原核表達課件

原核表達課件2024-01-28contents目錄原核表達概述基因克隆與載體構(gòu)建原核細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達與純化蛋白質(zhì)鑒定與功能分析實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析CHAPTER原核表達概述01利用原核生物（如細菌）作為宿主細胞，通過基因工程技術(shù)將外源基因?qū)朐思毎⑹蛊湓诩毎麅?nèi)表達產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的過程。原核表達定義原核表達基于基因重組技術(shù)，將目的基因與表達載體連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化至原核細胞中。在原核細胞內(nèi)，重組質(zhì)粒上的目的基因得以表達，產(chǎn)生目標(biāo)蛋白。原理定義與原理表達載體宿主細胞轉(zhuǎn)化方法培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件原核表達系統(tǒng)組成01020304用于攜帶和表達目的基因的DNA分子，通常包括復(fù)制起點、選擇標(biāo)記和表達元件等。用于接受和表達重組質(zhì)粒的原核細胞，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細胞的方法，如化學(xué)轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化等。用于培養(yǎng)宿主細胞和誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。原核細胞生長迅速，可短時間內(nèi)獲得大量目標(biāo)蛋白。快速、高效原核細胞培養(yǎng)條件簡單，無需昂貴設(shè)備和試劑。成本低廉原核表達優(yōu)勢與局限性適用于多種蛋白：原核表達系統(tǒng)可用于表達多種類型的蛋白，包括酶、抗體、激素等。原核表達優(yōu)勢與局限性原核細胞表達外源蛋白時，表達水平可能受到多種因素影響，如宿主細胞狀態(tài)、培養(yǎng)條件等。表達水平不穩(wěn)定缺乏翻譯后修飾內(nèi)毒素問題原核細胞無法對表達的蛋白進行復(fù)雜的翻譯后修飾，如糖基化、磷酸化等。部分原核細胞表達的蛋白可能具有內(nèi)毒素活性，影響蛋白的純化和應(yīng)用。030201原核表達優(yōu)勢與局限性CHAPTER基因克隆與載體構(gòu)建02利用特異性引物對目的基因進行PCR擴增，得到目的基因片段。PCR擴增法利用限制性內(nèi)切酶切割DNA分子，得到具有黏性末端的DNA片段，再通過連接酶連接成完整的DNA分子。限制性內(nèi)切酶法將目的基因與載體DNA在體外進行重組，形成重組DNA分子，然后轉(zhuǎn)化到受體細胞中進行擴增。重組法基因克隆方法

載體類型及選擇質(zhì)粒載體具有自主復(fù)制能力的小型環(huán)狀DNA分子，常用于原核生物的基因克隆與表達。噬菌體載體以噬菌體為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體，可整合到宿主菌染色體上，用于高通量基因克隆與表達。病毒載體以病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體，可感染宿主細胞并將目的基因?qū)爰毎羞M行表達。重組質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒鑒定轉(zhuǎn)化與篩選表達檢測重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定將目的基因與載體DNA進行體外重組，形成重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到受體細胞中，通過選擇性培養(yǎng)基篩選陽性克隆。通過PCR、酶切、測序等方法對重組質(zhì)粒進行鑒定，確保目的基因已正確插入到載體中。對陽性克隆進行誘導(dǎo)表達，檢測目的蛋白的表達情況。CHAPTER原核細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化03原核細胞培養(yǎng)條件及操作根據(jù)原核細胞生長需求，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，如LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基等。原核細胞培養(yǎng)溫度一般為30-37℃，需根據(jù)具體菌種調(diào)整。搖床轉(zhuǎn)速影響細胞生長和氧氣供應(yīng)，一般設(shè)置為180-250rpm。根據(jù)細胞生長速度和實驗需求，確定培養(yǎng)時間，一般為12-48小時。培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)溫度搖床轉(zhuǎn)速培養(yǎng)時間利用化學(xué)物質(zhì)如CaCl2、MgCl2等處理細胞，使其處于感受態(tài)，再與DNA接觸實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。化學(xué)轉(zhuǎn)化法通過高壓電脈沖在細胞膜上形成瞬時通道，使DNA進入細胞。電轉(zhuǎn)化法利用基因槍將DNA包裹在金屬微粒上，高速轟擊細胞實現(xiàn)轉(zhuǎn)化?；驑尫ㄞD(zhuǎn)化方法介紹細胞處于對數(shù)生長期時，轉(zhuǎn)化效率較高。細胞狀態(tài)DNA質(zhì)量轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化條件純度高、無污染的DNA有助于提高轉(zhuǎn)化效率。不同轉(zhuǎn)化方法適用于不同類型的原核細胞，需根據(jù)具體情況選擇。如化學(xué)轉(zhuǎn)化中的處理時間、溫度等，電轉(zhuǎn)化中的電壓、電容等參數(shù)，均會影響轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化效率影響因素分析CHAPTER蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達與純化04物理誘導(dǎo)劑溫度、pH等，通過改變細胞內(nèi)外環(huán)境，影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或酶活性，進而調(diào)控基因表達?；瘜W(xué)誘導(dǎo)劑IPTG等，通過與阻遏蛋白結(jié)合使其構(gòu)象改變，從而解除對操縱子的阻遏作用，啟動基因表達。生物誘導(dǎo)劑特定代謝物或信號分子，與細胞內(nèi)受體結(jié)合后，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活或抑制基因表達。誘導(dǎo)劑種類及作用機制03培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基中的碳源、氮源、無機鹽等成分對蛋白質(zhì)表達有影響，需調(diào)整培養(yǎng)基配方以提高表達效率。01誘導(dǎo)劑濃度不同濃度的誘導(dǎo)劑對蛋白質(zhì)表達的影響不同，需通過實驗確定最佳濃度。02誘導(dǎo)溫度和時間溫度和時間影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和產(chǎn)量，需根據(jù)實驗需求進行優(yōu)化。蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化第二季度第一季度第四季度第三季度層析法電泳法超濾法沉淀法蛋白質(zhì)純化方法比較與選擇利用不同物質(zhì)在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同而實現(xiàn)分離，包括凝膠層析、離子交換層析、親和層析等。適用于不同大小和電荷的蛋白質(zhì)的分離純化。利用蛋白質(zhì)在電場中的遷移率不同而實現(xiàn)分離，包括SDS、Native等。適用于不同大小和電荷的蛋白質(zhì)的分離純化，特別適用于鑒定蛋白質(zhì)的純度。利用超濾膜對不同大小分子的截留作用而實現(xiàn)分離，適用于去除低分子量雜質(zhì)和濃縮蛋白質(zhì)。利用某些試劑或條件使蛋白質(zhì)從溶液中析出，包括鹽析、有機溶劑沉淀、等電點沉淀等。適用于初步純化和濃縮蛋白質(zhì)。CHAPTER蛋白質(zhì)鑒定與功能分析05質(zhì)譜鑒定通過質(zhì)譜儀對蛋白質(zhì)進行分子量和序列測定，具有高靈敏度和高分辨率。免疫學(xué)方法利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，通過Westernblot、ELISA等方法檢測蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)將大量蛋白質(zhì)固定在芯片上，通過特異性相互作用進行高通量篩選和鑒定。蛋白質(zhì)鑒定方法利用已知蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)信息，通過同源比對、結(jié)構(gòu)模擬等方法預(yù)測蛋白質(zhì)功能。生物信息學(xué)預(yù)測通過基因敲除或突變技術(shù)，觀察細胞或生物體表型變化，推斷蛋白質(zhì)功能?；蚯贸屯蛔兎治隼媒湍鸽p雜交、免疫共沉淀等技術(shù)，研究蛋白質(zhì)之間的相互作用及其功能。蛋白質(zhì)相互作用研究蛋白質(zhì)功能預(yù)測和驗證通過比對已知功能的蛋白質(zhì)序列，對目標(biāo)蛋白質(zhì)進行注釋和功能預(yù)測。序列比對和注釋利用計算機模擬技術(shù)，預(yù)測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和功能域，為功能研究提供線索。結(jié)構(gòu)模擬和預(yù)測通過分析基因表達譜數(shù)據(jù)，了解蛋白質(zhì)在不同條件下的表達變化，推測其功能?；虮磉_譜分析利用生物信息學(xué)方法構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，揭示蛋白質(zhì)在細胞過程中的作用和調(diào)控機制。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析生物信息學(xué)在功能分析中應(yīng)用CHAPTER實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析06合理選擇實驗材料根據(jù)實驗需求，選擇適當(dāng)?shù)脑吮磉_載體、宿主菌和誘導(dǎo)條件等，以保證實驗結(jié)果的可靠性和準確性。注意實驗安全在實驗過程中，應(yīng)嚴格遵守實驗室安全規(guī)范，確保實驗人員和環(huán)境的安全。遵循對照原則設(shè)置合理的對照組，以消除非特異因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗的精確度和可信度。明確實驗?zāi)康脑谠O(shè)計實驗前，必須明確實驗?zāi)康暮皖A(yù)期結(jié)果，確保實驗方案具有針對性和可行性。實驗設(shè)計原則及注意事項數(shù)據(jù)整理將收集到的數(shù)據(jù)進行分類、歸納和整理，以便于后續(xù)的數(shù)據(jù)處理和分析工作。數(shù)據(jù)處理采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進行分析處理，如方差分析、回歸分析等，以揭示數(shù)據(jù)間的內(nèi)在聯(lián)系和規(guī)律。數(shù)據(jù)收集在實驗過程中，應(yīng)詳細記錄實驗數(shù)據(jù)，包括實驗條件、操作步驟、觀察結(jié)果等，以便后續(xù)整理和分析。數(shù)據(jù)收集、整理和處理方法結(jié)果討