干化學(xué)技術(shù)與應(yīng)用-醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)信息網(wǎng)

干化學(xué)技術(shù)與應(yīng)用所謂“干化學(xué)”是與傳統(tǒng)的“濕化學(xué)”（即溶液化學(xué)）相對(duì)比較而言的。它是以被檢測(cè)樣品中的液體作為反應(yīng)媒介，待測(cè)物直接與固化于載體上的干粉試劑反應(yīng)的一種方式。它與傳統(tǒng)濕化學(xué)的最大區(qū)別就在于參與化學(xué)反應(yīng)的媒介不同。隨著生物化學(xué)中酶的分離、提純、存儲(chǔ)等技術(shù)的發(fā)展，傳感器、光度計(jì)和電極技術(shù)的進(jìn)步，以及計(jì)算機(jī)應(yīng)用的普及，干化學(xué)技術(shù)在近20年里得到了長(zhǎng)足的進(jìn)步，相對(duì)于“濕化學(xué)”，“干化學(xué)”具有如下優(yōu)點(diǎn)：

干化學(xué)試劑載體的結(jié)構(gòu)干化學(xué)試劑載體的結(jié)構(gòu)分為二層結(jié)構(gòu)，三層結(jié)構(gòu)，和多層膜。

最簡(jiǎn)單的二層結(jié)構(gòu)

用于生化分析的試劑載體最簡(jiǎn)單的是二層結(jié)構(gòu)，在支持層塑料基片上有一試劑層纖維素片，在纖維素片中預(yù)固相了全部試劑。常見(jiàn)的是尿生化分析試劑條：

尿液中的待測(cè)成分與預(yù)固相在纖維素片上的試劑直接反應(yīng)，通過(guò)反射光度計(jì)測(cè)定其顏色的改變，從而計(jì)算待測(cè)成份的濃度。這種機(jī)構(gòu)只能對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行定性或半定量測(cè)定，這樣就限制了它在其它須準(zhǔn)確定量的標(biāo)本的應(yīng)用。稍加改進(jìn)的三層結(jié)構(gòu)

在試劑層上加一多孔膠膜過(guò)濾層，其作用是將樣品中的雜質(zhì)過(guò)濾掉，并起保護(hù)試劑層作用。常見(jiàn)的是微量法測(cè)定葡萄糖的試劑條。

三層試劑載體的測(cè)定光路是通過(guò)透明的塑料基片，而不經(jīng)過(guò)最上面的過(guò)濾層，這樣消除了樣品中干擾成分的影響，保證了待測(cè)成分測(cè)定的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。比較完善的多層膜

當(dāng)代臨床檢驗(yàn)中的干化學(xué)法，最具代表性的就是多層膜法，即干化學(xué)的多層膜試劑載體。它集現(xiàn)代化學(xué)、光學(xué)、酶工程學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體。

多層膜分為三種類型：比色/速率法干片、離子法干片和免疫速率法干片1.1

介紹比色/速率法干片

比色/速率法干片主要用于常規(guī)生化項(xiàng)目的測(cè)定，干片模式圖(圖1)顯示了一個(gè)臨床化學(xué)比色/速率法干片模式簡(jiǎn)圖。在這個(gè)試劑片中，多種反應(yīng)試劑被固化在一張透明聚酯膜上，上面覆以多孔的擴(kuò)散層，然后被夾在一個(gè)塑料結(jié)構(gòu)中。如圖所示，共有4個(gè)功能層：擴(kuò)散層、試劑層、指示劑層和支持層。每個(gè)試劑片的層數(shù)視所采用的分析方法而定，干片的大小大致與一枚郵票相同，顯色劑層呈現(xiàn)的顏色深淺與待測(cè)物濃度成正比。

擴(kuò)散層：擴(kuò)散層的概念最早是由柯達(dá)研究實(shí)驗(yàn)室EdwinPrzybylowic博士提出的，是由TiO2,BaSO4和醋酸纖維素構(gòu)成的100-300微米的多空聚合物，聚合物的孔徑在1.5－30微米之間。擴(kuò)散層的孔徑和厚度將取決于特定分析的需要。擴(kuò)散層的中空體積占40%－90%，這種毛細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能使樣品溶液快速、均勻地分布到下層。當(dāng)一滴樣品約10微升加在試劑片上后，毛細(xì)作用將樣品迅速吸入多空擴(kuò)散層，但樣品在一瞬間被下面的凝膠層所排斥，因?yàn)槟z層在接受血清組份之前，必須先生成水合物。

擴(kuò)散層不僅可阻留細(xì)胞，結(jié)晶和其他小顆粒，它也可以根據(jù)需要讓大分子，如蛋白質(zhì)等滯留。當(dāng)待檢樣品通過(guò)擴(kuò)散層后，可以消除溶液中影響檢測(cè)反應(yīng)干擾物質(zhì)。擴(kuò)散層中的TiO2和

BaSO4.一方面可用來(lái)掩蓋待檢樣品中的有色物質(zhì)，使反射光度計(jì)的測(cè)定結(jié)果不受影響，同時(shí)這些反光化合物也給干片底層的顯色層提供反射背景。在一些特定試劑片中，擴(kuò)散層中還含有選擇性阻留某種成份或啟動(dòng)某種反應(yīng)的物質(zhì)，以提高分析的特異性。

試劑層：在化學(xué)試劑層中，根據(jù)實(shí)際測(cè)定的需要，可由數(shù)層至數(shù)十個(gè)功能試劑層組成。反應(yīng)區(qū)的功能是將待測(cè)物通過(guò)物理、化學(xué)或生物酶學(xué)等反應(yīng)轉(zhuǎn)化為可與顯色劑結(jié)合的化合物。試劑層中按照反應(yīng)的順序涂布了不同的化學(xué)試劑，使反應(yīng)按照預(yù)先的設(shè)定依次進(jìn)行。針對(duì)不同檢測(cè)項(xiàng)目的個(gè)性化設(shè)計(jì)為化學(xué)反應(yīng)提供了最理想的物理和化學(xué)反應(yīng)環(huán)境－這就是為什么干化學(xué)技術(shù)能夠確保更準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。尿酸干片是使用清除劑層的一個(gè)示例。清除劑層含有抗壞血酸氧化酶，用于將抗壞血酸（維生素C）（一種內(nèi)源性干擾物）轉(zhuǎn)化，對(duì)試劑層中所發(fā)生反應(yīng)不產(chǎn)生干擾。

指示劑層：反應(yīng)底物進(jìn)入指示劑層，在這里發(fā)生顯色反應(yīng)。此層包含染料或相似的指示劑，使反應(yīng)產(chǎn)物到達(dá)指示劑層后生成了有色化合物，其顏色變化與分析物濃度成比例，被反射光檢測(cè)。

II.

非競(jìng)爭(zhēng)法（CRP）

讀數(shù)時(shí)采用定點(diǎn)速率法。待測(cè)物與固相抗體、酶標(biāo)抗體形成夾心“三明治”。加入含底物的免疫洗液后洗去讀數(shù)視窗區(qū)域未結(jié)合物質(zhì)，抗原抗體結(jié)合物與底物反應(yīng)顯色，孵育2.5分鐘時(shí)讀數(shù)670nm發(fā)射光密度與待測(cè)物濃度成正比。

1

反射光度法的原理――干化學(xué)分析法的理論基礎(chǔ)

反射光度法依據(jù)反射介質(zhì)不同，有多種理論。光線進(jìn)入介質(zhì)后出現(xiàn)下列效應(yīng)：

－在照射表面產(chǎn)生反射（和折射）

－內(nèi)部吸收

－在內(nèi)部或照射表面產(chǎn)生散射

這些效應(yīng)的總和決定了光再離開(kāi)介質(zhì)的比率和方向。反射光密度與分析物濃度不呈線性關(guān)系的原因是檢測(cè)到的光信號(hào)包含了反射光和散射光。光通過(guò)各層干片時(shí)，干片內(nèi)部各個(gè)層和表面會(huì)產(chǎn)生散射和反射。

檢測(cè)比色/速率和免疫速率法干片時(shí)采用的是反射分光光度法。強(qiáng)生干化學(xué)技術(shù)反射光理論是Williams,Clapper等提出的。在儀器內(nèi)部光源發(fā)出一束光透過(guò)透明支持層，在試劑層光被有色化合物部分吸收后，在擴(kuò)散層提供的反射面被反射，反射光經(jīng)濾光裝置后回到光度檢測(cè)器被讀數(shù)。光密度由此被轉(zhuǎn)化為電壓讀數(shù)，并計(jì)算成分析物濃度。

干化學(xué)技術(shù)中入射光（IO）100%進(jìn)入干片。有色物質(zhì)吸收一定比例光后反射。反射法檢測(cè)反射光（IR），反射比為R=Ir/Io

反射光密度（DR）公式為DR=log10

反射法中，分析物濃度與DR不成比例關(guān)系。

C不等于Ao（截距）+A1（斜率）*DR

雖然不呈線性關(guān)系，但是結(jié)果仍然可以預(yù)測(cè)。嚴(yán)密的研究建立了患者標(biāo)本濃度與反射光密度間的數(shù)學(xué)關(guān)系。通過(guò)一個(gè)函數(shù)就可完成二者間轉(zhuǎn)換。函數(shù)關(guān)系是使用前通過(guò)定標(biāo)盤載入檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)函數(shù)實(shí)現(xiàn)每種測(cè)試項(xiàng)目的轉(zhuǎn)換。通用定標(biāo)模式

這是用來(lái)把儀器檢測(cè)光密度與分析物濃度建立關(guān)聯(lián)的通用公式。A0、A1、A2是未知的，需經(jīng)定標(biāo)程序計(jì)算得出。g(DR)是將檢測(cè)光密度與分析物濃度關(guān)系線性化的轉(zhuǎn)化函數(shù)。K在每項(xiàng)測(cè)試中是已知常數(shù)。

將DR轉(zhuǎn)換成g(DR)，轉(zhuǎn)換函數(shù)是出廠時(shí)由大量該儀器反復(fù)研究得出的，確保了g(DR)與濃度呈線性關(guān)系。許多分析項(xiàng)目用了二條曲線來(lái)完成分析物濃度的轉(zhuǎn)換。

“DR”曲線及“函數(shù)轉(zhuǎn)換”曲線，二者在通過(guò)原點(diǎn)的直線上相交幾點(diǎn)可以看到二者呈鏡像關(guān)系。將它們疊加后，結(jié)果將全部落在直線上。正是引入“函數(shù)轉(zhuǎn)換”的目的。當(dāng)然，此圖8只是為了便于理解而畫的比較規(guī)律，實(shí)際更為復(fù)雜。

函數(shù)轉(zhuǎn)換曲線與定標(biāo)曲線是相對(duì)應(yīng)的，當(dāng)DR為1.0時(shí)則轉(zhuǎn)化為g(DR)校正讀數(shù)為1.3，當(dāng)DR為0.6時(shí)，校正讀數(shù)應(yīng)為0.4。

g(DR)與通用定標(biāo)模式每個(gè)定標(biāo)品的g(DR)值都定義在通用定標(biāo)模式中，方程式A（圖9）

已知值和未知值定標(biāo)中的已知值有：

C：三個(gè)是標(biāo)品的已知濃度，是通過(guò)定標(biāo)盤載入儀器的

DR：從干片測(cè)得

K：每種項(xiàng)目固定不變由定標(biāo)載入

雖未知但可計(jì)算出，是定標(biāo)參數(shù)：

A0=截距

A1=斜率

A2=曲率

通過(guò)廠家的設(shè)置和用戶端的定標(biāo)操作，每個(gè)標(biāo)本的結(jié)果就可以通過(guò)光信號(hào)值計(jì)算得到。

反射光的反射背景是擴(kuò)散層，光線不通過(guò)已經(jīng)被阻留在擴(kuò)散層上的潛在干擾物，從而避免了對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。這是擴(kuò)散層承擔(dān)排除干擾的基礎(chǔ)。

由試劑片的結(jié)構(gòu)和反射光檢測(cè)技術(shù)可見(jiàn)涂層技術(shù)相對(duì)于溶液化學(xué)分析技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn)：在試劑片中化學(xué)反應(yīng)可以在個(gè)別物理分層中進(jìn)行，如圖所示，前一反應(yīng)的產(chǎn)物可以繼續(xù)進(jìn)入另一層進(jìn)行其他化學(xué)反應(yīng)，從而引導(dǎo)一個(gè)反應(yīng)序列，因此在多層復(fù)合薄膜中的各層可以給出一種特定的環(huán)境用以完成某種特定的反應(yīng)。這一點(diǎn)溶液化學(xué)分析是無(wú)法完成的，例如乳糜血的樣品，在進(jìn)行溶液方式生化分析時(shí)，就需要先脫脂，然后進(jìn)行分析，而利用多層復(fù)合膜技術(shù)，即可在一個(gè)薄膜上一次完成全部反應(yīng)，明顯提高了分析的特異性。同時(shí)由于沒(méi)有溶液對(duì)待檢樣品的稀釋作用，所以本方法也可大大提高了檢測(cè)的靈敏度。這種能夠?qū)嵤讉€(gè)連續(xù)的物理和或化學(xué)反應(yīng)而無(wú)需操作者介入的方法，就像計(jì)算機(jī)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的芯片技術(shù)，可以使繁雜的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備和各種器皿聯(lián)合完成的工作固化在一個(gè)多層復(fù)合薄膜上，極大的簡(jiǎn)化了操作和提高重復(fù)性及穩(wěn)定性。因此，在短短的十幾年時(shí)間里，干化學(xué)技術(shù)即在世界各臨床化學(xué)實(shí)驗(yàn)室廣為應(yīng)用。

經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展，目前干化學(xué)試劑已可進(jìn)行近70余項(xiàng)化