病毒總論重點

朽木易折，金石可鏤。千里之行，始于足下。第頁/共頁病毒的5大特點形體極小，缺乏細(xì)胞結(jié)構(gòu)只含有一種核酸，DNA或RNA以自身的核酸為模板舉行復(fù)制缺乏殘破的酶和能量系統(tǒng)鄭重的細(xì)胞內(nèi)寄生病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成一、病毒的結(jié)構(gòu)病毒粒子：成熟的、結(jié)構(gòu)殘破、具有侵染力的單個病毒，又稱病毒顆粒。一個結(jié)構(gòu)上殘破的病毒顆粒，主要由兩部分組成：中央為核酸基因組，外部包裹一層蛋白質(zhì)組成的外殼，即衣殼。核衣殼：衣殼及其包裹的核酸基因組（芯髓）的合稱。殼粒：由一定數(shù)量的蛋白亞基以異常的方式聚攏形成在電子顯微鏡下可見的形態(tài)單位衣殼的功能1.保護(hù)核酸，免受核酸酶或其他影響因素的破壞2.與宿主細(xì)胞受體結(jié)合并促使病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞3.良好的抗原病毒的對稱性按照殼粒數(shù)目和羅列不同,三類典型形態(tài)的病毒：螺旋對稱動物病毒中螺旋對稱的病毒均屬有囊膜的單股RNA病毒二十面體對稱有20個等邊三角形構(gòu)成12個頂、20個面、30個棱的立體結(jié)構(gòu)。除痘病毒外，所有脊椎動物DNA病毒均為二十面體復(fù)合對稱痘病毒和噬菌體，看不到單純的正二十面體對稱和螺旋樣對稱囊膜(envelope)：有的病毒在核衣殼外包裹著一層薄膜，為雙層脂質(zhì)膜，由脂類蛋白和寡聚糖組成纖突(spike)或膜粒:病毒表面的糖蛋白突起物囊膜和纖突構(gòu)成病毒的表面抗原，與病毒的宿主細(xì)胞嗜性、致病性以及免疫原性有密切關(guān)系。有囊膜的病毒稱囊膜病毒，無囊膜的稱裸露病毒。纖突可介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合（吸附），刺激機體產(chǎn)生中和抗體。亞病毒：朊病毒：致病性蛋白質(zhì)顆粒（Prion）。沒有核酸，只含有蛋白成分，是牛海綿狀腦病、綿羊癢病病原類病毒：侵染性核糖核酸（RNA），只含有核酸，沒有蛋白，主要侵犯植物假病毒：衣殼包裹宿主細(xì)胞的核酸三、病毒的化學(xué)組成1.核酸DNA病毒多數(shù)為雙股、線狀RNA病毒多數(shù)為單股線狀，不分節(jié)段正股：病毒核酸與mRNA的堿基序列相同。負(fù)股：病毒核酸與mRNA的堿基序列互補。感染性核酸：病毒在去除其囊膜和衣殼后，裸露的DNA或RNA仍能感染細(xì)胞，這樣的核酸成為感染性核酸。普通不分節(jié)段。其本身能作為mRNA或能利用宿主細(xì)胞的酶轉(zhuǎn)錄生成mRNA。2.蛋白質(zhì)所有衣殼蛋白和囊膜的主要成分。結(jié)構(gòu)蛋白：組成病毒體的蛋白成分。包括：衣殼蛋白、囊膜蛋白或纖突蛋白等非結(jié)構(gòu)蛋白：在病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的某些中間產(chǎn)物，參加病毒的復(fù)制和組裝過程，并不一定存在于成熟的病毒粒子中。具有酶的活性或其他功能3.脂質(zhì)主要存在于囊膜中，主要來源于宿主細(xì)胞膜系統(tǒng)。含脂質(zhì)的病毒對乙醚或其它有機溶劑敏感，處理后可使病毒失去感染性或感染性降低，而無囊膜病毒對乙醚有抵御力。4.糖類以糖蛋白形式存在(纖突)，由病毒的基因組編碼。病毒的復(fù)制復(fù)制：病毒以其基因組為模板，借助于DNA或RNA聚合酶，分離合成其基因及蛋白質(zhì)，再組裝成殘破的病毒顆粒。感染比（MOI)：指一個系統(tǒng)中感染病毒的細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)之比。是用來表示病毒滴度的一個指標(biāo)。接種高M(jìn)OI的病毒，使所有細(xì)胞幾乎同時受到病毒感染?？色@得病毒的一步生長曲線。病毒的復(fù)制周期：從病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞開始，經(jīng)過基因組的復(fù)制，最后釋放出來，稱為一個復(fù)制周期。主要包括吸附、穿入和脫殼、生物合成、組裝和釋放四個延續(xù)的步驟。吸附第一階段：病毒與細(xì)胞接觸，靜電結(jié)合（非特異性、可逆）第二階段（真正的吸附）：病毒表面位點與宿主細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合。與異常受體的結(jié)合是病毒特異性的，是限制病毒感染的關(guān)鍵步驟。病毒受體：宿主細(xì)胞表面的異常結(jié)構(gòu)，多為糖蛋白，有的為糖脂。穿入和脫殼病毒吸附宿主細(xì)胞膜上后，可通過多種穿入方式進(jìn)入細(xì)胞：①內(nèi)吞小體脫殼(病毒胞飲)②囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，病毒核衣殼直接進(jìn)入細(xì)胞漿③核膜脫殼④細(xì)胞表面酶類協(xié)助病毒脫殼生物合成在病毒感染細(xì)胞后的一個短時光內(nèi)，病毒粒子徹低出現(xiàn)，甚至在細(xì)胞內(nèi)也找不到傳染性的病毒顆粒，直至數(shù)小時后子代病毒粒子浮上為止，這段時期稱為蘊藏期。是病毒增殖過程中最主要的階段。此期在病毒基因指令下，利用細(xì)胞的場所和原材料舉行生物合成。包括病毒核酸的復(fù)制和病毒蛋白質(zhì)的合成。①mRNA轉(zhuǎn)錄：是蛋白質(zhì)合成的第一個主要步驟。需要各種聚合酶（自身編碼或細(xì)胞內(nèi)）②mRNA翻譯：譯制出具有病毒信息的酶以及其他早期蛋白質(zhì)(用于抑制細(xì)胞的正常生物合成)。③病毒核酸的復(fù)制④mRNA再度轉(zhuǎn)錄⑤mRNA再度翻譯：合成晚期蛋白，包括病毒衣殼蛋白以及其他結(jié)構(gòu)蛋白。組裝和釋放核酸進(jìn)一步被修飾，病毒蛋白亞單位以最佳物理方式形成衣殼。組裝：病毒核酸進(jìn)入衣殼形成殘破的病毒粒子。釋放：無囊膜病毒通過極迅速度合成造成病毒粒子在胞漿中大量積聚，使細(xì)胞脹破釋放出病毒。有囊膜病毒釋放過程就是病毒核衣殼獲得囊膜的過程。病毒的遺傳和進(jìn)化一、突變是病毒核酸復(fù)制過程中不可避免的錯誤。致命,不再具有存活和復(fù)制的能力—致死性突變適應(yīng)環(huán)境挑選（極少數(shù)）—非致死性突變基因組變異替換：單個核苷酸，點突變。缺失或插入：小段或大段核苷酸。點突變發(fā)生的機率最大，小片段核苷酸缺失或插入次之,大片段核苷酸缺失發(fā)生的很少。突變的核苷酸有可能發(fā)生回復(fù)突變或抑制性突變。缺損型干擾(DI)突變株：大多數(shù)病毒能產(chǎn)生DI突變株,這些突變株自身不能復(fù)制，惟獨在親本野生株作為輔助病毒存在時才干復(fù)制，但它又會干擾親本病毒的復(fù)制，導(dǎo)致后者數(shù)量減少。表型變異表現(xiàn)為病毒顆粒的理化特性和復(fù)制性質(zhì)的改變。準(zhǔn)種：指由一種母序列和來自該序列的大量相關(guān)突變基因組所組成的病毒群體。是對病毒“種”概念的補充。充足體現(xiàn)了病毒的動態(tài)進(jìn)化過程。二、基因重組兩種不同的病毒或同一種病毒的兩個不同毒株同時感染同一細(xì)胞時,在核酸復(fù)制過程中發(fā)生的核酸水平的互換。包括重組、重配或復(fù)活。1.重組：將兩個有親緣關(guān)系但生物學(xué)性狀不同的毒株感染同一個宿主細(xì)胞，可發(fā)生核酸水平上的互換，產(chǎn)生兼有兩個親本特性的子代。2.重配：發(fā)生在基因組分節(jié)段的RNA病毒，病毒的兩個毒株在同時感染某一個細(xì)胞時，通過交換RNA節(jié)段而舉行的重組，或稱重排。3.復(fù)活：又稱增殖性復(fù)活，指用同一株病毒產(chǎn)生不同程度致死性突變的若干病毒顆粒同時感染某一細(xì)胞時，病毒重新具有傳染性。三、病毒基因產(chǎn)物間的互相作用補償作用：在感染的細(xì)胞中,病毒蛋白質(zhì)之間因為互相作用的結(jié)果，拯救了一種或兩種病毒或增強了病毒的產(chǎn)量。表型混合：兩種病毒混合感染細(xì)胞后，子代病毒獲得二者表型特性。四、誘變定點誘變：分子雜交技術(shù)、PCR、核苷酸測序技術(shù)病毒與細(xì)胞的互相作用一、病毒的細(xì)胞培養(yǎng)(病毒增殖的主意)動物接種優(yōu)點：操作容易缺點：動物體內(nèi)存在特異性抗體，動物體內(nèi)帶有病毒雞胚培養(yǎng)優(yōu)點：經(jīng)濟(jì)，簡便，雞胚易得缺點：有些雞胚帶有母源抗體，可能帶有病毒，無數(shù)病毒在雞胚中不生長組織培養(yǎng)將離體的活組織塊或凝聚的活細(xì)胞加以培養(yǎng)，統(tǒng)稱為組織培養(yǎng)，后者又稱單層細(xì)胞培養(yǎng)。優(yōu)點：細(xì)胞的生理特性基本一致，對病毒的易感性相等。沒有實驗動物的個體差異，不涉及動物保護(hù)問題，實驗數(shù)量有保障，可舉行標(biāo)準(zhǔn)化實驗，可重復(fù)性好。①原代細(xì)胞：用胰酶等凝聚劑將動物組織消化成單個的細(xì)胞懸液，再生長于培養(yǎng)器皿中。腎細(xì)胞和睪丸細(xì)胞最常用，分離病毒最為敏感。②二倍體細(xì)胞：將長成單層的原代細(xì)胞消化凝聚成單個細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣。③傳代細(xì)胞系：能在體外持續(xù)增殖傳代的細(xì)胞系，大多數(shù)由癌細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突變而來，可無限增殖。三、細(xì)胞內(nèi)病毒增殖的鑒定1.細(xì)胞變化：①細(xì)胞病變（CPE）：由病毒增殖引起的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。常見的細(xì)胞變化為細(xì)胞圓縮、壞死、崩解或脫落。有些病毒能形成包容體。②包容體：是細(xì)胞在感染病毒后，浮上于胞漿和胞核內(nèi)的特征性形態(tài)變化?？赏ㄟ^固定、染色，在顯微鏡下檢測到。③合胞體：是病毒感染細(xì)胞后導(dǎo)致感染細(xì)胞及相鄰細(xì)胞細(xì)胞膜融合的產(chǎn)物，表現(xiàn)為若干細(xì)胞的相鄰細(xì)胞膜出現(xiàn)，成為多核巨細(xì)胞。④細(xì)胞凋亡：病毒感染造成的細(xì)胞程序性死亡。凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化；細(xì)胞DNA被降解形成梯帶，是宿主細(xì)胞重要的防御機制。2.血吸附作用：是一種異常形式的血凝作用，是將紅細(xì)胞吸附于病毒感染的宿主細(xì)胞表面，用于病毒檢測。3.細(xì)胞代謝的改變4.病毒的干擾現(xiàn)象：兩種不同種類的病毒同時接種于一個培養(yǎng)容器時，一種病毒的增殖對另一種病毒的增殖展示顯然的抑制作用。5.熒光抗體法（酶標(biāo)記抗體法）病毒感染細(xì)胞一定時光后，向細(xì)胞參加特異性的病毒抗體，再參加特異性的熒光標(biāo)記二抗，在熒光顯微鏡下看見。有特異性的黃綠色熒光浮上的為陽性，否則呈紅色。6.中和實驗特異性抗體能夠抑制病毒感染或降低病毒在細(xì)胞上的滴度。四、病毒數(shù)量與感染力的測定1.蝕斑：又稱空斑，是病毒在已長成單層的細(xì)胞上形成的局限性病灶。一個蝕斑由一個以上感染性病毒體復(fù)制形成，類似于細(xì)菌的菌落。蝕斑測定：將10倍梯度稀釋的病毒懸液參加單層細(xì)胞中培養(yǎng)，病毒吸附細(xì)胞后，再籠罩一層融化的0.5%瓊脂。病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后產(chǎn)生局限性病灶，逐漸擴(kuò)大，肉眼可見。蝕斑形成單位（PFU）:表示病毒懸液中的感染性病毒濃度，通常以每毫升病毒懸液中含有多少個PFU表示。2.ID50半數(shù)感染量TCID50半數(shù)細(xì)胞感染量EID50半數(shù)雞胚感染量病毒感染雞胚、動物或細(xì)胞后，引起50％發(fā)生病變的病毒最小量。半數(shù)動物致死量（LD50）：病毒感染動物后，引起半數(shù)動物死亡的病毒最小量。病毒載量：動物血液中的病毒數(shù)量。RNA干擾：細(xì)胞利用內(nèi)源或外源性的小分子雙股RNA片段，特異性的降解同源基因的mRNA，從而導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。用于抗病毒感染研究。病毒干擾：缺陷型病毒(DI)突變株和干擾素干擾素：屬于正常細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白即細(xì)胞因子。是細(xì)胞對強烈刺激時的一過性分泌物，不是細(xì)胞持續(xù)合成的。病毒的致病機理一、病毒對細(xì)胞的傷害1.細(xì)胞自身蛋白質(zhì)和核酸代謝發(fā)生障礙，及病毒粒子的堆積，造成細(xì)胞死亡2.病毒物質(zhì)的直接毒性作用。3.細(xì)胞性繼發(fā)作用，細(xì)胞自身的酶性活動（溶酶體）。4.核型紊亂。5.有些病毒可直接溶解動物紅細(xì)胞。6.細(xì)胞自身抗原成分發(fā)生變化。（自身免疫?。┏掷m(xù)性感染：病毒在體內(nèi)持續(xù)存在，達(dá)數(shù)月或終生。無論發(fā)病或不發(fā)病，感染后會持續(xù)排毒?？赡芎苓t才發(fā)生免疫病理病或腫瘤病。預(yù)后大多不良。宿主范圍窄，有遺傳傾向?？煞譃椋郝穹腥荆翰《净蚪M存在于一定的組織或細(xì)胞中，不產(chǎn)生有感染性的病毒體，在一定條件下可被激活而急性發(fā)作。急性發(fā)作期可以檢測到病毒的存在。慢性感染：顯性或急性感染后，病毒未徹低清除，可持續(xù)存在于血液和組織中，并不斷排出體外，感染全過程可檢出或分離到病毒。遲發(fā)性臨床癥狀的急性感染：此類病毒的持續(xù)性復(fù)制與疾病的進(jìn)程無關(guān)，如貓全白細(xì)胞減少癥病毒。分子模擬：指宿主細(xì)胞成分與病毒蛋白質(zhì)之間存在分子結(jié)構(gòu)的線性或構(gòu)象同源性。若病毒及宿主的抗原決定簇既相似又不相同,即二者的相似程度足以引起交錯反應(yīng),但差異程度又能突破正常的免疫耐受,這樣的分子模擬就會導(dǎo)致自身免疫病。病毒的檢測一、病毒的分離和鑒定1.標(biāo)本的采集和運送要分離到病毒，首先要采集含有充足量活病毒的標(biāo)本。必須注重采集部位、時光及運送過程。①標(biāo)本采集部位：按照臨床癥狀、流行病學(xué)舉行分析，初步判斷可能是哪一種病，再決定采集何種標(biāo)本。采集到的標(biāo)本應(yīng)趕緊浸泡于生理鹽水、PBS或細(xì)胞培養(yǎng)液中。②標(biāo)本采集時光：普通越早越好。晚期可能發(fā)生繼發(fā)感染，或體內(nèi)產(chǎn)生抗體。③標(biāo)本的運送：需低溫保存，要避免反復(fù)凍融。2.標(biāo)本的處理將組織標(biāo)本中的病毒游離出來和除菌。①研磨與稀釋②除菌處理：采集標(biāo)本時應(yīng)盡可能無菌操作，有細(xì)菌污染時必須除菌，可用抗生素(青霉素鏈霉素)處理。3.標(biāo)本的接種途徑按照病毒的嗜性挑選接種的動物、雞胚或細(xì)胞。4.病毒增殖的判斷①細(xì)胞病變②病毒間的干擾現(xiàn)象③細(xì)胞代謝④血細(xì)胞吸附⑤免疫熒光實驗5.新分離病毒理化性質(zhì)的測定①病毒核酸型鑒定②脂溶劑敏感性實驗(乙醚)③耐酸性實驗④胰蛋白酶敏感實驗⑤耐熱性實驗二、血清學(xué)檢測或鑒定1.用已知抗病毒血清檢測未知病毒抗原將分離到的病毒與已知病毒的標(biāo)準(zhǔn)血清作中和實驗,補體結(jié)合實驗、HI實驗。2.用已知病毒抗原檢測血清中相應(yīng)抗體將分離到的病毒注射動物，制備高免血清與標(biāo)準(zhǔn)病毒作中和實驗。交錯保護(hù)實驗：用分離到的病毒和已知標(biāo)準(zhǔn)病毒分離感染動物，留一組健康動物作對照，經(jīng)一段時光后，用標(biāo)準(zhǔn)病毒襲擊，看見保護(hù)效果。三、病毒顆粒檢測1.電子顯微鏡可直接看見病毒形態(tài)。2.HA3.病毒酶活性測定4.綠色熒光蛋白標(biāo)記四、病毒滴度測定(病毒感染單位)蝕斑實驗PFU、盡頭稀釋法（LD50等）、熒光-斑點實驗、轉(zhuǎn)化實驗、MOI五、病毒核酸檢測分子生物學(xué)技術(shù)：基因組電泳分析、核酸雜交、PCR、酶切圖