凈電荷不同，具有不同遷移率而達到分離目的。垂直平板電泳凝膠是在兩塊垂直放置、間隔幾個毫米的平行玻璃中進行的，所得的是垂直平板狀的凝膠。垂直平板電泳有以下優(yōu)點：一系列樣品能在同一塊凝膠板上進行，顯色條件也相同；平板表面大，有利于凝膠冷卻；易于進行光密度掃描測定。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是聚丙烯酰胺凝膠電泳的一種特殊形式。實驗證明，在蛋白質(zhì)溶液中加入十二烷基硫酸鈉（SDS）這陰離子表面活性劑和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原；SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)–SDS復合物。大約每克蛋白質(zhì)可結(jié)合1.4克SDS，蛋白質(zhì)分子一經(jīng)結(jié)合了一定量的SDS陰離子，所帶負電荷量遠遠超過了它原有的電荷量，從而消除了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差別。同時，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，使它們在水溶液中的形狀近似于長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復合物的短軸長度均為1.8mm，而長軸則隨蛋白質(zhì)的相對分子量成正比的變化。這樣的蛋白質(zhì)–SDS復合物，在凝膠電泳中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，僅取決蛋白質(zhì)分子量的大小。故可根據(jù)標準蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)和遷移率所做的標準曲線，求出未知物的分子量。三、試劑與儀器（一）試劑（所用水為重蒸水）1．30%單位膠儲備液（Acr:Bis=29:1）稱58g丙烯酰胺（Acr）溶于180mL雙蒸水，再加入2g甲叉雙丙烯酰胺（Bis），溶解后定容至200mL，過濾備用。2．分離膠緩沖液（pH8.8，3mol/LTris-HCl）稱取36.33gTris溶于80mL雙蒸水中，在pH計上用HCl調(diào)pH至8.8，然后定容至100mL。3．濃縮膠緩沖液（pH6.8，1mol/LTris-HCl）稱12.11gTris溶于80mL雙蒸水中，在pH計上用HCl調(diào)pH至6.8，加水定容至100mL。4．10%SDS：稱取10gSDS，在65℃下用水溶解并定溶至100mL。5．10%過硫酸銨（AP，聚合用催化劑）稱5gAP溶解于50mL雙蒸水中，最好臨用之前新鮮配制。也可置于4℃冰箱中避光保存，7天后重配。10%N，N，N，N–四甲基乙二胺（TEMED）（聚合用加速劑）移取0.1mLTEMED稀釋至1.0mL。置于4℃保存。7．Tris-Gly電極緩沖溶液：稱取7.5gTris鹽和36g甘氨酸用水溶解，再加入10%SDS25mL，用水定容至500mL，備用。臨用時稀釋5倍。8．50mmol/LTris-HCl(pH6.8)緩沖溶液稱取0.606gTris溶于80mL雙蒸水，在pH計上用HCl調(diào)pH至6.8，然后加水至100mL。9．加樣緩沖溶液：吸取50mmol/LTris-HCl(pH6.8)緩沖溶液3.2mL、10%SDS溶液11.5mL、β-巰基乙醇2.5mL、溴酚藍2mg以及甘油5mL，用水溶解并定容至50mL。10．染色液稱取0.5g考馬斯亮藍R–250溶于甲醇和冰醋酸混合液（80mL/20mL）中，過濾備用。11．脫色液取150mL甲醇與50mL冰醋酸混溶，加雙蒸水至500mL。12．3%瓊脂溶液。13．標準分子量蛋白（電泳專用試劑）。（二）儀器1、直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，電流100mA，電壓400V—500V。2、夾芯式垂直電泳槽，DYYⅢ2A型，1.0mm梳槽。四、操作方法（一）電泳槽安裝夾芯式垂直電泳槽兩側(cè)為有機玻璃制成的電極槽，兩電極槽中間夾有一個由凹形硅膠框，長短玻璃板及樣品槽模板組成（如圖所示）。電泳槽分上貯槽（白金電極面對短玻璃板）、下貯槽（白金電極面對長玻璃板），回紋狀玻璃管用于冷凝。兩電泳槽與凝膠模間靠貯液槽螺釘固定。夾心垂直電泳槽示意圖凝膠模示意圖1、導線接頭；2、下電極緩沖液槽；1、樣品槽定位模扳；2、長玻璃板；3、凹型橡膠板；4、樣品槽模板；3、短玻璃板；4、凹型橡膠框。5、固定螺絲；6、上電極緩沖液槽；7、冷凝系統(tǒng)。圖1垂直板電泳槽結(jié)構(gòu)示意圖組裝前各部件應做徹底清洗，尤其是長短玻璃及凹形帶槽橡膠框，須用少許洗衣粉徹底清洗，晾干后才能使用。把長短玻璃分別插入相應的凹形橡膠框，注意手指不要接觸膠面的玻璃板。用點滴管或進樣槍，把已經(jīng)融化的瓊脂密封長、短玻璃板的間隙，瓊脂以滲入長、短兩玻璃鍵間隙的高度1.0cm為宜，可略抬起膠框的一端在瓊脂末凝固之前排去瓊脂膠層的氣泡。而后垂直放置膠框，讓瓊脂完全凝固。把帶正極的電泳槽有機玻璃板仰放于臺面，將已經(jīng)用瓊脂密封好的玻璃板凝膠模，以長玻璃板面對正極的方式，平放于玻璃板上方，然后把帶有負極的另一側(cè)電泳槽有機玻璃板按螺絲銷釘裝好，并以對角線的方式逐漸旋緊螺絲帽，松緊程度以電泳槽不滲漏電極緩沖液而樣品槽梳子又能夠方便插入為宜。（二）灌膠1、配膠由于SDS電泳分離不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，只取決于所形成SDS—蛋白質(zhì)膠束的大小，因此凝膠濃度的正確選擇尤為重要。如凝膠濃度太大，孔徑太小，電泳時樣品分子不能進入凝膠。如凝膠濃度太小，孔徑太大，則樣品中各種蛋白質(zhì)分子均隨著凝膠緩沖液流向前推進，而不能得以很好地分離。因此實驗中可根據(jù)分析樣品的分子量大小選擇合適的凝膠配比。不同濃度分離膠配比參考如下：表不連續(xù)緩沖系統(tǒng)電泳中不同網(wǎng)孔凝膠溶液配方參考表試劑分離膠凝膠濃度（12.5T%）分離膠凝膠濃度（10T%）分離膠凝膠濃度（7.2T%）濃縮膠凝膠濃度（4T%）分離膠緩沖液3.15mL3.15mL3.15mL/濃縮膠緩沖液///2.5mL單體膠儲備液10mL8.5mL6.0mL2.7mL10%SDS0.25mL0.25mL0.25mL0.25mL重蒸水11.2mL12.7mL15.2mL14.2mL10%過硫酸銨0.2mL0.2mL0.2mL0.2mLTEMED?40μL40μL40μL40μL總體積25mL25mL25mL20mL?此溶液在灌膠前最后加入，以避免膠體凝固無法灌膠。2、灌膠a分離膠制備：將配制好的分離膠，連續(xù)緩慢地沿長玻璃板板壁注入凝膠模，直至膠液的高度達到低玻璃板板面2/3左右，用注射器小心流加入2cm左右高度的雙蒸水覆蓋膠面，其加水速度應控制在不破壞膠層分度。約60min左右后，當凝膠與水層間出現(xiàn)折射率不同的分層面時，表明凝膠聚合完成。傾去膠層蒸餾水，再用雙蒸水洗滌膠面，以除去未聚合膠液，并用濾紙吸干多余的水。b濃縮膠置備：用微量的未加TEMED的濃縮膠洗滌分離膠面一次，傾去洗滌用的濃縮膠液，用濾紙吸干多余的膠液。然后將配好的濃縮膠連續(xù)緩慢加到已聚合的分離膠的上方，直至距離短玻璃板上緣約1mm處為止，隨后將樣品槽梳子輕輕插入濃縮膠內(nèi)。待凝膠聚合后，小心拔出槽梳板，注意不要弄斷或弄裂膠層。用長針頭輕而有序地將每個凹形樣品槽修飾整理，加雙蒸水清洗槽坑，最后用針筒抽干凹槽內(nèi)的雙蒸水。將稀釋5倍的Tris–Gly電極緩沖液，倒入電泳儀上、下貯槽中，緩沖液高度以浸泡短玻璃板0.5cm以上為宜，即可準備加樣。（三）樣品處理與上樣1、電泳樣品前處理（1）標準蛋白樣處理：按購置標準蛋白樣品說明書操作，取一定體積標準蛋白樣品溶液于1.