第2章 菌種選育及菌種擴培

第二章工業(yè)微生物菌種選育第一節(jié)菌種的來源第二節(jié)微生物菌種的分離篩選第三節(jié)發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育第四節(jié)菌種保藏第五節(jié)微生物菌種的擴大培養(yǎng)目的要求：了解發(fā)酵工業(yè)對微生物菌種的要求熟悉常用的工業(yè)微生物菌種掌握發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選了解微生物菌種選育了解發(fā)酵工業(yè)對生產(chǎn)用菌種的要求及種子擴大培養(yǎng)的目的。掌握生產(chǎn)菌種擴大培養(yǎng)的方法，以及種子質(zhì)量控制的措施。第一節(jié)菌種的來源一、發(fā)酵工業(yè)對微生物菌種的要求二、工業(yè)發(fā)酵常見的微生物種類三、工業(yè)微生物的來源一、發(fā)酵工業(yè)對微生物菌種的要求生長迅速，產(chǎn)量高容易控制選擇缺陷型抗感染不易退化不是病原菌二、工業(yè)發(fā)酵常見的微生物種類

(p47-49)細菌酵母菌霉菌放線菌食用真菌（擔(dān)子菌）病毒、藻類微生物在工業(yè)上的用途很廣，包括化工、醫(yī)藥、食品、水產(chǎn)、國防、紡織、石油勘探和石油化工等方面。目前已被研究過的微生物代謝產(chǎn)物超過1300種，而進行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的尚不足100種；被研究過的微生物酶有近千種，而在工業(yè)上得到利用的不過50種。所以可挖掘的潛力還很大。（一）細菌（Bacteria）

工業(yè)常用的細菌發(fā)酵工業(yè)中常用的細菌：

1.

醋酸菌(Acetobacter)分類：不生芽孢，革蘭氏陰性，好氣。

分兩個菌群：

a.醋單胞菌(Acetomonas)或葡萄糖桿菌(Gluconobacter)

作用：將乙醇氧化成醋酸（最終產(chǎn)品），將葡萄糖氧化生成葡萄糖酸。

b.醋酸桿菌(Acetobacter)

作用：將乙醇→（氧化）→醋酸→CO2

＋H2O

液化顆粒桿菌（Gluconobacter

liquefaciens）：

由葡萄糖生成2,5-二酮葡萄糖酸弱氧化醋酸桿菌（A.suboxydans）：

由葡萄糖及各種糖醇生成對應(yīng)的各種化合物

D-山梨醇→L-山梨糖

D-甘露醇→D-果糖甘油→二羥丙酮2.

黃單胞桿菌(Xanthomonas)

用途：發(fā)酵生產(chǎn)VB12

3.假單胞菌(Pseudomonas)

用途：發(fā)酵生產(chǎn)VB12、丙氨酸、谷氨酸、葡萄糖酸、色素、α-酮基-葡萄糖酸、果膠酶、某些抗生素、類固醇（甾體）的轉(zhuǎn)化，有些菌株可利用烴類生產(chǎn)菌體蛋白(SCP)

。4.微球菌(Micrococcus)作用：能將碳水化合物轉(zhuǎn)化為各種酸類用途：其中谷氨酸微球菌(Micrococcusglutamicus)

的許多變種可生產(chǎn)谷氨酸，經(jīng)過變異以后還能生產(chǎn)其他氨基酸；另外，一些菌株也能利用烴類生產(chǎn)菌體蛋白。5.乳酸菌(Lactobacteriaceae)作用：由糖類生成乳酸的一類細菌。重要的乳酸菌：

鏈球菌(Streptococcus)

四聯(lián)球菌(Pediococcus)

明串珠菌(Leuconostoc)

乳桿菌(Lactobacillus)

其分類學(xué)特征：革蘭氏陽性，不運動性，通性嫌氣性。乳酸菌分為兩個亞族：

a.鏈球菌亞族(Streptococceae)：

同型發(fā)酵——某些菌發(fā)酵只生成乳酸異型發(fā)酵——另一些菌不僅生成乳酸，還生成醋酸、乙醇、CO2

（明串珠菌屬(Lactobacteriaceae)——屬于異型發(fā)酵菌，還生成粘性物質(zhì)——多糖

此菌是制藥工業(yè)生產(chǎn)右旋糖酐、多糖、人造血漿的重要菌；但卻是制糖工業(yè)的有害菌，常使糖汁粘稠而無法加工)

b.乳桿菌亞族(Lactobacilleae)：

德氏乳桿菌(L.delbrukii)——

廣泛用于乳制品工業(yè)和乳酸工業(yè)

巴氏乳酸桿菌(L.pasterianus)

同上

雙歧桿菌純培養(yǎng)的鏡下形態(tài)（革蘭染色，陽性）嗜酸乳桿菌純培養(yǎng)的鏡下形態(tài)（革蘭染色）“福佳”酸乳中的乳桿菌“福佳”酸乳中的球菌“蒙牛”酸乳中的乳桿菌“蒙?！彼崛橹械那蚓?.

腸桿菌科(Enterobacteriaceae)代表菌：大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)

產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacter

aerogenes)來源：動物排泄物（污染，是食品衛(wèi)生和公共衛(wèi)生的重要指標(biāo)）。用途：工業(yè)上利用大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶進行谷氨酸定量分析；利用大腸桿菌制取天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸等；制造天冬酰胺酶；分子生物學(xué)的研究材料。大腸埃希菌純培養(yǎng)的鏡下形態(tài)（革蘭染色，陰性）大腸埃希菌在血瓊脂平板上的菌落特征（10～12h）大腸肝菌（革蘭陰性短桿菌）大腸肝菌（科氏Gram染色陰性，兩端鈍圓，長約2～3

，寬約0.6，多數(shù)有鞭毛，能運動，無莢膜）7.

芽孢桿菌

(Bacillus)用途：是高產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的產(chǎn)生菌。還可用來生產(chǎn)多肽類抗生素、氨基酸、VB12、

2,3-丁二醇、果膠酶等。如枯草芽孢桿菌BF7658是生產(chǎn)淀粉酶的主要菌種

枯草芽孢桿菌AS1.398是生產(chǎn)中性蛋白酶和制造日本獨特風(fēng)味食品納豆的主要菌種

枯草芽孢桿菌純培養(yǎng)的鏡下形態(tài)（革蘭染色）枯草芽孢桿菌在營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落特征（18～24h）8.梭狀芽孢桿菌(Clostridium)

來源：土壤中生芽孢的嫌氣性桿菌用途：由淀粉或糖嫌氣發(fā)酵生產(chǎn)丁二醇、丙酮、丁醇、乙醇、某些有機酸、核黃素等

耐熱梭狀芽孢桿菌可用纖維素和半纖維素生產(chǎn)酒精熱解糖梭菌9.谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium)

作用：以葡萄糖為原料發(fā)酵產(chǎn)生酸用途：如北京棒桿菌AS1.299

鈍齒棒桿菌AS1.542等是谷氨酸和其他氨基酸的高產(chǎn)菌10.產(chǎn)氣短桿菌(Brevibacteriaceae)

用途：氨基酸、核苷酸工業(yè)生產(chǎn)常用的菌種，

也是酶法合成生產(chǎn)輔酶A的菌種

11.

甲烷短桿菌

(Methylotropicbacteria)

用途：以甲烷或甲醇作為碳源生產(chǎn)菌體蛋白12.甲烷產(chǎn)生菌

主要菌：甲烷桿菌(Methanobacterium)

甲烷八疊球菌(Methanosarcina)

甲烷球菌(Methanococcus)

用途：有機廢料的甲烷發(fā)酵13.其他細菌

運動單胞菌(Zymomonas)：酒精發(fā)酵

固氮菌(Azotobacter)：固定大氣中游離的氮根瘤菌(Rhizobium)和農(nóng)業(yè)細菌(Agrobacterium)：固定氮氣并與豆科作物共生發(fā)酵工業(yè)有關(guān)細菌的分類綱要：（二）酵母（Yeast）工業(yè)常用的酵母菌發(fā)酵特性：都能發(fā)酵葡萄糖、果糖、甘露糖，生成酒精和甘油。－有些也能發(fā)酵半乳糖－一般不發(fā)酵戊糖－一些酵母能全部或部分發(fā)酵雙糖、三糖

(如蔗糖、麥芽糖、乳糖、棉子糖等)用途：生產(chǎn)單細胞蛋白。

制取核糖核酸、核苷酸、核黃素、細胞色素C、

輔酶A、凝血質(zhì)、轉(zhuǎn)化酶、乳糖酶等。

利用石油原料生產(chǎn)單細胞蛋白、核酸、有機酸。

利用味精廢液、酒精廢液也生產(chǎn)單細胞蛋白。

工業(yè)常用的酵母菌株：1.啤酒酵母(Saccharomyces

Cerevisiae

Hansen)按細胞的長與寬的比例可分為三組：一組：長︰寬＝１～２，一般小于２。

典型菌：德國2號（RasseⅡ）德國12號（RasseⅫ）用途：糖化淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)酒精和白酒二組：長︰寬＝２。

典型菌：葡萄酒酵母(S.cerevisiae

ellipsoideus)

用途：釀造葡萄酒和果酒，也可用于啤酒、蒸餾酒和酵母的生產(chǎn)。

三組：長︰寬＞２。

典型菌：臺灣396號

特點：耐高滲透壓，可以經(jīng)受高濃度鹽。

用途：甘蔗糖蜜原料生產(chǎn)酒精，亦可生產(chǎn)食用、藥用、飼料用酵母（維生素、蛋白質(zhì)含量高），可提取核酸、麥角醇、谷胱甘肽、細胞色素Ｃ、凝血質(zhì)、輔酶Ａ、三磷酸腺苷。

啤酒酵母純培養(yǎng)鏡下形態(tài)（芽殖方式）啤酒酵母（在SDA培養(yǎng)基上）菌落形態(tài)2.葡萄汁酵母(S.uvarum

Beijerinck

)

卡爾斯伯酵母(S.carlsbergensis)

用途：婁哥酵母(S.logos)

葡萄汁酵母(S.uvarum)

啤酒釀造中典型的下面酵母，又可食用、藥用和飼用，麥角固醇的含量也較高，又是維生素測定菌，可測泛酸、硫胺素、吡哆醇和肌醇。三種

葡萄汁酵母與啤酒酵母的主要區(qū)別：

全發(fā)酵棉子糖

按細胞大小分為三群：第一群：(4.0～10.0)μ×[5.5～16.0(～25)]μ

第二群：(2.5～6.5)μ×[5.0～11.5(～22)]μ

第三群：(3.5～8.0)μ×[5.0～11.0(～20)]μ

3.德巴利酵母

(Debaryo

myces

LodderetKreger-vanKi)

特點：產(chǎn)檸檬酸，能利用烷烴作碳源

4.

漢氏德巴利酵母(D.hansenulaH.etP.Sydow)

用途：能利用酒精作碳源生成乙酸乙酯也可將葡萄糖轉(zhuǎn)化成磷酸甘露聚糖

注意：是酒精生產(chǎn)的有害菌

細胞子囊孢子漢氏德巴利氏酵母5.

畢赤氏酵母

(Pichia

Hansenula)

用途：能利用石油或農(nóng)副產(chǎn)品及工業(yè)廢料生產(chǎn)菌體蛋白，有些菌株能生產(chǎn)麥角固醇、蘋果酸、磷酸甘露聚糖。

6.

粟酒裂殖酵母

(Schizosaccharomyces

pombeLindner)

來源：從非洲人飲用的粟酒中得到，甘蔗糖蜜和水果上也能找到。

用途：用菊芋（鬼子姜）制成的未水解糖液發(fā)酵能得到非常高產(chǎn)量的酒精。7.

產(chǎn)朊假絲酵母

[Candidautilis(Henneb.)L.etKregerv.R.]

異名：食用圓酵母(Torula

utilis

Henneberg)

或食用擬酵母[Torulopsis

utilis

(Henneb.)Lodder]

培養(yǎng)：以尿素和硝酸為碳源，不需加入其它生長因子即可生長。用途：能利用造紙工業(yè)的亞硫酸廢液中的五碳糖和六碳糖，也能利用糖蜜、土豆淀粉肥料、木材水解液等生產(chǎn)食用蛋白質(zhì)。

特點：其蛋白含量和B族維生素的含量都比啤酒酵母高。

細胞假菌絲產(chǎn)朊假絲酵母8.解脂假絲酵母解脂變種

[C.lipolytica

(Harrison)Diddenset

Loddervar.Lipolytca]

來源：動植物油及礦油的物質(zhì)中分離。特點：不發(fā)酵及很少同化糖和醇類，分解脂肪和蛋白質(zhì)的能力很強，能利用煤油等正烷烴。用途：是石油脫蠟和制取菌體蛋白的優(yōu)良菌種，檸檬酸產(chǎn)量也較高(可達14.3mg/mL)，生產(chǎn)ＶB6400mg/mL(以正烷烴為碳源)。石油產(chǎn)品的質(zhì)量與蠟的含量多少有很大關(guān)系：飛機如果使用含蠟量高的汽油，在高空低溫下會使蠟?zāi)唐饋?，堵塞機內(nèi)各條輸油管，使飛機發(fā)生嚴重事故。因此，石油產(chǎn)品需要經(jīng)過脫蠟處理。工業(yè)上有多種脫蠟辦法，但是設(shè)備復(fù)雜，消耗材料和能源也多。專愛吃蠟的石油酵母——解脂假絲酵母和熱帶假絲酵母，完成了脫蠟任務(wù)的同時，含有豐富的蛋白和維生素，成為無毒高蛋白精飼料，用于喂養(yǎng)家禽和家畜，據(jù)說加喂1噸石油酵母飼料，可多生產(chǎn)700多千克豬肉。細胞假菌絲解脂假絲酵母解脂變種9.

熱帶假絲酵母

[C.tropicalis(Cast.)Berkhout]

來源：人體唾液、乳酒、小蝦、牛的盲腸中層

特點：氧化烴類能力強，可利用煤油，亦可用農(nóng)副產(chǎn)品和工業(yè)廢料培養(yǎng)

用途：生產(chǎn)石油蛋白的重要酵母，（在230～290℃石油餾分的培養(yǎng)基中經(jīng)22hr培養(yǎng)后可得到相當(dāng)于烴類重量92%的菌體），可做飼料。細胞假菌絲熱帶假絲酵母10.

白色球擬酵母

[T.candide(Saito)Lodder]

特點和用途：能轉(zhuǎn)化葡萄糖為D-阿拉伯糖醇及赤蘚

醇，利用烴類生產(chǎn)蛋白質(zhì)。11.球形球擬酵母[T.globosa(olsonetHammer)

LodderetKregervanRij]

培養(yǎng)：可生長在濃糖基質(zhì)上，如煉乳、蜜餞、果脯等處。

特點：耐高滲透壓。12.

粘紅酵母粘紅變種［Rhodotorula

glutinis(Fr.)Harrisonvar.glutinis］

特點：能氧化烷烴是較好的產(chǎn)脂肪菌種，脂肪含量可達干物量的50%～60%，但脂肪合成速度緩慢。如果培養(yǎng)液中添加Ｎ及Ｐ，能加快合成速度，產(chǎn)1g脂肪約需4.5g葡萄糖。

深紅酵母在SDA上的菌落特征深紅酵母純培養(yǎng)的鏡下形態(tài)（在米粉土溫80培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d）

常見酵母的分類：

真菌門－－子囊菌綱－原子囊菌亞綱－內(nèi)孢霉目－酵母科－酵母菌屬－啤酒酵母－葡萄汁酵母－裂殖酵母屬－粟酒裂殖酵母－八孢裂殖酵母－漢遜氏酵母屬－畢赤氏酵母屬

－半知菌綱－叢梗孢目－隱球酵母科－假絲酵母屬－產(chǎn)朊假絲酵母－解脂假絲酵母－熱帶假絲酵母－球擬酵母屬－白色球擬酵母－球形擬酵母－紅酵母屬－粘紅酵母粘紅變種

也稱絲狀真菌(FilamentousFungi)分布于真菌門(Eumycetes)的四個綱中：－藻狀菌綱(Phycomycetes)

－子囊菌綱(Ascomycetes)

－擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)

－半知菌綱(Fungiimperfecti)用途：釀酒、制醬、生產(chǎn)酒精、有機酸、抗生素、酶制劑、維生素、甾體激素轉(zhuǎn)化、發(fā)酵飼料、植物生長刺激素、殺蟲農(nóng)藥等，也能引起食物或儀器的霉壞、人畜病害。（三）霉菌（Mould）霉菌的營養(yǎng)體由菌絲構(gòu)成

無橫隔（單細胞）－藻狀菌綱

子囊菌綱菌絲有橫隔（多細胞）擔(dān)子菌綱半知菌綱無性孢子氣生菌絲（分化成繁殖器官）有性孢子無隔菌絲有隔菌絲工業(yè)上常用的霉菌重要的霉菌菌株及產(chǎn)物要點：1.魯氏毛霉[Mucor

rouxianus

(calmette)Wehmer]

來源：我國小曲。功能：糖化淀粉生成酒精，產(chǎn)生蛋白酶。2.

高大毛霉[M.muced

(L.)Fres]

來源：獸畜糞便。功能：產(chǎn)生3-羥基丁酮，琥珀酸，脂肪酶，轉(zhuǎn)化甾族化合物，羥化C-6β、C-11α。毛狀菌落（絲狀真菌菌落形態(tài)之一）3.總狀毛霉[M.rscemosus

Fres]

來源：土壤、空氣、糞便。功能：產(chǎn)生3-羥基丁酮，轉(zhuǎn)化甾族化合物，羥化C-9α。4.

爪哇毛霉[M.javanicus

Wehmer]

來源：土壤、酒曲。功能：產(chǎn)生蛋白酶，果膠酶，轉(zhuǎn)化甾族化合物，羥化C-6β、C-11α。總狀毛霉（PDA）5.微小毛霉[M.pusillis

Lindt]

刺囊毛霉[M.spinosusvanTieghem]

來源：土壤、酒曲功能：轉(zhuǎn)化甾族化合物，前者羥化C-6β、C-11α，

后者有羥化C-9α的能力。6.

葡枝根霉[Rhizopus.stolonifer]

異名黑根霉[R.nigercans]

功能：產(chǎn)生反丁烯二酸、丁烯二酸，果膠酶，對甾族化合物骨架C-6β、C-11α具有羥化能力，轉(zhuǎn)化孕酮為C-11α羥基孕酮更具特色，

是轉(zhuǎn)化甾族化合物的重要真菌，經(jīng)常用來發(fā)酵豆類食品。能引發(fā)食物腐爛。甾族化合物是一類重要的天然產(chǎn)物，廣泛地存在于動植物組織中。例如存在于動物體內(nèi)的膽甾醇、膽汁酸、維生素D、腎上腺皮質(zhì)激素和性激素；存在于植物中的強心苷和甾族生物堿等。它們在生理活動中都起著十分重要的作用。7.米根霉[R.oryzae]

以下形狀與米根霉非常近似的根霉：

河內(nèi)根霉[R.tonkinensis

Vuille-min]

結(jié)節(jié)根霉[R.nodonus

Nannyslowski]

甘薯根霉[R.batas

Nakazawa]

小麥曲根霉[R.tritici

Saito]

代氏根霉[R.delemar

(Boidin)WehemeretHaannzawa]

來源：我國酒藥、酒曲，土壤，空氣。功能：產(chǎn)L-(+)乳酸(量達70%)，淀粉酶(活性相當(dāng)強)，脂肪酶，轉(zhuǎn)化蔗糖。根霉的假根8.華根霉[R.chinensis

Saito]

來源：酒藥、酒曲。功能：淀粉酶，有溶膠性，能產(chǎn)生酒精、芳香脂類、乳酸、反丁烯二酸，能轉(zhuǎn)化甾族化合物，耐高溫(45℃能生長)。9.無根根霉[R.arrhizus

Fischer]

功能：能產(chǎn)生乳酸、反丁烯二酸、丁烯二酸，脂肪酶，能對甾族化合物骨架C-6β、C-11α起羥化作用。少根根霉（低倍鏡見假根）10.紫色紅曲霉[Monascus

purpureus

Went]

來源：乳或乳制品功能：發(fā)酵纖維二糖，產(chǎn)生糊精酶、糖化酶、麥芽糖酶等，水解淀粉最終產(chǎn)物為葡萄糖。

紅曲霉分生孢子著生方式閉囊殼形成（紅曲霉）紅曲：紅曲霉單菌落：11.煙色紅曲霉[M.fuliginosus

Sato]

來源：貴州茅臺酒醪中最多。功能：能發(fā)酵纖維二糖、果糖、蔗糖、山梨醇、

D-阿拉伯糖等生成醇，可制紅曲，食品染色劑，酒、醋，紅曲生產(chǎn)“平湖曲醋”。煙曲霉（蔡氏培養(yǎng)基）煙曲霉（頂囊為燒瓶形，小梗單層）12.

黑曲霉[Aspergillus

niger

VanTieghem]

屬于黑曲霉群的重要菌：

日本曲霉[A.japanicus

Saito]

宇佐美曲霉[A.usamii]

泡盛酒曲霉[A.awamori]功能：具有多種強大的酶系，如淀粉酶、糖化酶、耐酸性蛋白酶、果膠酶、柚苷酶、橙皮苷酶、葡萄糖氧化酶、纖維素酶(CX酶)

能分解有機質(zhì)產(chǎn)生有機酸，如抗壞血酸、檸檬酸、葡萄糖酸、沒食子酸等。轉(zhuǎn)化甾族化合物，測定Mn、Cu、Mo、Zn等。（曲霉）分生孢子頭、分生孢子梗、足細胞黑曲霉（蔡氏培養(yǎng)基）黑曲霉（頂囊球形，小梗雙層）日本曲霉（蔡氏培養(yǎng)基）日本曲霉（頂囊球形，小梗單層）13.米曲霉[A.oryzae

(ahlburg)Cohn]

黃曲霉[A.flavus

Link]

這兩種霉均屬于黃曲霉群功能：能產(chǎn)生曲酸，淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等，分解DNA產(chǎn)生5‘-脫氧胞苷酸、5’-脫氧腺苷酸、5‘-脫氧鳥苷酸、5’-脫氧胸腺嘧啶核苷酸，有些菌能產(chǎn)生黃曲霉毒素(Aflatoxin)。黃曲霉（PDA）黃曲霉（頂囊球形，小梗雙層）14.

橘青霉[Penicillium

citrinum

Thou]

功能：產(chǎn)生橘霉素，脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳酶，有的菌產(chǎn)生5′-磷酸二酯酶，在大米上生長引起黃色病變，并具毒素。桔青霉（蔡氏培養(yǎng)基）桔青霉（帚狀枝由3-4個輪生而略散開的?；鶚?gòu)成）

產(chǎn)黃青霉[P.chrysogenum

Thou]

露地青霉[P.roqueforti

Thou]

展開青霉[P.patulum

Thou]15.其他好食鏈孢霉[N.sitophila]

用途：研究維生素A的材料

白地霉[G.candidum]

用途：可食用和飼用，也可提取核苷酸

粗糙鏈孢霉[N.crassa]

用途：微生物遺傳學(xué)的重要研究材料“不對稱青霉組”（四）放線菌

菌落：呈放射狀菌絲體：基內(nèi)菌絲－緊貼培養(yǎng)基表面形成菌落，分泌黃、橙、紅、紫、綠、灰、褐等水溶性或脂溶性色素氣生菌絲－向空中長出，一定階段后生成孢子絲有線形、波狀、螺旋形、輪生之分，然后形成孢子

?繁殖：靠菌絲斷裂和孢子放線菌形態(tài)A：諾爾斯氏鏈霉菌；B：皮疽諾卡氏菌；C：酒紅指孢囊菌；D：游動放線菌；E：小單胞菌；F：皺雙孢馬杜拉放線菌A：卡特利鏈霉菌；B：弗氏鏈霉菌；C：吸水鏈霉菌金淚亞種；D：卡那霉素鏈霉菌；E：除蟲鏈霉菌；F：生磺酸鏈霉菌《伯杰氏鑒定細菌學(xué)手冊》分類法：

屬于細菌類放線菌目（不包括其中的結(jié)核菌科）來源：在土壤中普遍存在，特別是在中性、堿性和有機質(zhì)豐富的土壤中也可作為動、植物的病原菌被分離得到最大的價值：能產(chǎn)生各種抗生素由于鏈霉素菌屬(Streptomyces)能產(chǎn)生許多抗生素，是放線菌的代名詞瓦克斯曼:1943年發(fā)現(xiàn)鏈霉素

放線菌菌絲依氏放線菌純培養(yǎng)的鏡下形態(tài)（革蘭染色）工業(yè)上常用的放線菌部分放線菌及所產(chǎn)生的抗生素美味佳肴--食用真菌食用菌類一般都是高等真菌的子實體，在我國發(fā)現(xiàn)的不下350多種，常見的有蘑菇、草菇、香菇、平菇、鳳尾菇、金針菇、黑木耳、松口蘑、竹蓀、羊肚菌、牛肝菌等多種。這些食用菌味道鮮美，營養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分。而且某些食用菌對動植物病毒性疾病有免疫或抑制作用，還能抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展，并能溶解一定量的膽固醇，所以被人們稱為“保健食品”。（五）擔(dān)子菌——食用真菌蟲草蟲草是我國的一種名貴野生中藥材，具有補虛損、益精氣、保肺、益腎、止血化痰、滋補強壯等功效。與人參、鹿茸一起列為中國三大補藥。乾隆二十二年（1757年）吳洛儀在《本草從新》中就有"冬蟲夏草甘平保肺，益腎，補精髓，止血化痰，已勞咳，治膈癥皆良"的記載。中醫(yī)認為，蟲草入肺腎二經(jīng)，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽萎遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調(diào)節(jié)陰陽的中藥。冬蟲夏草⑴冬蟲夏草（Cordyceps

sinrnsis(Berk)Sacc）冬蟲夏草是我國800多種中草藥中唯一能夠陰陽雙補的名貴中草藥，《本草從新》形象地描述了冬蟲夏草的形態(tài)特征及生長狀態(tài)，還確認藥用功能為“保氣、益賢、止血、已勞嗽”。（2）蛹蟲草（亦稱北冬蟲夏草）古語曰：寧要蟲草一把，不要金玉滿車；民間則稱之為“活黃金”。全世界已知蟲草類有137種（另一說有350余種），我國已正式發(fā)表的有拉丁學(xué)名的蟲草共68種，其中最為珍貴的只有冬蟲夏草和蛹蟲草，而具備產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)條件的只有蛹蟲草。本實驗室培育的蛹蟲草中文別名

雷窩子(黑龍江)、四孢蘑菇分類地位擔(dān)子菌綱、傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬形態(tài)特征子實體中等至稍大。菌蓋寬3-13cm，初扁半球形，后近平展，有時中部下凹，白色至乳白色，光滑或后期具叢毛狀鱗片，干燥時邊緣開裂。菌肉白色，厚。菌褶初粉紅色，后變褐色至黑褐色，較密，離生，不等長。菌柄較短，粗，圓柱形，有時稍彎曲，長1-9cm，粗0.5-2cm，近光滑或略有纖毛，白色，中實。菌環(huán)單層，白色膜質(zhì)，生菌柱中部，易脫落。孢子印深褐色。孢子褐色，橢圓形至廣橢圓形，光滑，6.5-10×5-6.5μm。生態(tài)習(xí)性春到秋季于草地、路旁、田野、堆肥場、林間空地等，單生及群生。分布地區(qū)河北、黑龍江、吉林、江蘇、香港、臺灣、西藏、陜西、甘肅、山西、新疆、四川、云南及內(nèi)蒙古等地區(qū)。經(jīng)濟用途可食用，能人工栽培和利用菌絲體深層發(fā)酵培養(yǎng)。屬優(yōu)良食菌。含有維生素C、B1、PP等，經(jīng)常食用可預(yù)防腳氣病，身體疲倦、食欲不振、消化不良以及婦女在哺乳期間乳汁分泌減少，還可以預(yù)防毛細血管破裂，牙床及腹腔出血，皮膚粗糙及各種貧血病癥。本種產(chǎn)生野菇菌素(campestrin)，對革蘭氏陽性菌、陰性菌有效。有抗金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌和大腸桿菌及降低血糖的作用。另外還有草酸(Oxalicacid，C2H2O4)等。該菌實驗抗性，對小白鼠肉瘤180的抑制率為80%，對艾氏癌的抑制率為80%。據(jù)記載此菌還可產(chǎn)生甜堿(betaine)和膽堿(choline)等生物堿。蘑菇Agaricus

campestrisL.:Fr.

蘑菇

Agaricus

campestrisL.:Fr.1.子實體，2.孢子12杏孢菇菌肉肥厚，質(zhì)地脆嫩，是味道最好的一種平菇，有“平菇王”之稱，適合保鮮貨架期長，是極受消費者歡迎的美味佳肴雞腿菇雞腿蘑(Coprinus

comatus)

又名毛頭鬼傘,

廣溫型菌類，子實體形似雞腿，白色，肉質(zhì)細嫩，鮮美可口。出菇溫度為8-30℃,出菇期9-12月、翌年2-4月，宜鮮銷和鹽漬鮑魚菇(Pleurotus

abalonus)夏季優(yōu)質(zhì)菇類，其菌蓋大，菌柄短，菇體灰黑色，肉質(zhì)肥厚，脆嫩可口，營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特。栽培季節(jié)3-8月，出菇溫度20-34℃，出菇期4-10月。牛肝菌（目前不能人工栽培子實體，但可利用菌絲進行深層發(fā)酵培養(yǎng)）

ganoderma

lucidum

靈芝

靈芝多糖

靈芝的有效成分很豐富，已知有確切療效的是靈芝多糖、三萜類化合物、腺苷和天然有機鍺等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)經(jīng)過大量藥理實驗證明，靈芝的確具有安神、益肺、延緩衰老的作用，對提高人體免疫力、抗腫瘤的作用也相當(dāng)肯定，已制成各種藥品和保健品。靈芝的作用主要有：抗腫瘤，用于癌癥輔助治療作用；鎮(zhèn)靜藥，用于神經(jīng)衰弱、失眠、健忘；護肝，用于慢性肝炎；健胃，用于食欲不振；還用于高血壓、心律失常、冠心病、糖尿病等的治療。食用菌多糖（六）藻類

（1）病毒病毒的外形：圓形、卵圓形、立方體、鞭狀或蝌蚪狀，直徑為10～35nm組成：由一個或幾個分子的DNA或RNA組成病毒包括：動物病毒、植物病毒和微生物病毒寄生在真核微生物中—病毒寄生于原核微生物中—噬菌體在感染了病毒的細胞中，當(dāng)病毒處于增殖高峰時會產(chǎn)生干擾素(interferon)干擾素是一種多肽，其作用是直接或通過酶反應(yīng)來抑制病毒核酸的復(fù)制幾種可以誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的誘導(dǎo)劑：雙股多聚核苷酸的復(fù)合物（polyⅠ和polyⅡ）

某些噬菌體和真菌病毒的雙股RNA注意：酵母、霉菌、淡水藍綠藻和某些海洋藻類中都有病毒的存在，必須引起發(fā)酵工業(yè)的關(guān)注。（2）藻類

是一種能直接利用光能的自養(yǎng)微生物。如藍藻(cyanophyta)，也稱藍綠藻(bluegreenalgae)、綠藻(chlorophyta)。作用：固氮、產(chǎn)氫、生產(chǎn)菌體蛋白（可利用廢水培養(yǎng)生產(chǎn)菌體蛋白，同時凈化廢水。）用于保健食品和飼料、將二氧化碳轉(zhuǎn)化為石油等。藍藻和綠藻的蛋白質(zhì)含量高達50%～55%鼠尾藻太平洋西部特有的暖溫帶性海藻。生于海礁、浪崗、嵊山、中街山、普陀山、象山港、韭山、大陳、洞頭、南虎、大漁等地。廣分布于我國沿海?？勺髦颇z工業(yè)原料。帶形蜈蚣藻生長在低潮帶附近巖石和貽貝養(yǎng)殖架上。產(chǎn)于深山、中街山、南麂等地。可供食用、藥用和制膠工業(yè)原料。小石花菜生長在中潮帶的巖石或貝殼上。生長盛期5～6月。廣布于海礁、浪崗、中街山、普陀山、漁山、象山港、洞頭、南麂和大漁等地?？晒┦秤没蛑骗偰z原料。亞太地區(qū)藻類生物技術(shù)在世界舉足輕重

微藻和大型海藻養(yǎng)殖與栽培、藥物與飼料開發(fā)，屬亞太地區(qū)藻類生物技術(shù)的強項，以色列所進行的螺旋藻養(yǎng)殖和光生物反應(yīng)器的設(shè)計與應(yīng)用，中國海帶及大型海藻栽培及藥物開發(fā)，都具有世界先進水平。中國大型海藻生物技術(shù)在曾呈奎院士等老一輩科學(xué)家?guī)ьI(lǐng)下，取得了輝煌的成績。目前中國是世界產(chǎn)量最大、藥物開發(fā)水平較高的海藻生產(chǎn)國，僅海帶年產(chǎn)量約占世界海藻總產(chǎn)量的一半。由于海帶栽培業(yè)的成功，支撐了海帶化工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，生產(chǎn)了碘、甘露醇和褐藻膠等化工產(chǎn)品，目前正在研制開發(fā)高附加值精細化工產(chǎn)品。中國海洋大學(xué)研制了PSS（藻酸雙酯鈉）、中國科學(xué)院海洋研究所研制了FPS，分別是治療心腦血管疾病和腎衰的有效藥物，創(chuàng)造和正在創(chuàng)造較好的社會與經(jīng)濟效益。提問?發(fā)酵生產(chǎn)中需要菌種，怎樣獲得菌種？如何從自然界選育出某種工業(yè)生產(chǎn)中所需要的菌種?三、工業(yè)微生物的來源（p49）根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種；從發(fā)酵制品中分離微生物菌種。第三節(jié)微生物菌種的分離篩選

（p49-54）一、菌株分離二、微生物新種分離與篩選的步驟三、工業(yè)微生物菌種分離和篩選方法四、發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定一、菌株分離菌株的分離純化：從混雜各類微生物的樣品中，通過分離技術(shù)進行分離，并按照生產(chǎn)的要求、菌株的特性，采用快速、準確、有效的各種篩選方法，把所需要的菌株分離挑選出來，得到所需純種微生物的過程。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。二、微生物新種分離與篩選的步驟確定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。富集（增殖）：人為地通過控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用微生物菌種分離技術(shù)，分離得到純菌種。篩選：對分離得到的純菌種進行生產(chǎn)性能測定，選擇出適合生產(chǎn)用的菌種。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。毒性試驗：用于食品加工業(yè)的微生物需要對其進行毒理學(xué)實驗。開發(fā)設(shè)計采集樣品富集培養(yǎng)純種分離原種斜面篩選（初篩、復(fù)篩）通過篩選的菌種斜面性能鑒定育種出發(fā)菌菌種保藏市場調(diào)研文獻調(diào)研常用微生物菌種的分離和篩選方法菌種保藏機構(gòu)提供的純種斜面（一）確定方案首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。（二）采樣

1.采樣對象以采集土壤為主。

一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主；富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物、腐敗物品、某些水域、廢水等等。2.采樣季節(jié)以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3.采土方式在選好適當(dāng)?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取離地面5～15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，應(yīng)及時分離。如在外地宜將樣品逐步分批寄回，以及時分離。（三）富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)（也稱增殖培養(yǎng)、施加選擇性壓力分離法）：就是利用不同種類的微生物在生長繁殖時對環(huán)境和營養(yǎng)條件的要求不同（溫度、濕度、pH、滲透壓、氧、碳源、氮源等），人為控制這些條件，使之有利于某一類或一種微生物生長而不利于其他微生物的生長，使所需微生物在增殖后在數(shù)量上占優(yōu)勢而便于分離，其他微生物幾乎不增殖或增殖緩慢，從而達到快速分離純化的方法。增殖培養(yǎng)即選擇培養(yǎng)基和控制培養(yǎng)條件：為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。例如碳源利用的控制，可選定糖、淀粉、纖維素或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。此外，酸堿度、溫度、高壓等條件都可以。（四）分離盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此，還必須分離、純化。在這一步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進一步應(yīng)用，而且控制得細一點，好一點。如：在分離放線菌中可以在培養(yǎng)基中加入抗真菌抗生素，這樣可以抑制其他雜菌的生長。純種分離的方法：劃線分離法、稀釋分離法。1.稀釋平皿分離法2.平皿劃線分離法快速分離方法：目的微生物不純，需分離純化。采用簡便迅速，有一定準確性的檢出方法，以提高篩選效率。常用平皿反應(yīng)法：紙片培養(yǎng)顯色法：浸有指示劑濾紙。透明圈法：混濁底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸鈣等。

變色圈法：直接用顯色劑或指示劑。

生長圈法：利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，要分離的微生物能在一般培養(yǎng)條件下生長而合成該營養(yǎng)物而使工具菌能生長，形成生長圈。

抑菌圈法變色圈：在菌體篩選中直接用顯色劑或指示劑摻入培養(yǎng)基中或噴灑已生長的菌落的培養(yǎng)基表面，由于培養(yǎng)基中所篩選出的微生物產(chǎn)生酸或堿性物質(zhì)從而使培養(yǎng)基的pH值降低或升高，由于顯色劑在不同pH值條件下顯色不同，從而形成圍繞菌落周圍的變了顏色的圈叫變色圈。應(yīng)用：產(chǎn)酸菌、果膠酶產(chǎn)生菌、脂肪酶產(chǎn)生菌等的分離。

變色圈如黑曲霉產(chǎn)酸，可使菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)黃色變色圈。就是由于培養(yǎng)基所加入的溴甲酚綠在堿性條件下為藍色，在酸性條件下為黃色的原因。分離果膠酶產(chǎn)生菌：如篩選果膠酶產(chǎn)生菌時，用含0.2%果膠為惟一碳源的培養(yǎng)基平板，對含微生物樣品進行分離，待菌落長成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)絳紅色水解圈。原因？分離谷氨酸產(chǎn)生菌:在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時，可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍，它是一種酸堿指示劑，變色范圍在pH6.2～7.6，當(dāng)pH在6.2以下時為黃色，pH7.6以上為藍色。若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌，其菌落周圍會變成黃色，可以從這些產(chǎn)酸菌中篩選谷氨酸產(chǎn)生菌。分離脂肪酶產(chǎn)生菌：在進行解脂微生物的分離時，雖然有很多精確的測定方法，如酸堿滴定法、電位滴定法、濁度滴定法、甘油滴定法及色譜分析法等，但由于步驟繁瑣，不適于大規(guī)模篩選測定。為提高分離篩選效率，多采用固體平板的變色圈法，如以吐溫為底物，尼羅藍（Nileblue）作為指示劑，根據(jù)變色圈大小來判斷脂肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯為底物，羅丹明B為指示劑，以熒光圈的大小來測定。

分離脂肪酶產(chǎn)生菌：最常使用的方法是把惡秦染料中的維多利亞藍和脂類底物混合，制成維多利亞藍乳脂瓊脂培養(yǎng)基平板，起始培養(yǎng)基調(diào)為中性。當(dāng)土壤樣品的懸濁液分離在平板上，具有脂解能力的菌落產(chǎn)生的脂肪酶水解油脂底物，使pH值由中性下降到微酸性或酸性，陽性解脂反應(yīng)能顯示粉紅到藍色的變化。如培養(yǎng)基起始pH為堿性，則陽性解脂反應(yīng)從咖啡色到藍綠色，能使脂類底物和解脂后的脂肪酸區(qū)別開來。后來又由Fryer等研究出一種改良的雙層法，先在平皿內(nèi)倒一層營養(yǎng)瓊脂，把一張棉紙圓片在被維多利亞藍染了色的乳脂中浸濕，鋪在已凝固的瓊脂表面，然后覆蓋一薄層含樣品的營養(yǎng)瓊脂，保溫培養(yǎng)，解脂菌落就可以在棉紙中產(chǎn)生藍帶。分解解脂細菌的培養(yǎng)基（％）：牛肉膏0.5、蛋白胨0.5、瓊脂2.0、大豆油5.0、維多利亞藍4mg。

分離內(nèi)肽酶產(chǎn)生菌:分離內(nèi)肽酶產(chǎn)生菌，除了用酪蛋白作底物平板產(chǎn)生透明圈進行鑒別外，還可以用吲羥乙酸酯為底物加到分離培養(yǎng)基中，產(chǎn)生蛋白酶的菌落由于水解吲羥乙酸酯為3-羥基吲哚，后者能氧化生成藍色產(chǎn)物，根據(jù)呈色圈便可選出平板上產(chǎn)蛋白酶的菌落。培養(yǎng)基平板由兩層組成，底層含明膠1.2％，酵母汁0.1％，蛋白胨0.4％，瓊脂1.5％，待凝固后在其上覆蓋一層瓊脂，瓊脂含量為0.7％，由pH7.6的0.5mol/L的磷酸氫鉀緩沖液配制，配制濃度為0.083mol/L的吲羥乙酸酯溶液，取其中的0.3ml加入到上層瓊脂中倒平板。

分離乙醇產(chǎn)生菌株：通過平板上的變色圈還可以快速分離篩選產(chǎn)乙醇的菌株。在以糖為碳源的瓊脂平板的菌落上，覆蓋一層含有鹽類的瓊脂，該藍色物質(zhì)在醇脫氫酶和NAD作用下（在少量乙醇存在時）反應(yīng)產(chǎn)生的電子脫色。因此生成乙醇的菌落便顯出一個淡白色的圈，暈圈的大小可初步表示乙醇的產(chǎn)量。

透明圈：在固體培養(yǎng)基中加入酶作用的底物或其他物質(zhì)（都能使培養(yǎng)基產(chǎn)生渾濁）培養(yǎng)微生物，能夠利用此底物的酶的產(chǎn)生菌得以生長或微生物能利用此種物質(zhì)，則在其菌落周圍形成一個透明的圈，叫透明圈，也叫水解圈。

應(yīng)用：水解酶產(chǎn)生菌、產(chǎn)酸菌等的分離。淀粉酶產(chǎn)生菌的分離：如可溶性淀粉在培養(yǎng)基中不產(chǎn)生混濁，但在低溫環(huán)境中溶解度急劇下降而混濁。當(dāng)以分離淀粉酶產(chǎn)生菌為目的時，稀釋涂布單菌落生長后，將平板在低溫下放置一段時間即可看見平板中淀粉的渾濁。如果某些菌落周圍產(chǎn)生透明圈則表示它分泌淀粉酶。產(chǎn)酸菌的分離：如果碳酸鈣在培養(yǎng)基中，可由透明圈的產(chǎn)生和大小確定微生物的產(chǎn)酸能力。蛋白酶產(chǎn)生菌的分離：分離產(chǎn)生堿性蛋白酶的芽孢桿菌，可用不同pH土壤經(jīng)巴氏消毒，然后平鋪在pH9～10瓊脂培養(yǎng)基（含有均勻不溶性蛋白——酪蛋白）的表面，如是生產(chǎn)堿性蛋白酶的芽孢桿菌則在其周圍產(chǎn)生一清晰圈。碳酸鈣培養(yǎng)基上出現(xiàn)的透明圈（產(chǎn)酸微生物）用剛果紅染色法鑒定篩選降解纖維素的菌株：

（透明圈）羧甲基纖維素鈉作培養(yǎng)物剛果紅是纖維素的染色劑，當(dāng)纖維素酶產(chǎn)生后分解利用了纖維素，剛果紅失去染色作用，因此變?yōu)橥该?。用剛果紅染色法鑒定篩選降解纖維素的菌株：

（透明圈）水解酶產(chǎn)生菌的分離：該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會在含有底物的選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見的透明圈。如在分離淀粉酶產(chǎn)生菌時，培養(yǎng)基以淀粉為惟一碳源，待樣品涂布到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)形成單個菌落后，再用碘液浸涂，根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明的水解圈來區(qū)別產(chǎn)酶菌株。

淀粉酶產(chǎn)生菌的分離（透明圈法）如要分離核酸水解酶產(chǎn)生菌，可用雙層平板法，首先在普通平板培養(yǎng)基上把懸浮液涂抹培養(yǎng)，等長出菌落后覆蓋一層營養(yǎng)瓊脂，內(nèi)含3%酵母RNA，0.7%瓊脂及0.1mol/LEDTA，pH7.0，于42℃左右培養(yǎng)2～4h,四周產(chǎn)生透明圈的菌落，即為核酸分解酶產(chǎn)生菌。

有機酸產(chǎn)生菌的分離:在分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株時，也通常采用透明圈法進行初篩。在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板成混狀，將樣品懸浮液涂抹到平板上進行培養(yǎng)，由于產(chǎn)生菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以輕易地鑒別出來。分離乳酸產(chǎn)生菌時，由于乳酸是一種較強的有機酸，因此，在培養(yǎng)基中加入的碳酸鈣不僅有鑒別作用，還有酸中和作用。生長圈生長圈：利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物為工具菌（如營養(yǎng)缺陷型菌株）若分離的微生物能在一般的培養(yǎng)條件下（缺乏上述營養(yǎng)要求的物質(zhì)）生長而合成該物質(zhì)，則能使工具菌生長，則在分離的微生物的菌落周圍形成工具菌的生長圈，這種圈叫生長圈。此法用于氨基酸、核苷酸、維生素等產(chǎn)生菌株的選育。工具菌是一些相對應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍周圍便會形成一個混濁的生長圈。如嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌（如E.coliP264）與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌。同樣，只要是篩選微生物所需營養(yǎng)物的產(chǎn)生菌時，都可采用生長圈法，工具菌用相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株，由于得到所需營養(yǎng)，凡是目的微生物周圍便會出現(xiàn)混濁的生長圈。

抑菌圈抑菌圈：有害菌與能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的微生物菌種一起在固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)時，則在產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的微生物菌落周圍產(chǎn)生一個透明的圈（即有害微生物不能生長的形成的圈）叫抑菌圈。應(yīng)用：抗生素類物質(zhì)產(chǎn)生菌的分離篩選。采用該方法已經(jīng)得到很多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。在青霉素菌種選育中，還可利用加入青霉素酶來篩選青霉素高產(chǎn)菌株。做法如下：將產(chǎn)黃青霉孢子進行誘變處理，致死率約為99％。分離于瓊脂平板上，控制孢子濃度，使長成獨立菌落，一直培養(yǎng)到青霉素產(chǎn)量達到頂峰，加入0.106U/mol青霉素酶于鑒定菌枯草芽孢桿菌懸浮液中，鋪張于菌落平板表面，凝固后，培養(yǎng)17～20h。測量抑菌圈大小，根據(jù)有效指標(biāo)（抑菌圈直徑于菌落直徑之比）選出高產(chǎn)突變株。

抗生素篩選（抑菌圈）加入檢定菌共同培養(yǎng)檢定菌涂布在培養(yǎng)基的表面與樣液一起培養(yǎng)，樣液中的微生物如產(chǎn)生抗生素則在其周圍產(chǎn)生抑菌圈。抑菌圈:采用抑菌圈法，不僅能篩選抗生素，而且還能篩選某些酶類。

（五）目的菌的篩選這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用的菌種。就是要對菌種進行生產(chǎn)性能的測定，以確保篩選出適合生產(chǎn)要求的菌種。一般分幾步進行篩選，即初篩、復(fù)篩、再次復(fù)篩，重復(fù)至獲得可靠的少數(shù)幾株后進行較全面的考察。采用的方法：三角瓶、涂布法、影印平板法、幾種圈法。提問：請舉出一種物質(zhì)產(chǎn)生菌生產(chǎn)性能測定的例子。（六）毒性試驗自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。三、工業(yè)微生物菌種分離和篩選方法（一）抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選（二）酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離篩選（三）生長因子產(chǎn)生菌的分離篩選（四）多糖產(chǎn)生菌的分離篩選（五）產(chǎn)酶菌種的分離篩選P52-54四、發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定獲得目的菌后必須要做菌種鑒定。包括：1、測定一系列必要的鑒定指標(biāo)（生理生化指標(biāo)以及采用分子生物學(xué)手段進行測定）。2、查找權(quán)威性的鑒定手冊，確定菌種的類型。第三節(jié)發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育

（P54-64）一、菌種選育、改良的目的二、工業(yè)菌種選育的基本內(nèi)容三、菌種選育的基本途徑一、菌種選育、改良的目的提高產(chǎn)量（濃度，轉(zhuǎn)化率，生產(chǎn)強度—發(fā)酵強度、生產(chǎn)率、生產(chǎn)能力）提高性能提高產(chǎn)物純度改變菌種的性狀以改善發(fā)酵過程（原料成本，生長速度，球狀菌絲體，需氧，耐不良培養(yǎng)條件，胞外產(chǎn)物，穩(wěn)定的遺傳性狀）改變生物合成途徑以獲得新產(chǎn)品二、工業(yè)菌種選育的基本內(nèi)容目前應(yīng)用于生化產(chǎn)品的生產(chǎn)菌都是經(jīng)過誘變的改良菌株。工業(yè)菌種的育種：是運用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對某個用于特定生物技術(shù)目的的菌株進行多方位的改造，通過改造可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化或去除不良性狀或增加新的性狀。工業(yè)菌種選育的基本內(nèi)容:用自然或人為的方法引起菌種變異或形成新的雜種，再按工業(yè)生產(chǎn)要求進行篩選來獲得新變種或雜種。三、菌種選育的基本途徑（一）經(jīng)典育種如自然選育和誘變育種（物理、化學(xué)方法）。帶有一定的盲目性。（二）定向育種雜交育種、原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因工程育種等?？梢杂心康牡剡x育出新的優(yōu)良菌種。

突變和選擇是微生物菌種選育的基本手段1.自然選育主要是利用微生物的自發(fā)突變，選育出優(yōu)良菌種的過程?；虻淖园l(fā)突變頻率約為10－8～10－5。自發(fā)突變可以被直接利用的例子：用噬菌體作為篩子，選育自然發(fā)生的抗噬菌體的菌株；用馴化的方法選育具有耐酸、耐熱、耐自身代謝物等性能的自發(fā)突變株。（一）經(jīng)典育種松茸傳統(tǒng)的、“經(jīng)典”的理化因子誘變及篩選仍然是最常用的菌種選育手段-物理誘變因子—-化學(xué)誘變因子—-生物誘變因子—紫外線（UV），X射線，γ射線，快中子，高能電子流，β射線等氮芥（NM），乙烯亞胺（EI），硫酸二乙酯（DES），甲基磺酸乙酯（EMS），亞硝基胍（NTG），亞硝基甲基脲（NMU），亞硝酸（HNO2），5－氟尿嘧啶，5－溴尿嘧啶（5BU），2－氨基嘌呤，吖啶橙，吖啶黃，溴乙錠（Etbr）等噬菌體，質(zhì)粒，DNA轉(zhuǎn)座子等-其他—抗生素等誘變突變頻率提高到10－6～10－3。2.誘變育種主要利用物理或化學(xué)誘變劑處理微生物細胞，使突變率大幅度提高，再通過篩選的方法得到符合育種目標(biāo)的菌種的方法。各種誘變因子新誘變因子：

低能離子束誘變激光輻射誘變和微波電磁輻射誘變原生質(zhì)體誘變第一輪第二輪誘變劑處理初篩（每株1瓶）復(fù)篩（每株4瓶）1個出發(fā)菌株選出200個單個菌株選出50株選出5株5個出發(fā)菌株選出50株選出5株誘變劑處理40株40株40株40株40株初篩（每株1瓶）復(fù)篩（每株4瓶）第三輪第三輪、第四輪操作同第二輪3.誘變育種的步驟直到獲得高產(chǎn)菌株誘變育種的基本方法（p55-59）1.出發(fā)菌株的選擇2.制備菌懸液3.誘變處理4.突變菌株的篩選快速篩選方法：1、平皿快速檢測方法2、形態(tài)變異法3、高通量篩選法

理性化篩選技術(shù)隨著遺傳學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，人們已逐漸了解重要工業(yè)微生物菌種的遺傳背景和代謝途徑。運用已掌握的遺傳學(xué)和生物化學(xué)方法，科學(xué)設(shè)計選擇性“篩子”，可以輕易地把大部分不符合要求的菌種經(jīng)過第一輪預(yù)篩選就淘汰掉，使具有有效性狀的突變株很方便的篩選出來，從而大大地提高篩選效率。

通過預(yù)先的精確設(shè)計，使突變型帶上某些遺傳標(biāo)記，從而在外觀表型上，將突變株與大量未突變株明確區(qū)分開來。-營養(yǎng)缺陷型突變株-組成型突變株-抗反饋抑制抗性突變株-抗反饋阻遏突變株-抗性突變株突變菌株的篩選p56-59營養(yǎng)缺陷型菌株:指菌株由于基因突變，致使細胞合成途徑出現(xiàn)某些缺陷，從表型上看，氨基酸、核酸、堿基或抗生素的合成途徑某一步被鈍化或喪失，該菌株在只含有最低限度營養(yǎng)物質(zhì)的基本培養(yǎng)基（MM）上不能生長，必須在基本培養(yǎng)基中加入某些有機營養(yǎng)物質(zhì)（稱之為完全培養(yǎng)基CM，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等）上才能正常生長的變異菌株。營養(yǎng)缺陷型菌株在微生物育種中的應(yīng)用:A遺傳、生化研究的對象。研究代謝途徑需用營養(yǎng)缺陷型菌株為材料。B可作為基因標(biāo)記而廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)的研究中。C可作為基因工程中的受體菌檢出克隆基因的表達。如在原生質(zhì)體融合育種中可以采用營養(yǎng)缺陷型菌株做為遺傳標(biāo)記，有助于融合子的篩選。營養(yǎng)缺陷型菌株在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用:在核糖、氨基酸、維生素、核苷酸等生產(chǎn)菌株的育種中（它們都是營養(yǎng)缺陷型），因為它可以降低或消除末端產(chǎn)物，故能解除終產(chǎn)物的反饋控制，使代謝途徑的中間產(chǎn)物或分支合成途徑中的終產(chǎn)物得以積累。因此，工業(yè)生產(chǎn)中就可以選擇這些菌株做為生產(chǎn)菌種。（二）定向育種1.雜交育種定義：p592.原生質(zhì)體融合育種定義：p59（三）基因工程育種（P61-64）基因工程就是利用人工的方法將某種生物的基因（DNA片段）提取出來，在離體條件下進行切割，再將它與作為載體的DNA分子連接起來，然后導(dǎo)入某一受體細胞中，使之進行復(fù)制、繁殖，并得以表達，從而使受體細胞獲得新的遺傳特性的育種技術(shù)。基因重組克服了傳統(tǒng)育種技術(shù)的隨機性和盲目性，能夠有目的的改良菌種。基因工程是工業(yè)菌種改良最具魅力、最有潛力的技術(shù)糖化酵母能發(fā)酵糊精卡爾酵母能發(fā)酵81％糖野生酵母能發(fā)酵異麥芽糖發(fā)酵糊精雜種第一代雜種發(fā)酵90％糖第二代雜種發(fā)酵100％糖第三代雜種發(fā)酵100％糖回交互交和選擇生產(chǎn)“淡”（無糖）啤酒的酵母基因重組（雜交）育種簡圖能產(chǎn)生異味的“pof”基因不帶“pof”基因供體細胞外源DNA目的基因受體細胞載體（質(zhì)粒或病毒）DNA片段重組DNA分子重組轉(zhuǎn)化子具目的基因表達功能的工程菌產(chǎn)物產(chǎn)品分離、提取核酸內(nèi)切酶切割連接，細胞外重組轉(zhuǎn)化（質(zhì)粒）、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染（噬菌體）擴增鑒定與表達工程菌培養(yǎng)分離純化微生物基因工程的主要操作流程第四節(jié)菌種保藏

（p64-70）一、菌種退化二、菌種的保藏三、菌種保藏機構(gòu)一、菌種退化（一）菌種退化現(xiàn)象菌種退化是指在較長時期傳代保藏后，菌株的一個或多個生理性狀和形態(tài)特征逐漸減退或消失的現(xiàn)象。即指群體中退化細胞數(shù)目在數(shù)量上占有一定比例后，所表現(xiàn)的菌種生產(chǎn)能力的下降現(xiàn)象。（二）菌種退化對生產(chǎn)的影響發(fā)酵力下降。繁殖力下降發(fā)酵產(chǎn)品的得率下降等。（三）菌種退化的原因基因突變?nèi)纾赫T變得到的新菌株發(fā)生回復(fù)突變，從而喪失新的特性的情況。連續(xù)轉(zhuǎn)代其他因素引起的基因突變菌種保藏不當(dāng)（四）防止菌種退化的措施合理育種選用合適的培養(yǎng)基創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件，避免有害物質(zhì)的影響盡量減少傳代次數(shù)利用孢子進行移種傳代采用有效的菌種保藏方法（五）退化菌種的復(fù)壯菌種復(fù)壯的方法：在一定培養(yǎng)條件下進行單細胞的分離純化，找出尚未退化的菌株。通過寄主體復(fù)壯。用高劑量的紫外線（UV）和低劑量的亞硝基胍（NTG）聯(lián)合對退化菌株進行處理。二、菌種的保藏（一）菌種的保藏就是根據(jù)微生物的生理生化特性，人為地創(chuàng)造條件，使微生物處于休眠狀態(tài)，以減少變異、防止菌種退化，使之達到不死、不衰、不亂和便于交換使用的目的。（二）菌種保藏的原理根據(jù)菌種的生理生化特點，人工創(chuàng)造條件，使孢子或菌體的生命代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平、缺氧狀態(tài)、干燥和低溫，使菌種處于“休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。（三）菌種保藏的條件1、挑選優(yōu)良的純種，最好采用它們的休眠體（如分生孢子、芽孢等）。2、要創(chuàng)造一個有利于微生物休眠的環(huán)境條件。如：干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)、添加保護劑、酸度中和劑等。（四）選擇菌種保藏方法的原則

1、此方法能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀。2、方法簡便和經(jīng)濟。（五）常用的保藏方法

斜面保藏法（低溫）穿刺保藏法（低溫）礦物油保藏法沙土管保藏法（干燥、無營養(yǎng)）真空冷凍干燥保藏法（干燥、缺氧、低溫、保護劑）液氮超低溫冷凍保藏法其他一些方法：懸浮保藏法、低溫保藏法、濾紙保藏法等。三、菌種保藏機構(gòu)（p69-70）菌種是國家的重要資源，世界各國對此項資源都給予極大的重視，現(xiàn)在許多國家都已建立了專門的菌種保藏機構(gòu)。如美國標(biāo)準菌種收藏所（ATCC）保藏有各類菌株一萬株以上，美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)部（ARS）菌種收藏所（收藏近二萬株，主要有農(nóng)產(chǎn)品加工用的菌種，以酵母菌最多，近一萬株）、英國國立標(biāo)準菌種收藏所（NCTC）、日本大阪發(fā)酵研究所（IFO），還有全球的世界微生物保存聯(lián)盟（WTCC）。這些機構(gòu)都出售和交換菌種，并出版菌種目錄。全世界的菌種保藏機構(gòu)在300個以上。我國于1979年成立中國微生物菌種保藏委員會（CCCCM），制定了組織和管理條件，設(shè)立了六個保藏中心。實驗一：題目：工業(yè)微生物菌種的分離與選育試驗要求：以組為單位自己查找資料進行試驗方案的設(shè)計，并以此方案進行試驗。其菌種為產(chǎn)纖維素酶菌株，要求從不同來源的纖維素中分離纖維素酶產(chǎn)生菌。（如森林中的腐殖葉、青草、甘蔗葉、甘蔗渣、玉米秸稈、稻草、木薯、葛根等）結(jié)果要求：1、試驗方案一份2、試驗結(jié)果（分離篩選的結(jié)果讓指導(dǎo)老師過目）3、試驗總結(jié)一份，并每組派代表一名進行試驗結(jié)果交流。第五節(jié)

菌種的擴大培養(yǎng)（p70-75）一、種子擴大培養(yǎng)

二、種子質(zhì)量的控制三、菌種培養(yǎng)的類型目的要求：了解發(fā)酵工業(yè)對生產(chǎn)用菌種的要求及種子擴大培養(yǎng)的目的。掌握生產(chǎn)菌種擴大培養(yǎng)的方法，以及種子質(zhì)量控制的措施。提問？1、什么是種子制備？2、為什么要進行種子擴大培養(yǎng)？一、種子擴大培養(yǎng)（一）種子擴大培養(yǎng)（二）種子的制備過程（三）接種菌齡與接種量1.種子擴大培養(yǎng)種子的擴大培養(yǎng)就是把保藏的菌種，即砂土管，冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化，再經(jīng)過扁瓶或三角瓶和種子罐，逐級擴大培養(yǎng)后達到一定的數(shù)量和質(zhì)量的純種培養(yǎng)過程。這些純種的培養(yǎng)物稱為種子。

（一）種子擴大培養(yǎng)2.種子擴大培養(yǎng)的原因

現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的規(guī)模越來越大，每只發(fā)酵罐的容積有幾十立方米甚至幾百立方米，要在較短的幾十小時內(nèi)完成如此巨大的發(fā)酵轉(zhuǎn)化任務(wù)，就必需具備數(shù)目巨大的微生物細胞。并