肺結(jié)核診斷新技術(shù)-課件

結(jié)核病診斷新技術(shù)及其評價

1編輯版ppt內(nèi)容二、生化檢測三、細胞免疫學檢測一、微生物學檢測四、分子生物學檢測2編輯版ppt

呼吸醫(yī)生的尷尬？

先抗炎？？？再抗癆？？？實在不行，上化療？？？？你懂的！TB的診斷有時有多難！病原學檢測是診斷TB最重要的依據(jù)，但據(jù)2013年WHO統(tǒng)計，僅有58%的TB患者有病原學依據(jù)。3編輯版ppt前言早期準確診斷是結(jié)核病(TB)患者得以及時治療的關鍵。目前的TB診斷水平仍然薄弱。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估算，2012年的860萬新發(fā)TB患者中，僅登記了570萬，還有217.5萬(25.3%)未被發(fā)現(xiàn)(漏診)。提高診斷技術(shù)則是發(fā)現(xiàn)患者，減少誤診、漏診的核心。

2024/2/184編輯版ppt一、微生物學檢測包括涂片染色鏡檢、結(jié)核分枝桿菌(MTB)分離培養(yǎng)、MTB藥敏和菌種鑒定等。染色涂片法是臨床上最便捷快速的診斷方法，但敏感度偏低，發(fā)達國家可檢出50%的活動性肺結(jié)核，我國檢出率一般約為30%，且無法區(qū)別非MTB(

Mycobacteriumtuberculosis)。

MTB分離培養(yǎng)是確診TB最重要的依據(jù)，不僅能取得病原學結(jié)果，還能進一步進行藥敏檢測，指導治療。目前常用的細菌培養(yǎng)基包括Lowenstein-Jensen固相培養(yǎng)基(L-J法)和Middlebrook7H97H11液體培養(yǎng)基。固相培養(yǎng)基價格低，但耗時長，需要4~8周取得結(jié)果，加上菌種鑒定的時間耗時更長?；贐ACTECMGIT960、BacT/Alert3D系統(tǒng)的液體培養(yǎng)基檢測速度有明顯提高(1~4周)，但費用較高。5編輯版ppt一、微生物學檢測1.1MTB快速培養(yǎng)法BACTECMGIT960系統(tǒng)采用熒光增強原理，在培養(yǎng)管底部包埋對氧氣濃度高度敏感的指示劑，通過檢測氧氣濃度變化以監(jiān)測培養(yǎng)管內(nèi)MTB的生長狀態(tài)。陽性標本檢出時間相對較短，平均為9d，后續(xù)菌種鑒定及藥敏試驗時間平均為4d。BACTECMGIT960系統(tǒng)為目前國際通行培養(yǎng)標準，培養(yǎng)陽性率較固體培養(yǎng)法高出10%左右，檢測界限<10個菌落形成單位(CFU)/mL。BacT/Alert3D系統(tǒng)采用比色法原理，通過監(jiān)測預處理標本中產(chǎn)生CO2與標本瓶中初始的CO2相比較，判斷是否存在MTB生長。同時可以進行藥敏檢測。理論上培養(yǎng)速度較L-J法和BACTECMGIT960系統(tǒng)更快(6~22d)。1.2直接顯微鏡檢技術(shù)(MODS)工作原理依據(jù)于MTB在液體培養(yǎng)基中生長會出現(xiàn)特征性的索狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以通過倒置顯微鏡觀察到。檢測呼吸道標本中是否存在MTB的敏感度為97.5%，特異度為94.4%，出現(xiàn)陽性結(jié)果的中位時間約為8d該方法無需昂貴的設備，簡單，相對快速。6編輯版ppt二、生化檢測TB的生化檢測主要包括腺苷脫氨酶(ADA)、乳酸脫氫酶(LDH)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)等酶學檢測。此類方法簡單快速，適用于TB早期診斷及鑒別診斷，但由于缺少結(jié)核特異性的酶標而無確診價值。2.1ADAADA是嘌呤核苷代謝中重要的酶。胸(腹)腔積液ADA檢測對結(jié)核性胸(腹)膜炎鑒別診斷有重要意義，胸(腹)腔積液ADA濃度以45U/L為界，結(jié)核性大多超過此值，特異度及敏感度超過80%。胸(腹)腔積液ADA與血清ADA比值≥1更傾向結(jié)核性積液。而對于癌性及非特異性積液，其比值一般<1。ADA對于活動性TB的敏感度為100%，特異度為97%。腦脊液中ADA活性檢測對于TB的診斷也有一定價值，尤其應用于結(jié)核性腦膜炎與隱球菌腦膜炎、病毒性腦膜炎的鑒別。結(jié)核性腦膜炎腦脊液中ADA活性增高，通常>8U/L，而后兩者一般正常，ADA濃度≤8U/L。結(jié)核性腦膜炎表明，將ADA濃度>8U/L作為結(jié)核性腦膜炎診斷的閾值時，其診斷的總敏感度<59%，特異度>96%。7編輯版ppt二、生化檢測2.2LDH是一種糖酵解酶，幾乎存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內(nèi)。對TB的診斷來說，LDH可用于區(qū)別滲出性積液與漏出性積液，胸(腹)腔積液LDH與血清LDH比值≥0.6，LDH濃度>200U/L傾向滲出液。結(jié)核性胸(腹)腔積液的LDH濃度一般>200U/L，與癌性胸(腹)腔積液LDH濃度變化無特征性差異。2.3ACE為二肽羧肽水解酶，又名激肽酶I，存在于肺、腎、腦、小腸、胎盤等組織的血管內(nèi)皮細胞或上皮細胞及血漿。對TB的診斷來說，血清ACE的檢測主要用于TB與結(jié)節(jié)病的鑒別，后者血清ACE濃度升高多見。結(jié)核性胸腔積液ACE濃度一般不升高，胸腔積液ACE與血清ACE比值≥1更傾向結(jié)核性積液，而惡性積液的比值多<1。8編輯版ppt三、細胞免疫學檢測

MTB為胞內(nèi)致病菌，因此普遍認為TB的發(fā)病過程中細胞免疫占主導地位。細胞免疫學診斷主要包括結(jié)核菌素皮膚試驗(tuberculinskintest，TST)和γ-干擾素釋放試驗(interferongammareleaseassay，IGRA)，而結(jié)合上述兩種方法優(yōu)點的改良結(jié)核菌素皮膚試驗近年來發(fā)展很快。3.1TST即PPD皮試或皮內(nèi)Mantoux試驗。TST從1890年發(fā)明以來沿用至今。由于TST存在假陽性結(jié)果和假陽性結(jié)果，影響了其使用價值。假陽性結(jié)果大部分是由于結(jié)核菌素抗原與其他分枝桿菌有交叉抗原所致。這種交叉抗原反應來自潛在的非MTB感染或接種卡介苗引起的反應。假陰性結(jié)果有很多潛在的原因，遲發(fā)超敏反應低下常見于免疫受損者，包括人免疫缺陷病毒(HIV)感染，長期使用激素等情況。陰性結(jié)果不能排除MTB感染。由于不同地區(qū)的感染背景差異較大以及沒有潛伏性結(jié)核感染(LTBI)的檢測金標準，導致TST的敏感度和特異度不能準確評價。9編輯版ppt三、細胞免疫學檢測

3.2血清學檢測WHO和不少國家推薦使用IGRA(

interferongammareleaseassay)

進行MTB感染的血清學檢測，這類試驗采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和(或)酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)定量檢測全血和(或)外周血單核細胞在MTB特異性抗原刺激下釋放γ-干擾素的水平，用于診斷LTBI及輔助診斷TB。目前利用IGRA原理，有2種較為成熟的試劑盒，即QuantiFERONTBGOLDInTube試劑盒(QFT-GIT，CellestisIncorporated，Carnegie，Australia)和T-SPOT.TB試劑盒(OxfordImmunotec，Abingdon，UK)，先后被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準應用于臨床。檢測結(jié)果陽性可被判斷為MTB感染。IGRA在24h之內(nèi)就可以獲得結(jié)果，花費的時間比TST短，并且不會因為復強效應(Booster效應)受到影響，可反復進行，在有試驗條件的醫(yī)院里，該試驗的操作和管理比TST更便捷，不需要專門的醫(yī)生多次觀察結(jié)果。同TST一樣，這種方法無法區(qū)分LTBI與活動性肺結(jié)核，因此，不能單獨作為TB的確診依據(jù)。

10編輯版ppt三、細胞免疫學檢測

Nil(不與抗原共孵育的血漿中γ干擾素的濃度[陰性對照組])；TBantigenminusnil(與3種結(jié)核特異性抗原共孵育后血漿中Y-干擾素的濃度減去陰性組的值)；mitogenminusnil(與有絲分裂原抗原共孵育后血漿中Y-干擾素的濃度減去陰性組的值；有絲分裂原管包含植物血凝素，能非特異性激活T細胞，作為陽性對照用以保證細胞對抗原的反應能力和校正血樣的處理和孵。B對于這種IGRA，1mL血抽入到3根管中（陰性對照，陽性對照和TB抗原管）。計算TB抗原管中全血刺激產(chǎn)生的γ干擾素和陰性對照管中的γ干擾素的差值作為TB反應。陽性結(jié)果需滿足以下標準。(1)陰性對照小于8IU/mL；(2)TB抗原管減去陰性對照管結(jié)果≥0.35IU/mL，且≥25%陰性對照管結(jié)果；(3)陽性對照管有反應。11編輯版ppt細胞免疫學檢測

目前IGRA檢測成本偏高，不適用于人群篩查。試驗結(jié)果在一定程度上受到T細胞水平及活性的影響，對于免疫抑制或者免疫缺陷者可能會結(jié)果不準確。雖然有資料表明對于HIV感染、血液病、惡性腫瘤、矽肺以及慢性腎衰者，預防性治療TB潛伏感染的常用方法是IGRA，但對于其中嚴重的免疫抑制者，IGRA的診斷價值會降低。對于中國人群來說，IGRA并不能顯示出明顯超過TST的優(yōu)勢。MTB核酸擴增檢測(NAA):是近年來TB診斷領域中最有突破的，檢測手段日趨成熟。部分新型的核酸檢測技術(shù)(如分子線性探針檢測)得到了WHO的認可和推薦，可用于TB的診斷和耐藥檢測。理論上NAA敏感性很好，即使標本中只有極低拷貝數(shù)的細菌也能檢出，一般24h之內(nèi)即可取得檢驗結(jié)果，并且在生物安全級別上要求相對較低，還可以通過檢測異煙肼和利福平的常見耐藥基因位點，從而篩查出耐藥MTB。12編輯版ppt三、分子生物學檢測4.1標準聚合酶鏈式反應(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復性)及適溫延伸等幾步反應組成1個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可以通過核酸擴增檢測MTB的存在，同時可以對特定基因位點檢測來判斷菌株的耐藥性。理論上PCR對于存在細菌的標本都有較好的檢出率，但實際臨床上應用可能存在一定的偏差。假陽性結(jié)果主要由靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染所致，假陰性結(jié)果的出現(xiàn)主要是影響Taq酶活性，包括以下2個方面：一是臨床標本中可能存在內(nèi)源性抑制因子(5%~20%)，如DNA樣品中的蛋白質(zhì)和重金屬離子；二是標本溶血、血紅蛋白殘留、處理過程中使用苯酚等物質(zhì)。13編輯版ppt三、細胞免疫學檢測

4.2改進的核酸檢測技術(shù)傳統(tǒng)PCR檢測總的敏感性尚不理想，同時可能存在污染、操作失當?shù)纫蛩氐挠绊懀虼穗S后產(chǎn)生了多種改進手段，包括整合的MTB核酸擴增檢測試劑盒以及全自動化MTB檢測系統(tǒng)。前者包括如GenProbeMTB核酸直接擴增檢測(GenProbeamplifiedMTBdirecttest，AMTD；SanDiego，CA，USA)、羅氏AmplicorMTB檢測(RocheamplicorMTBtest，Basel，Switzerland)、BD-ProbeTecSDAtest(BectonDickinson，MD，USA)，實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)(simultaneousamplificationandtesting，SAT；仁度生物，中國)等商業(yè)試劑盒；后者主要指GeneXpertMTB/RIF系統(tǒng)(Cepheid，USA)。14編輯版ppt分子生物學檢測其中由于WHO的推薦，GeneXpertMTB/RIF已在全球60多個國家使用，下文分別予以介紹。4.2.1GenProbeMTB核酸直接擴增檢測恒溫擴增16SrRNA，以MTB復合群特異性探針檢測擴增產(chǎn)物，采用轉(zhuǎn)錄介導的擴增技術(shù)對靶核酸進行擴增，采用化學發(fā)光物啞啶酯標記的DNA探針與擴增的靶基因進行雜交，探針與擴增產(chǎn)物交叉后利用雜交保護試驗去除未雜交的標記探針，最后利用化學發(fā)光儀檢測發(fā)光信號，可在2h內(nèi)做出診斷。據(jù)報道，該方法的特異度>95%，對痰細菌培養(yǎng)陽性肺結(jié)核敏感度為92%~100%，對于痰細菌培養(yǎng)陰性肺結(jié)核敏感度為40%~93%，對于肺外結(jié)核敏感度約為93%。4.2.2

羅氏AmplicorMTB檢測擴增引物

16SrRNA基因片段，然后于各種分枝桿菌菌種特異性的寡核苷酸探針進行反向斑點雜交或微孔板反向雜交鑒定菌群，部分研究表明，該方法總的特異度>95%，對于痰細菌培養(yǎng)陽性肺結(jié)核檢出>97%，對痰細菌培養(yǎng)陰性肺結(jié)核敏感度為40%~73%，對肺外結(jié)核敏感度為77%~98%。15編輯版ppt分子生物學檢測4.2.3BD-ProbeTecSDAtest半定量的鏈置換擴增技術(shù)，以IS6110和16SrRNA為靶序列，經(jīng)加熱變性后與特異性引物雜交，在DNA聚合酶的作用下產(chǎn)生帶限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的靶DNA序列，然后核酸內(nèi)切酶在其識別位點將DNA雙鏈打開缺口，DNA聚合酶繼之延伸缺口3’端并替換下一條DNA鏈。被替換下來的DNA單鏈可以與引物結(jié)合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過程不斷反復，使靶序列高效擴增。該方法總的特異性>90%，對于痰細菌培養(yǎng)陽性肺結(jié)核檢出達90%~100%，對于痰細菌培養(yǎng)陰性肺結(jié)核敏感度33%~100%，對于肺外結(jié)核敏感度為76%。4.2.4實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)在同一溫度下，首先通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標核酸的1個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個(100~1000)RNA拷貝；每個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進入下一個擴增循環(huán)；同時，帶有熒光標記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，直觀反映擴增循環(huán)情況。實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)

試劑盒通過檢測RNA來證實MTB的存在，擴增效率極高，15~30min即可將模板擴增109倍，理論上檢測靈敏度和準確性遠高于其他核酸檢測技術(shù)；該技術(shù)采用實時熒光閉管檢測，使污染得到有效控制；即使污染產(chǎn)生，由于擴增產(chǎn)物為RNA，環(huán)境中極易降解，從而大幅度提高檢測結(jié)果的可靠性。目前該試劑盒已獲批準于我國應用。16編輯版pptPCR原理17編輯版ppt分子生物學檢測4.2.5GeneXpertMTB/RIF系統(tǒng)

GeneXpertMTB/RIF檢測試劑盒為美國Cepheid公司開發(fā)的，適用于GeneXpert儀器，可在2h內(nèi)直接從患者新鮮痰液或凍存痰液中檢測是否還有MTB及對利福平的耐藥情況，整個過程都在一密閉環(huán)境中進行，該方法采用全自動實時熒光定量PCR原理，將樣品處理、核酸擴增、目標序列的實時檢測整合于一體，通過對MTB特有的序列rpoB基因上于利福平耐藥相關81bp