TNAIA 0269-2023 牛羊場隱孢子蟲病診斷與防控技術(shù)規(guī)程

ICSICS65.020.30ICSCCSA031

T/NAIA團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/NAIA0269-2023牛羊場隱孢子蟲病診斷與防控技術(shù)規(guī)程Technicalrulesfordiagnosisandcontrolofcryptosporidiosisincattleandsheepfarms2023-12-18發(fā)布 2023-12-31實(shí)施寧夏化學(xué)分析測試協(xié)會(huì) 發(fā)布T/NAIA0269-2023T/NAIA0269-2023T/NAIA0269-2023T/NAIA0269-2023II爛爛爛爛前言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由寧夏化學(xué)分析測試協(xié)會(huì)提出并歸口。市涇源縣動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心、同心縣科技服務(wù)中心。本文件主要起草人：趙正偉、郭亞男、王建東、馬科、楊國虎、李知新、梁小軍、趙濤。本文件為首次發(fā)布。牛羊場隱孢子蟲病診斷與防控技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了規(guī)?；馀Ｈ庋驁鲭[孢子蟲病診斷與防治技術(shù)的術(shù)語和定義、診斷、預(yù)防和治療。本文件適用于規(guī)模肉牛肉羊場隱孢子蟲病的防治。其他肉牛肉羊場參照執(zhí)行。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T35942-2018隱孢子蟲套式PCR檢測方法DB64/T1726-2020牛羊隱孢子蟲病防治技術(shù)規(guī)范NY/T1949隱孢子蟲卵囊檢測技術(shù)改良抗酸染色法術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1隱孢子蟲病Cryptosporidiosis由隱孢子蟲寄生于動(dòng)物胃腸道或呼吸道黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)，引起哺乳動(dòng)物(尤其是反芻動(dòng)物)的嚴(yán)重腹瀉為主要特征的一種人畜共患原蟲病。診斷流行病學(xué)診斷按照流行病學(xué)的特點(diǎn)，做好流行病學(xué)三要素的診斷。臨床診斷病畜出現(xiàn)腹瀉、糞便帶有大量纖維素狀物，有時(shí)含有血液；精神沉郁、厭食、生長發(fā)育停滯，極度消瘦。病理診斷病畜消瘦，脫水；牛回腸和結(jié)腸，羊空腸后段和回腸出現(xiàn)腸道卡他性及纖維素性炎癥，可見出血點(diǎn)。組織學(xué)診斷1T/NAIA0269-2023T/NAIA0269-2023T/NAIA0269-2023T/NAIA0269-2023PAGEPAGE2爛爛爛爛和李氏腺隱窩內(nèi)可觀察到隱孢子蟲寄生，寄生部位的微絨毛脫落或缺失。病原學(xué)診斷飽和蔗糖溶液漂浮法6g～10g；10g～20g2℃～8℃24h5%10%福爾馬林溶液，4℃保存。糞便樣本過濾、離心、涂片制備按照NY/T1949的規(guī)定執(zhí)行。血清學(xué)診斷ELISAODP/N2.1PN+3D為陽性，陰性對照孔無色或接近無色，陽性對照孔明確顯色，直接肉眼觀察結(jié)果?；驒z測診斷DNA（A），RNA（SSUrRNA）PCR（B）gp60DNASSUrRNA830bp，可確定為隱孢子蟲。防控環(huán)境衛(wèi)生清掃積糞，堆積發(fā)酵處理；定期用火焰或5%次氯酸鈉消毒；嚴(yán)禁犬、貓、鳥及其他野生動(dòng)物進(jìn)入飼養(yǎng)區(qū)；滅鼠。發(fā)病后，立即隔離，圈舍、環(huán)境等嚴(yán)格消毒，尸體無害化處理。飼養(yǎng)管理提高抵抗力3％漂白粉10-15min后再清洗，衣服等可采用煮沸消毒。治療大蒜素、苦參合劑等中藥有一定療效，同時(shí)開展支持治療，必要時(shí)采用免疫治療配合進(jìn)行。附錄A（規(guī)范性）反應(yīng)體系與反應(yīng)程序A.1SSUrRNA基因巢式PCR反應(yīng)體系試劑第一輪PCR體積（μL）試劑 第二輪PCR體積（μL）ReagentVolumeoffirstroundPCR(μL)Reagent VolumeofthesecondroundofPCR(μL)11PrimaryPCRProduct 21.251.25F2(10uM) 5R2(10uM) 2.522Mix(2X) 252525ddH2O 1819.519.5表A.2隱孢子蟲SSUrRNA基因巢式PCR反應(yīng)程序反應(yīng)順序Reactionsequence

第一輪反應(yīng)Firstroundreaction

第二輪反應(yīng)Secondroundreaction

循環(huán)數(shù)Numberofcycles預(yù)變性變性退火延伸延伸

94℃,94℃,45s55℃,45s68℃,1min68℃,7min

94℃,94℃,45s55℃,45s68℃,1min68℃,7min

1×35×1×表A.3微小隱孢子蟲的gp60基因巢式PCR反應(yīng)程序反應(yīng)順序Reactionsequence第一輪反應(yīng)Firstroundreaction第二輪反應(yīng)Secondroundreaction循環(huán)數(shù)Numberofcycles預(yù)變性94℃,5min94℃,5min1×變性94℃,45s94℃,45s退火52℃,45s50℃,45s35×延伸68℃,1min68℃,1min延伸68℃,7min68℃,7min1×3附錄B（規(guī)范性）基因引物表B.1PCRSSUrRNA退火溫度（℃）基因Gene

引物序列5‘-3’Primersequence5'-3'

Annealingtemperature(℃)

目的條帶大小（bp）Targetbandsize(bp)SSUrRNA

F1：TTCTAGAGCTAATACATGCGR1：CCCATTTCCTTCGAAACAGGAF2：GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG 55R2：CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA55

1320830表B.2gp60基因位點(diǎn)引物引物序列5‘-3’Primersequence5'-3'

退火溫度（℃）Annealingtemperature(℃)

目的條帶大小