VEGF的生物學(xué)基礎(chǔ)與朗沐藥學(xué)課件

VEGF生物學(xué)基礎(chǔ)與朗沐藥學(xué)基礎(chǔ)知識陶杉aoshanshan@1精選2021版課件目錄2精選2021版課件VEGF的定義VEGF：VascularEndothelialGrowthFactor，血管內(nèi)皮生長因子，是一類多功能的細(xì)胞因子，在血管生成和淋巴管生成中具有直接和間接的調(diào)控作用。VEGF主要有7種亞型：VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F和PlGF（PlacentaGrowthFactor）。其中只有VEGF-A，VEGF-B和PlGF與血管新生相關(guān)。3精選2021版課件VEGF的分子結(jié)構(gòu)VEGF-A的基因經(jīng)過剪切拼接后可形成不同單體，如121,165,183等。數(shù)字代表相應(yīng)的氨基酸殘基數(shù)量。其中VEGF165是眼部新生血管的主要誘因。VEGF通常以同源二聚體的形式存在，2個(gè)亞基的分子質(zhì)量（MW）為17－23kDa，通過兩對二硫鍵共價(jià)連接。kDa:kiloDalton，千道爾頓，也寫作kD。4精選2021版課件VEGF的合成和靶細(xì)胞所有眼部分布血管的組織都可合成表達(dá)VEGF，相關(guān)細(xì)胞包括：視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinalpigmentepithelium，RPE），周皮細(xì)胞（也稱周細(xì)胞），內(nèi)皮細(xì)胞，穆勒細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等。VEGF的主要靶向細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞RPE視網(wǎng)膜外層穆勒細(xì)胞視網(wǎng)膜中層視網(wǎng)膜內(nèi)層視網(wǎng)膜感覺神經(jīng)細(xì)胞5精選2021版課件VEGF的作用1.VEGF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活；2.VEGF可以增加血管通透性，擴(kuò)張血管；3.VEGF可以聚集血管前體細(xì)胞和單核細(xì)胞。6精選2021版課件VEGFR的定義VEGFR：VascularEndothelialGrowthFactorRceptor，血管內(nèi)皮生長因子受體，是一類受體酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，與VEGF結(jié)合后通過構(gòu)象變化和磷酸化傳遞相應(yīng)信號。VEGFR主要有3種亞型：VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3。VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、增加血管的通透性和新血管的生成作用主要是通過結(jié)合和激活VEGFR-2來實(shí)現(xiàn)的。VEGFR-3不參與血管新生信號通路中。7精選2021版課件VEGF受體的分子結(jié)構(gòu)VEGFR平時(shí)以單體形式存在。分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三大部分。胞外區(qū)部分由7個(gè)與免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig)結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)域組成。胞內(nèi)區(qū)部分屬于酪氨酸激酶區(qū)，可以發(fā)生自磷酸化來向下游傳遞信號。8精選2021版課件VEGF受體的分子結(jié)構(gòu)VEGFR的胞外區(qū)的7個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)從N端開始依次命名為D1-D7。VEGFR-1（Flt-1）可以結(jié)合VEGF-A、VEGF-B和PlGF，其D2區(qū)就是與配體結(jié)合的位點(diǎn)。VEGFR-2（KDR，F(xiàn)lk-1）只能結(jié)合VEGF-A，其D2和D3區(qū)是配體結(jié)合位點(diǎn)，D3區(qū)對于配體結(jié)合的專一性起作用。D4區(qū)對受體的二聚體化很關(guān)鍵，并可增強(qiáng)VEGF與VEGFR的結(jié)合速率。D1D79精選2021版課件VEGF與眼部新生血管疾病有關(guān)證據(jù)：①脈絡(luò)膜新生血管膜中檢測到VEGF165，VEGF-B和PlGF；②PDR（增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變）患者的玻璃體腔中PlGF的濃度明顯升高；③眼內(nèi)注射VEGF會引起和DR相同的表現(xiàn)，如微動脈瘤、出血、視網(wǎng)膜和虹膜新生血管。以上說明，VEGF與眼部新生血管疾病有關(guān)：1.從通透性到新生血管構(gòu)建，視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)的病態(tài)改變都與VEGF表達(dá)量增加有關(guān)。2.僅需VEGF就可觸發(fā)眼內(nèi)新生血管形成。3.抑制VEGF可改善眼部功能和結(jié)構(gòu)。10精選2021版課件VEGF表達(dá)增加的誘因缺氧、炎癥和機(jī)械力會上調(diào)細(xì)胞合成VEGF。11精選2021版課件VEGF的作用機(jī)制VEGF結(jié)合到VEGFR，通過D4區(qū)使其發(fā)生二聚體化現(xiàn)象，VEGF則橋接在受體的D2區(qū)或者D2和D3區(qū)之間。12精選2021版課件VEGF的作用機(jī)制VEGF與VEGFR的結(jié)合會引發(fā)受體構(gòu)象變化和自磷酸化，并使下游蛋白發(fā)生磷酸化，傳遞血管新生和血管滲漏的信號。PP13精選2021版課件眼部新生血管類疾病種類VEGF誘發(fā)的病態(tài)性血管新生疾病主要分為兩種：腫瘤和眼部新生血管失調(diào)。眼部新生血管疾病根據(jù)臨床表現(xiàn)又可分為三種：增殖型（Proliferation），滲漏型（leakage）和增殖滲漏型（Proliferationandleakage）。增殖型眼?。涸鲋承吞悄虿∫暰W(wǎng)膜病變（PDR），早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（ROP），新生血管性青光眼（NVG）滲漏型眼?。阂暰W(wǎng)膜靜脈阻塞（RVO），糖尿病黃斑水腫（DME），中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變（CSC）增殖滲漏型眼病：濕性年齡相關(guān)性黃斑變性（wAMD），視網(wǎng)膜血管瘤增殖（RAP），病理性近視CNV（pmCNV）14精選2021版課件眼部新生血管類疾病的拮抗途徑1.移除誘導(dǎo)VEGF表達(dá)量增加的條件：全視網(wǎng)膜激光光凝術(shù)，玻璃體切割術(shù)——改善視網(wǎng)膜內(nèi)氧環(huán)境，降低低氧誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)；2.下調(diào)VEGF和VEGFR的表達(dá)：眼內(nèi)注射曲安奈德，地塞米松3.阻斷VEGF與VEGFR的結(jié)合：哌加他尼鈉——特異性結(jié)合VEGF-A165；貝伐單抗，雷尼單抗——結(jié)合所有VEGF-A；阿柏西普，康柏西普——結(jié)合所有VEGF-A、VEGF-B和PlGF。15精選2021版課件康柏西普的生物學(xué)與藥學(xué)基礎(chǔ)16精選2021版課件康柏西普的來歷抗VEGF藥物的阻斷途徑：1.通過結(jié)合VEGF使之不能再與VEGFR結(jié)合2.通過結(jié)合VEGFR使VEGF不能再與受體結(jié)合單抗類藥物均采用了阻斷途徑1通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)獲得。VEGF-AVEGF-AVEGF-A貝伐單抗，Avastin雷珠單抗，Ranibizumab17精選2021版課件雷珠單抗生產(chǎn)工藝?yán)字閱慰购拓惙慰棺铋_始是以單克隆抗體技術(shù)制備篩選的。單克隆抗體技術(shù)又叫雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，是融合了小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞來生產(chǎn)抗體的技術(shù)。因?yàn)樾∈笃⒓?xì)胞經(jīng)過特定抗原（VEGF）刺激后會產(chǎn)生分泌相應(yīng)抗體（抗VEGF抗體，如貝伐單抗），但是小鼠脾細(xì)胞不能繁殖，如果需要較多量的穩(wěn)定單抗，就要把脾細(xì)胞與可以無限繁殖的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，這樣既可以分泌抗體又能保持細(xì)胞永生。由于VEGF刺激的是小鼠脾細(xì)胞，因此產(chǎn)生的抗體無可避免都會有鼠源性的氨基酸序列。而且由于抗體的可變性，不同次的刺激可能產(chǎn)生不同的抗體，因此最后是在多種抗體中篩選出貝伐單抗和雷珠單抗的全體。然后對這兩個(gè)單抗的氨基酸序列（雷珠是Fab片段的序列）進(jìn)行鑒定后即可根據(jù)基因密碼子表獲得相應(yīng)的DNA，然后將DNA序列轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，就能大批量培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的雷珠單抗了。因?yàn)橛么竽c桿菌表達(dá)蛋白一般來說快速方便穩(wěn)定又便宜。18精選2021版課件康柏西普的來歷抗體存在兩個(gè)問題：1.抗體的高度特異性使其只能與VEGF的一個(gè)亞型VEGF-A結(jié)合，而不表現(xiàn)出對VEGF-B和胎盤生長因子（PlGF）的親和力；2.雜交瘤細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)的抗體部分氨基酸組成和序列是鼠源性的，而非全人源化蛋白。19精選2021版課件康柏西普的來歷VEGF的各亞型都通過結(jié)合VEGFR-1和2來發(fā)揮作用。模擬受體與VEGF結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，可降低免疫原性，并能與所有VEGF亞型結(jié)合。VEGFR-1和2的胞外域是與VEGF上的不同位點(diǎn)結(jié)合，因此這種模擬受體需要融合VEGFR-1和2兩種蛋白的配體結(jié)合位點(diǎn)才能完全抑制VEGF與受體的結(jié)合。20精選2021版課件康柏西普的來歷FP3表現(xiàn)出最高的VEGF的親和力，最強(qiáng)的抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖的能力。VEGFR-1VEGFR-221精選2021版課件康柏西普的分子量約為143kD,其受體樣區(qū)域是同源二聚體樣結(jié)構(gòu)，很好地模擬了VEGFR與VEGF結(jié)合的活性形態(tài)康柏西普的7個(gè)糖基化位點(diǎn)均發(fā)生糖基化，使得康柏西普的pI值在5.68-7.47之間，對眼部刺激性小D4區(qū)使得二聚體樣結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定更方便VEGF的橋接，也具有更快的VEGF結(jié)合速度。康柏西普的結(jié)構(gòu)22精選2021版課件康柏西普生產(chǎn)工藝康柏西普最開始是從人VEGF受體1和受體2的胞外免疫球蛋白樣區(qū)域分別隨機(jī)融合并連上人IgG的Fc片段形成的融合蛋白中篩選出來的，這種融合就是將表達(dá)這些蛋白區(qū)域的DNA序列通過連接酶有序地連接在一起，再轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)即可獲得。由于DNA對應(yīng)的蛋白均為人源化蛋白，因此康柏西普是100%全人源化的蛋白。之所以選用CHO細(xì)胞，一是因?yàn)榇竽c桿菌中沒有輔助真核蛋白正確折疊形成活性狀態(tài)的酶，因此表達(dá)出的分子不可溶、無活性，而CHO作為真核細(xì)胞，這些酶是有的；二是因?yàn)榭蛋匚髌盏鞍咨嫌卸鄠€(gè)糖基化位點(diǎn)，而大腸桿菌不能對人源化的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行糖基化，也會影響蛋白的狀態(tài)和活性；第三是因?yàn)镃HO細(xì)胞表達(dá)技術(shù)是現(xiàn)在真核表達(dá)細(xì)胞中相對成熟穩(wěn)定的技術(shù)，已經(jīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。23精選2021版課件康柏西普的活性研究康柏西普的體外活性研究康柏西普的體內(nèi)活性研究

24精選2021版課件康柏西普的體外活性研究ELISA檢測FP1、FP3和貝伐單抗對VEGF的親和力

FP1：阿柏西普；FP3：康柏西普康柏西普顯示出更高的VEGF親和力。貝伐單抗的特異性使其不能與VEGF-B和VEGF-C以及PlGF結(jié)合。25精選2021版課件康柏西普：EC50=28pM雷珠單抗：EC50=50pMEC50：半數(shù)有效濃度，即能引起50%最大效應(yīng)的藥物濃度。EC50值越大，說明藥物的作用越低?？蛋匚髌蘸屠字閱慰箤EGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖活性的影響康柏西普的體外活性研究26精選2021版課件康柏西普對HUVEC遷移的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，其IC50為7nM。IC50：半數(shù)抑制濃度，

即能引起50%抑制效應(yīng)的藥物濃度。IC50值越大，說明藥物的作用越低?？蛋匚髌諏EGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞遷移過程的影響康柏西普的體外活性研究27精選2021版課件康柏西普可顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的微血管萌芽和毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)形成。康柏西普對VEGF誘導(dǎo)的微血管萌芽和毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)形成的影響康柏西普的體外活性研究28精選2021版課件500ng/mL的康柏西普即可達(dá)到最大結(jié)合人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（HREC）分泌的VEGF165的作用，也可顯著降低游離的PlGF濃度?？蛋匚髌諏Ω咛钦T導(dǎo)的HREC分泌VEGF-165和PlGF的影響康柏西普的體外活性研究29精選2021版課件500ng/mL的康柏西普可有效抑制高糖誘導(dǎo)的HREC的遷移?？蛋匚髌諏Ω咛钦T導(dǎo)的HREC遷移的影響康柏西普的體外活性研究30精選2021版課件500ng/mL的康柏西普可有效抑制高糖誘導(dǎo)HREC形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)?？蛋匚髌諏Ω咛钦T導(dǎo)的HREC成網(wǎng)過程的影響康柏西普的體外活性研究31精選2021版課件康柏西普治療組的滲漏明顯比未治療組少，說明康柏西普可抑制新生血管生成。

低氧誘導(dǎo)小鼠缺血性視網(wǎng)膜病變抑制實(shí)驗(yàn)的眼底造影康柏西普的體內(nèi)活性研究32精選2021版課件激光后立刻注射康柏西普，之后B組每周注射一次，C組兩周注射一次。B組和C組的滲漏明顯比未治療組少，說明康柏西普可預(yù)防新生血管生成。

康柏西普預(yù)防恒河猴激光灼傷CNV實(shí)驗(yàn)的眼底造影康柏西普的體內(nèi)活性研究33精選2021版課件康柏西普抑制恒河猴激光灼傷CNV實(shí)驗(yàn)的OCT結(jié)果激光灼傷恒河猴后20天，治療組分別注射康柏西普500、300和100μg，并在注射8天后觀察。相比對照組，8天后治療組均未觀察到高反射回聲區(qū)，RPE恢復(fù)連續(xù)性，黃斑水腫消除，說明康柏西普可有效抑制CNV?？蛋匚髌盏捏w內(nèi)活性研究34精選2021版課件康柏西普抑制恒河猴激光灼傷CNV實(shí)驗(yàn)的FFA結(jié)果-500μg組激光灼傷20天后，注射0天注射14天后注射28天后康柏西普的體內(nèi)活性研究35精選2021版課件ZhangMing,etal.Ophthalmology.2011Apr;118(4):672-8.康柏西普治療后42天，患者BCVA平均提高了19.61個(gè)字母。中央視網(wǎng)膜厚度平均降低了77.19μm?？蛋匚髌盏捏w內(nèi)活性研究36精選2021版課件康柏西普3.0mg組的患者基線和治療42天后OCT與FFA結(jié)果ZhangMing,etal.Ophthalmology.2011Apr;118(4):672-8.康柏西普的體內(nèi)活性研究37精選2021版課件康柏西普的藥物代謝動力學(xué)研究康柏西普的兔眼藥代動力學(xué)研究康柏西普的恒河猴藥代動力學(xué)研究

38精選2021版課件重要藥代指標(biāo)：Cmax：最大藥物濃度，給藥后體內(nèi)檢測到的最大藥物濃度。Tmax：達(dá)峰時(shí)間，到達(dá)Cmax的時(shí)間，所需時(shí)間越短，說明藥物分散越快。t1/2：藥物清除半衰期，藥物濃度下降一半所需要的時(shí)間，值越大說明藥物在體內(nèi)存留時(shí)間越長。藥物代謝動力學(xué)的指標(biāo)39精選2021版課件康柏西普的兔眼藥代動力學(xué)研究玻璃體腔注射0.5mg(A,Group1)和1.5mg(B,Group2)康柏西普在玻璃體、房水、脈絡(luò)膜-PRE、視網(wǎng)膜中的藥代參數(shù)

康柏西普注射玻璃體腔后6-12h內(nèi)在各組織中達(dá)到最高藥濃度，之后以單指數(shù)模式下降，說明在濃度梯度推動下會快速分散到玻璃體腔及周圍組織。雷珠單抗在玻璃體腔中的Tmax為24h，但Cmax只有162μg/mL，t1/2為2.88天。40精選2021版課件康柏西普的兔藥代動力學(xué)研究康柏西普在血清中的時(shí)藥濃度

Group1:玻璃體腔注射0.5mg;Group2:玻璃體腔注射1.5mg;Group3:靜脈注射3mg玻璃體腔注射后血清中康柏西普