食品中氨基酸及蛋白質(zhì)的測定(實驗報告)

測定食品中的蛋白質(zhì)凱氏定氮---2013.3.25組員：***實驗目的：（1）會測定食品中粗蛋白的含量。（2）明確常見的食品蛋白質(zhì)含量，以及測定原理。實驗原理：將被檢樣品加入濃硫酸，以硫酸銅，硫酸鉀為催化劑共同加熱消化食品中蛋白質(zhì)分解為氨，并與硫酸結(jié)合成硫酸銨，通過堿化蒸餾，使氨分離出來，用硼酸吸收形成硼酸按后，再用鹽酸標準溶液滴定，根據(jù)消耗的標準鹽酸的體積，通過換算系數(shù)，可測定食品中蛋白質(zhì)的含量。實驗儀器：凱氏燒瓶、可調(diào)式電爐、定氮蒸餾裝置試劑：①硫酸銅CuSO4.5H2O②硫酸鉀③硫酸（密度為1.8149g/L）④40g/L硼酸溶液⑤混合試劑；1g/L甲基紅乙醇溶液與1g/L亞甲基藍乙醇溶液，用時按2：1的比例混合。實驗步驟:樣品消化：準確稱取固體樣品1.0~5g（半固體樣品2~5g，液體樣品10~20mL,使試樣中含氮30~40mg）,小心移入干燥潔凈的100mL或500mL凱氏燒瓶中，然后依次加硫酸銅0.4g、硫酸鉀6g、濃硫酸20mL、玻璃珠數(shù)粒、輕輕搖勻后，按圖5-1安裝消化裝置。將凱氏燒瓶45樣品消化：準確稱取固體樣品1.0~5g（半固體樣品2~5g，液體樣品10~20mL,使試樣中含氮30~40mg）,小心移入干燥潔凈的100mL或500mL凱氏燒瓶中，然后依次加硫酸銅0.4g、硫酸鉀6g、濃硫酸20mL、玻璃珠數(shù)粒、輕輕搖勻后，按圖5-1安裝消化裝置。將凱氏燒瓶45°斜放在電爐上，與瓶口放一漏斗，緩慢加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫停止后，加大火力，保持液面微沸至溶液呈藍色透明時，繼續(xù)加熱0.5-1h，取下凱氏燒瓶冷卻至室溫后，再緩慢加入20mL水。0.1000mol鹽酸標準溶液的標定0.1000mol鹽酸標準溶液的標定:1.標定步驟用稱量瓶按遞減稱量法取在270-300℃灼燒至恒重的基準無水碳酸鈉0.15-0.22g（稱準至0.0002g），放入250ml錐形瓶中，以50ml蒸餾水溶解，加溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑10滴（或以25ml蒸餾水溶解，加甲基橙指示劑1-2滴），用0.1mol/L鹽酸溶液滴定至溶液由綠色變?yōu)榘导t色（或由黃色變?yōu)槌壬?，加熱煮?分鐘，冷卻后繼續(xù)滴定至溶液呈暗紅色（或橙色）為終點。平行測定3次，同時做空白試驗。以上平行測定3次的算術(shù)平均值為測定結(jié)果。2.計算CHCL=(m×1000)/【(V1-V0)×52.99】式中：m---基準物無水碳酸鈉的質(zhì)量，gV1---鹽酸溶液的用量，mlV0---空白試驗中鹽酸溶液的用量，ml52.99---1/2Na2CO3摩爾質(zhì)量，g/molCHCL---鹽酸標準溶液的濃度，mol/L蒸餾、吸收蒸餾、吸收:微量蒸餾按圖5-3安裝好定氮蒸餾裝置。在水蒸氣發(fā)生瓶中裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，保持水呈酸性（淡紅色），加熱煮沸，將消化液轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中定容、搖勻。接受瓶內(nèi)加入10ml4%硼酸溶液和一滴混合指示劑，置于蒸餾裝置的冷凝管下口，浸入硼酸溶液中，取10ml稀釋樣液，移入反應室，并用少量蒸餾水沖洗，塞緊玻璃塞，然后向反應室加入10mL400g/L氫氧化鈉溶液，立即塞緊玻璃塞，加水密封。蒸餾至硼酸吸收液中指示劑變?yōu)榫G色開始計時，繼續(xù)蒸餾10min后，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，沖洗冷凝管管口。取下接受瓶，用0.1000mol/L的鹽酸標準溶液標定至終點，同時做空白實驗，記錄空白滴定消耗鹽酸標準溶液的體積。數(shù)據(jù)處理：標定0.1000mol/L鹽酸標準溶液平行樣1平行樣2平行樣3碳酸鈉質(zhì)量0.21290.16980.1602消耗鹽酸體積/mL40.9032.5131.50鹽酸濃度/mol/L0.09820.09870.0959平均值0.0976平均偏差%0.1133相對平均偏差%1.161樣品蒸餾液1樣品蒸餾液2樣品質(zhì)量/g22取消化液的體積/mL1010消耗鹽酸體積/mL5.705.65蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)%24.8524.63平均值%24.74平均偏差%0.11相對平均偏差%0.45微量蒸餾按下式計算：X=F式中X食品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)，%;V滴定試樣時消耗鹽酸標準滴定溶液的體積，mL;V0空白試驗時消耗鹽酸標準滴定溶液的體積mL；C鹽酸標準滴定溶液的濃度；0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol;m試樣的質(zhì)量，g;F氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)。注意事項：①本實驗對蛋白質(zhì)含量進行測定，因樣品中常含有核酸、生物堿、含氮類脂以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物，故結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量。②為減少實驗誤差，所有試劑溶液應用無氨蒸餾水配置。③消化過程要不斷轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以利于附著在燒瓶上的固體殘渣被洗下，促進其消化；同時為防止造成氮損失，不要用強火，應保持緩和沸騰。④樣品中含脂肪或糖較多，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫外溢，在消化開始時用小火加熱，并時時搖動，并可以加入少量辛醇、液體石蠟或硅油消泡劑，并控制熱源強度。⑤一般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30min即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時，呈較深綠色。⑥當樣品消化液不易呈透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30%過氧化氫2-3mL后繼續(xù)加熱消化。⑦蒸餾裝置應密封，防止漏氣；蒸餾過程中不得?；饠鄽?，防止放生倒吸，消化液呈藍色不生成氫氧化銅沉淀，說明蒸餾前加堿量不足，要再增加氫氧化鈉用量；蒸餾完畢后，應先將冷凝管下端提高液面，清洗管口，再蒸餾1min，而后關(guān)掉熱源，否則可能造成吸收液倒吸。⑧硼酸吸收液的溫度不應超過40°C，否則對氨的吸收