微生物實驗一

革蘭染色細菌特殊結構觀察細菌接種技術新鄉(xiāng)醫(yī)學院微生物學教研室：3029130科教科：3029945

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通過介紹實驗室生物安全方面的相關知識，樹立“有菌的意識，無菌操作的觀念”。掌握革蘭染色方法和細菌接種方法。描述5個視野（細菌基本形態(tài)和特殊結構）。2生物危害源化學危害源物理危害源后兩者的特性：1、可感知，易避免2、危害范圍有限3、危害持續(xù)時間短一、實驗室生物安全醫(yī)學實驗室的主要危害源包括哪些?3一、實驗室生物安全慘痛的歷史教訓

例一：1956年，前蘇聯(lián)的一個實驗室曾有9支裝有感染了委內瑞拉馬腦炎病毒的鼠腦的安瓿被打破。由于沒采取必要的措施，結果在幾天內造成24名工作人員感染。4例二：1998年，我國某大城市的某高校在使用大白鼠進行試驗時，有兩名學生被大白鼠咬傷，還有一些學生在給實驗老鼠放血、解剖的過程中，未按照要求操作，結果在29名實驗人員中，有9人感染了流行性出血熱。

5例三：2004年4月，中國疾病預防控制中心科研人員，采用未經論證的非典病毒滅活方法，在不符合防護要求的普通實驗室內操作非典感染材料，造成北京、安徽發(fā)生非典疫情。6一、實驗室生物安全實驗室感染的事件曾多次發(fā)生，實驗室人員曾為此付出了沉重的代價。這些感染的主要原因是：防護意識不強；操作失誤，防護條件不足。71.進實驗室必須穿白大衣,不必需的物品不要攜帶入室。2.保持實驗室的安靜和秩序,實驗要認真并作好記錄。3.如有傳染性材料的污染,及時報告老師。4.實驗過程中有儀器和器材的損壞要報告老師并登記。5.實驗后的材料要放在指定容器內。6.離開實驗室前,要用肥皂洗手；接觸過傳染性強的實驗材料要用0.1%的新潔爾滅浸泡消毒。7.值日生要作好值日工作,關好水,電,門窗,方可離開實驗室。8二、革蘭染色(Gramstain)

臨床意義1、鑒別細菌2、有助于研究細菌的致病性3、有助于指導臨床用藥9一一半半結晶紫盧戈氏碘液95%乙醇石碳酸復紅初染

媒染

脫色復染

凡能保留第一種染料結晶紫的藍紫色的細菌叫G+菌，凡能被酒精脫色之后染上復染液石碳酸復紅的紅色的細菌叫G-菌。G+G-（一）原理10

1、菌種白色葡萄球菌和大腸桿菌

2、試劑革蘭染色液

初染液結晶紫媒染液盧戈氏碘液脫色液95%乙醇復染液稀釋石碳酸復紅

3、其它

載玻片染色盤接種環(huán)酒精燈等（二）器材和試劑11沖洗在涂片區(qū)滴上香柏油使用油鏡觀察實驗結果（三）方法與步驟（掌握）

1、細菌涂片的制備

涂片干燥固定

2、染色

初染（結晶紫）媒染（盧戈氏碘液）脫色（95%乙醇）復染（稀釋石碳酸復紅）

吸水紙吸干1min1min30s30s沖洗沖洗沖洗12圖一圖二（四）結果13無菌操作（接種環(huán)滅菌和取菌）涂片的厚度要適中染色的時間控制，一一半半沖洗的方法，不要對著涂片區(qū)沖洗（五）注意事項14三、細菌的特殊結構（示教）

（二毛莢一胞）15161718尋找視野：在使用油鏡之前，必須先經低、高倍鏡觀察，然后將需進一步放大的部分移到視野的中心。增大光照強度：將聚光器上升到最高位置，光圈開到最大。轉高倍鏡頭、滴加鏡油、換油鏡頭：轉動轉換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉動油鏡，在轉換油鏡時，從側面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破載玻片為宜。19物鏡工作距離(mm)低倍目鏡10×5.40高倍目鏡40×0.39油鏡頭100×0.1120調試觀察：觀察目鏡，并慢慢轉動細調節(jié)器至物象清晰為止。［如果不出現(xiàn)物象或者目標不理想要重新尋找，在加油區(qū)之外重找時應按：低倍→高倍→油鏡程序。在加油區(qū)內重找應按：低倍→油鏡程序，不得經高倍鏡，以免油沾污鏡頭。］清洗鏡頭：油鏡使用完畢，先用擦鏡紙擦去鏡頭上和標本上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯（或乙醚）擦去殘余的香柏油，最后再用干擦鏡紙擦干凈。21

透鏡折光率油1.5151.0空氣玻1.52璃

空氣

油鏡原理示意圖22四、細菌的接種方法（掌握）普通固體瓊脂培養(yǎng)基接種法1.平板分區(qū)劃線接種法：分離培養(yǎng)細菌（得單個菌落），得細菌的純培養(yǎng)物為進一步鑒定細菌提供條件。2.斜面固體培養(yǎng)基接種法：用于純菌的移種，可短時間保存菌種。半固體瓊脂培養(yǎng)基穿刺接種法保存菌種或觀察細菌的動力和生化反應液體培養(yǎng)基接種法用于肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等液體培養(yǎng)基的接種231.平板分區(qū)劃線接種-得單個菌落242.斜面接種法253.半固體培養(yǎng)基穿刺接種法保存菌種或觀察細菌的動力和生化反應4.液體培養(yǎng)基接種法用于肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等液體培養(yǎng)基的接種265、細菌生長現(xiàn)象的觀察固體培養(yǎng)基-菌落觀察菌落的形態(tài)、大小、表面、邊緣、濕度、透明度；在血平板上還要觀察溶血情況和色素等。27液體培養(yǎng)基-生長混濁生長（大多數(shù)細菌）沉淀生長（鏈球菌）膜樣生長（專性需氧菌，如結核分枝桿菌、枯草桿菌）28半固體培養(yǎng)基-鞭毛觀察細菌的運動29

實驗報告一、目