PCR技術(shù)及其應(yīng)用實例和前景分析研究 環(huán)境工程專業(yè)

PCR技術(shù)及其應(yīng)用實例和前景分析研究環(huán)境工程專業(yè)摘要：PCR(ploymersechainreaction)技術(shù)[1]，即聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，又稱基因體外擴增技術(shù)或和核酸體外擴增技術(shù)，利用兩種與相反鏈雜交并利用附著于目標(biāo)DNA兩端的寡核苷酸引物在高溫(95°C)使目標(biāo)DNA片斷的DNA雙鏈變性，分解為單鏈，在較低溫度(37-63°C)與引物退火，然后變溫到72°C左右。在耐高溫DNA聚合物酶的作用下引物被沿樣板DNA單鏈延伸合成互補鏈，然后有變性→退火→延伸反復(fù)進行。引物大大過量，dNTP過量，酶在高溫中是較穩(wěn)定的，這樣經(jīng)過幾十個循環(huán)，目標(biāo)DNA片斷就按2的n次方遞增，用此法可以從mRNA中，cDNA庫中擴出目標(biāo)基因?？傊?，生物體內(nèi)核酸的復(fù)制是半保留復(fù)制，PCR技術(shù)就是在體外對此進行復(fù)制模擬。關(guān)鍵詞：PCR技術(shù)；DNA；應(yīng)用；工程效益擴大1引言人類利用微生物的實踐具有悠久的歷史，公元前，人類就已經(jīng)利用天然的微生物（酶）生產(chǎn)奶酪和酒。進入工業(yè)革命時代，人們開始對天然微生物進行篩選和誘變，生產(chǎn)某些簡單的代謝產(chǎn)物，氨基酸，維生素和抗生素。20世紀(jì)60年代至今，隨著人類雖微生物認識的加深，DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)，發(fā)酵技術(shù)的提高：更多的微生物可產(chǎn)生各種各樣的抗生素，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物學(xué)(MedicalMicrobiology)中；更多微生物被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生促生物質(zhì)，有利于人和動植物的生長，對農(nóng)業(yè)科學(xué)(Agriculture)有著極重要的支持；還有些微生物的代謝產(chǎn)物是重要的化工原料，加速了化工產(chǎn)業(yè)(ChemicalIndustry)的完善；再有些微生物被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)鑒定(Forenic)、醫(yī)學(xué)(MedicalScience)、環(huán)境監(jiān)測(EnvironmentSupervise)分子克隆(MemberClone)、序列分析(AlignmentAnalysis)、考古研究(ArchaeologySearch)等重要學(xué)科，具有廣泛的應(yīng)用前景，這就是我要介紹的PCR技術(shù)。2PCR技術(shù)原理下面我通過摘錄了一個實驗[2]，來介紹一下PCR技術(shù)的過程及其原理(至于它詳細的實驗過程和方法詳見參考文獻)。.在94°C高溫下雙鏈變性，分離出DNA單鏈的模板，然后降溫(55°C)，然添加的與DNA單鏈配對，緊接著溫度升高(72°C)，在DNA聚合酶的作用下，脫氧核苷三磷酸開始滲入，并從引物的結(jié)合端開始，按5ˊ-3ˊ方向延伸，合成出新生的DNA互補鏈，這一過程稱為一循環(huán)，然后重復(fù)該循環(huán)，模板DNA被大量復(fù)制。在此，我要特別強調(diào)幾點注意事項，這也是這個實驗設(shè)計者提醒我們需要注意的地方：(1)在配置PCR反映體系的過程中，Taq酶應(yīng)在加入dNTP混合物后加入，因為有些酶的3ˊ-5ˊ的外切酶反應(yīng)較強，反映體系如果不含dNTP，反應(yīng)體系中的引物可能被分解。(2)非特異性擴增產(chǎn)物，可能是模板有與引物同源性高的其他位點，其次是復(fù)性溫度太低，適當(dāng)提高復(fù)性溫度就可以解決這些問題。以上實驗可清楚明了地向我們展示PCR技術(shù)的原理。3PCR技術(shù)分類PCR技術(shù)自從1985年由Millus創(chuàng)立后，經(jīng)歷了20年的飛速發(fā)展，是傳統(tǒng)微生物學(xué)與現(xiàn)代基因?qū)W之間的完美結(jié)晶，已成為當(dāng)今世界上不可或缺的一項重要的微生物應(yīng)用技術(shù)，下面我將介紹幾種常用的PCR技術(shù)[3]3.1反轉(zhuǎn)錄PCR反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)即以RNA分子為模板的擴增技術(shù)，主要用于克隆cDNA、檢測RNA病毒、合成cDNA探針機構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。3.2定量PCR定量PCR(quantitativePCR)的基本原理是。假定其反應(yīng)產(chǎn)物的數(shù)量同反映混合物中起始模板的mRNA或DNA的量成正比，因此通過瓊脂糖電泳樣品條帶得比較，便可以確定兩種PCR產(chǎn)物之間的數(shù)量關(guān)系。另外定量PCR還有廣義和狹義之分[4]，在此就不詳細介紹了。3.3實時熒光定量PCR所謂實時熒光定量PCR(real-timequantitativePCR)技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用映光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過校正曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，還具有特異性更強、有效解決了PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。3.4重組PCR重組PCR(recombinantPCRRP-PCR)是指用PCR法在DNA片段上進行點突變，即擴增產(chǎn)物中含有域模板序列不同的堿基。利用重組PCR可造成DNA片段的堿基插入或缺失，從而研究目的基因片段的功能。3.5反向PCR反向PCR(inversePCRIP-CR)是對一個已知的DNA片斷序列兩側(cè)的未知序列進行擴增和研究的技術(shù)。3.6多重PCR多重PCR(multiplexPCR)即在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，擴增同一模板的幾個區(qū)域。多重PCR可同時檢測多個突變位點或病原生物，有利于遺傳病和感染性疾病的診斷。3.7不對稱PCR不對稱PCR(asymmetricPCR)即在擴增體系中加入不同濃度的引物，而得到單鏈DNA產(chǎn)物。另外還有幾種新型的、最近興起的PCR技術(shù)[5]，雖不十分成熟，但發(fā)展前景十分廣闊。它們包括：3.8原位PCR原位PCR是指對組織細胞中特異DNA或RNA進行PCR擴增，然后再用原位PCR進行擴增，然后再用原位雜交對擴增產(chǎn)物進行定量分析的一種方法。目前有報道[6]用這種方法可檢測出組織細胞中的人乳頭瘤病毒、艾滋病毒、結(jié)核桿菌等。3.9巢式PCR巢式PCR比常規(guī)PCR靈敏度大大提高，同時第二次擴增又可鑒定第一次擴增產(chǎn)物的特異性。所以這種方法用于臨床檢驗，目前血清中丙型肝炎的監(jiān)測多用這種方法。4.PCR技術(shù)應(yīng)用實例PCR技術(shù)自從建立以來，由于其敏感、高效、操作簡便，在分子生物學(xué)研究、臨床醫(yī)學(xué)和其他很多領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。4.1分子生物學(xué)理論研究[7]如：制備cDNA文庫與篩選，既費錢費時，又需要較多的組織。但如果用PCR技術(shù)，只要很少組織甚至幾個細胞就可以構(gòu)建cDNA文庫，并且大大提高了工作效率。再如：DNA測序、檢測突變堿基、基因重組與融合、用簡并引物法擴增未知序列，無不是PCR技術(shù)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用。4.2臨床醫(yī)學(xué)[8]如：病原體診斷，利用PCR技術(shù)可以檢測標(biāo)本中的病毒、細菌、支原體，直至寄生蟲等病原生物，標(biāo)本可以是組織、血液、細胞、分泌物、排泄物等。以后還發(fā)展了遺傳病基因的診斷、組織器官移植的配型選擇、腫瘤的診斷轉(zhuǎn)移和確定、法醫(yī)學(xué)和其他臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。4.3考古學(xué)[9]由于PCR技術(shù)對基因組的完整性要求不高，因而對分子考古學(xué)極為有幫助，科判定生物種類間的親緣關(guān)系、進化途徑等。如：1997年德國慕尼黑大學(xué)動物研究所科學(xué)家宣稱[10]，他們對歐洲原始人——歐洲尼安德特人化石中的基因殘余物進行分析，結(jié)果表示著名的歐洲原始人尼安德特人不是歐洲現(xiàn)代人的祖先，這一結(jié)果又得到了英國、俄羅斯和瑞典科學(xué)家的進一步證實，為現(xiàn)代人的起源提供了新的論據(jù)。4.4其他領(lǐng)域PCR技術(shù)還在動植物研究領(lǐng)域、組織和群體生物學(xué)等領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用[11]。5.前景與總結(jié)結(jié)合對以上PCR技術(shù)的了解，我認為PCR技術(shù)可以加快實現(xiàn)它的工程化，效益化，如：應(yīng)用在現(xiàn)代環(huán)境工程污水處理工程的微生物載體研究上[12]，PCR技術(shù)暫時只是致力于理論方面和研究方面，它并沒有像其他微生物技術(shù)那樣給人類社會帶來大規(guī)模的經(jīng)濟效益，假如可以實現(xiàn)這一設(shè)想，那么不但PCR技術(shù)本身可以得到更加快速的發(fā)展，而且我們還可以促進經(jīng)濟的發(fā)展。比如說：在傳統(tǒng)的生物發(fā)酵技術(shù)上可以結(jié)合PCR技術(shù)，利用DNA在體外的復(fù)制和雜交，并實現(xiàn)表達，可以實現(xiàn)基因工程的超遠緣雜交的物種突破難進行的問題；再比如：可以通過PCR技術(shù)實現(xiàn)核酸雜交技術(shù)，核酸雜交法比抗原捕獲特異、敏感，但半衰期短，放射性污染不易處理，顯影時間長等缺點，目前國內(nèi)外常用的生物素檢測標(biāo)本中致癌物質(zhì)[13]。另外，還有很多微生物的PCR技術(shù)在工程上的應(yīng)用，這里就不一一列舉了。關(guān)鍵是怎樣擴大在工程上的應(yīng)用，以擴大經(jīng)濟效益。這是PCR技術(shù)的關(guān)鍵。PCR技術(shù)運用傳統(tǒng)生物技術(shù)結(jié)合近代基因工程原理，包含反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)、定量PCR技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)、重組PCR技術(shù)、反向PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)、不對稱PCR技術(shù)等多種傳統(tǒng)PCR技術(shù)和原位PCR技術(shù)、巢式PCR技術(shù)等一系列新興PCR技術(shù)。最新的進展如[14]：結(jié)核桿菌診斷PCR；病毒學(xué)PCR技術(shù)；HIV感染PCR；檢測人COX??；DMS/BMD基因；地中海貧血PCR；血友病A基因…在工業(yè)在分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等眾多領(lǐng)域取得了巨大成就，不但只是局限于研究領(lǐng)域，而且還從實用角度證明了PCR技術(shù)是一項令人類值得自傲的技術(shù)。自從1985年由Millus創(chuàng)立之后，又得到了近二十年的發(fā)展，所以PCR技術(shù)的發(fā)展前景是不可估量的。它絕對是現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)中一項值得發(fā)展的技術(shù)，在當(dāng)今社會乃至未來社會都會有它的立足之地，充分運用它，人類會在文明發(fā)展的進程中，發(fā)出更耀眼的光芒。參考文獻：[1]歐陽平凱,生物科技辭典,化學(xué)工業(yè)出版社,北京,2003.10:342[2]趙斌,何怡紅,微生物實驗,科學(xué)出版社,北京,2002,23(5):11-15[3]孫汶生,黃英才,馬曹紅等,基因工程學(xué),科學(xué)出版社,北京,2004.8:131-136[4]魏平著,關(guān)于定量PCR技術(shù),科學(xué)教育出版社,北京,2001.815:59[5]賀淹才,簡明基因工程原理(第二版),科學(xué)出版社,北京,2005,8:175-197[6]俞華,PCR技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用前景,人民日報,2003.12(5),第7版[7]馬中聲等,分子生物學(xué),教育出版社,北京,2004,7:135[8]陸德如等,現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù),化學(xué)工業(yè)出版社,北京,2002,7:50-52[9]李立家,PCR技術(shù)的應(yīng)用及前景,東北大學(xué)學(xué)報,2002,11:10-15[10]GeogerWhite,ProspectiveofPCRTechnology,Science,2000,5(7):29-32[11]MichaelBrand,MethodsinMolecularMedicine,Vol.26“QuantitativePCRProtocols”Editedby:B.kochanowskiandV.Reischi,HumanapressInc.Totowa,NJ,1999[12]李彥春