螞蟥水提物調(diào)控Nrf2抗FeCl3誘導(dǎo)大鼠靜脈血栓

-18-螞蟥水提物調(diào)控Nrf2抗FeCl3誘導(dǎo)大鼠靜脈血栓【摘要】目的：螞蟥（WhitmaniapigraWhitman，W.pigra）是臨床治療血瘀證的傳統(tǒng)動物類中藥。實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)螞蟥水提物（aqueousextractofdriedW.pigra，AEW）顯著抑制靜脈血栓（venousthrombosis，VT）形成。本論文旨在從Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)探討AEW抑制VT形成的作用機(jī)制。方法：SD大鼠按體重隨機(jī)分為6組：正常組、假手術(shù)組、模型組、AEW低劑量組（52mgcrudeW.pigra/kg）、AEW高劑量組（104mgcrudeW.pigra/kg）和華法林組（0.2mg/kg）。每組10只，雌雄各半。AEW和華法林連續(xù)灌胃給藥5天，末次給藥1小時(shí)后建立FeCl3損傷血管誘導(dǎo)的SD大鼠下腔靜脈血栓模型，并進(jìn)行頸總動脈采血及取材。稱量血栓濕重（包含靜脈壁和血栓）；HE染色觀察組織病理變化；免疫熒光觀察組織中活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS）的累積；硫代巴比妥酸法檢測組織中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；顯色反應(yīng)檢測血清總抗氧化能力（totalantioxidantcapacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力以及還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（glutathione/glutathionedisulfide，GSH/GSSG）比值；免疫熒光和Westernblot檢測組織Nrf2蛋白表達(dá)。結(jié)果：AEW顯著降低栓重，減少組織中ROS累積和MDA含量，增強(qiáng)血清T-AOC以及SOD和CAT活力，升高血清GSH/GSSG比值，上調(diào)組織Nrf2蛋白表達(dá)。結(jié)論：Nrf2介導(dǎo)抗氧化反應(yīng)減輕血管損傷是AEW抑制FeCl3誘導(dǎo)VT形成的分子機(jī)制?！娟P(guān)鍵詞】靜脈血栓；螞蟥；水提物；氧化應(yīng)激；Nrf2AqueousextractofWhitmaniapigraWhitmanpreventsFeCl3-inducedvenousthrombosisinratsviaactivationofNrf2-mediatedantioxidantresponse【Abstract】Objective:WhitmaniapigraWhitman(W.pigra)hasbeenwidelyusedasatraditionalChinesemedicineforthetreatmentofbloodstasissyndrome.OurpreviousstudyshowedthattheaqueousextractofdriedW.pigra(AEW)significantlyinhibitedvenousthrombosis(VT)inrats.Theaimofthepresentstudywastoexploretheunderlyingmechanismofthiseffect.Methods:SDratswererandomlydividedintosixgroups:normal,sham,model,lowandhighdosesofAEW(52and104mgcrudeW.pigra/kg)andwarfarin(0.2mg/kg)groups.AEWandwarfarinwereorallyadministeredoncedailyforfiveconsecutivedays.Onehourafterthefinaladministration,FeCl3-inducedinferiorvenacava(IVC)thrombosismodel,whichwascharacterizedbyvascularinjury,wasestablished.CarotidarterybloodandthrombosedIVCswerecollected.ThrombusweightwhichincludedthethrombusandassociatedIVCwallwasmeasured.ThehistopathologicalanalysisofIVCswasperformedthroughHEstaining.Reactiveoxygenspecies(ROS)accumulationintissueswasevaluatedbyimmunofluorescence.Malondialdehyde(MDA)contentintissues,andtotalantioxidantcapacity(T-AOC),activitiesofsuperoxidedismutase(SOD)andcatalase(CAT)andglutathione/glutathionedisulfide(GSH/GSSG)ratioinserumweredetectedbycommercialkits.ProteinexpressionofNrf2wasdeterminedbyimmunofluorescencestainingandWesternblot.Results:AEWsignificantlyreducedthrombusweight.AEWremarkablydecreasedROSaccumulationandMDAcontentintissues.AEWincreasedT-AOC,activitiesofSODandCAT,andGSH/GSSGratioinserum.AEWup-regulatedNrf2proteinexpression.Conclusion:AEWprotectedtheveinwallfromFeCl3-inducedoxidativestress,andthusalleviatedvascularinjuryandpreventedtheformationofthrombus.AEWmightbeapotentialtherapeuticagentforVT.【Keywords】Venousthrombosis;WhitmaniapigraWhitman;aqueousextract;oxidativestress;Nrf2前言靜脈血栓（venousthrombosis，VT）是血液在靜脈腔內(nèi)異常凝結(jié)，導(dǎo)致靜脈管腔阻塞及靜脈血液回流障礙。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，VT是繼冠心病和缺血性腦卒中之后，世界第三大血管疾病，每年歐洲地區(qū)每10萬人中有104-183人發(fā)病，亞洲地區(qū)發(fā)病率稍低。VT可發(fā)生于全身各部位靜脈，多發(fā)生在下肢深靜脈引起深靜脈血栓，若血塊脫落隨血液循環(huán)游走到肺部則引起致死性肺栓塞，為家庭及社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此，早期預(yù)防、診斷及治療是VT需要迫切解決的議題。目前，臨床常見的治療VT的藥物有抗凝血藥、抗血小板藥和溶栓藥，雖療效確切但出血風(fēng)險(xiǎn)高。因此，尋找一種更為安全有效、作用溫和的抗栓藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。水蛭，主逐惡血、瘀血，月閉，具有活血化瘀通經(jīng)之效，是臨床治療血瘀證的傳統(tǒng)動物類中藥。2015版《中國藥典》收載的藥用水蛭為水蛭科動物螞蟥（WhitmaniapigraWhitman，W.pigra）、水蛭（HirudonipponicaWhitman）或柳葉螞蟥（WhitmaniaacranulataWhitman）的干燥全體。其中，螞蟥是我國臨床上使用最多的水蛭品種。實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)螞蟥水提物（aqueousextractofdriedW.pigra，AEW）顯著抑制下腔靜脈血栓形成，但具體分子機(jī)制仍有待深入探索。因此，本論文將建立三氯化鐵（ferricchloride，F(xiàn)eCl3）損傷血管誘導(dǎo)大鼠下腔靜脈血栓模型，通過檢測血栓濕重、組織病理變化、組織中活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS）的累積和脂質(zhì)過氧化水平、血清抗氧化能力和組織中核因子E2相關(guān)因子（nuclearfactorE2-relatedfactor2，Nrf2）蛋白表達(dá)，從Nrf2介導(dǎo)抗氧化反應(yīng)減輕血管損傷探討AEW抑制FeCl3誘導(dǎo)VT形成的作用機(jī)制。概述1856年，德國病理學(xué)家RudolfVirchow最先提出血栓形成的經(jīng)典三要素：血管內(nèi)皮損傷、血流異常、血液高凝。近年研究表明，ROS和自由基可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷、老化、凋亡，啟動促凝血反應(yīng)引發(fā)血栓形成。Nrf2作為維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)者，其激活可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，抵御氧化應(yīng)激（oxidativestress，OS）損傷?？梢?，Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)對保護(hù)血管抑制VT形成具有重要作用。螞蟥提取物具有良好的清除ROS和自由基的能力，但其抗氧化機(jī)制未深入闡明。下面將從VT形成的病理機(jī)制、VT治療進(jìn)展、FeCl3誘導(dǎo)動物VT模型及螞蟥抗血栓研究等方面進(jìn)行綜述。1血管損傷與VT內(nèi)皮是位于血管內(nèi)表面的單層細(xì)胞，正常生理狀態(tài)下，具有抗凝、促纖溶和維持血液流動性特性。內(nèi)皮一旦受到損傷因素刺激，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)或功能受損，進(jìn)而啟動一系列促血栓反應(yīng)：內(nèi)皮細(xì)胞活化快速分泌釋放血管性血友病因子和組織因子促進(jìn)血小板聚集，進(jìn)而募集白細(xì)胞；增加黏附分子P/E選擇素的表達(dá)，吸引白細(xì)胞移動、粘附至血管受損部位，促進(jìn)炎癥反應(yīng)；減少某些抗血栓蛋白如內(nèi)皮蛋白C受體的表達(dá)，抑制機(jī)體抗凝血途徑；生成纖溶酶原激活物抑制劑-1和凝血因子V，增強(qiáng)受損血管局部血液凝固功能、抑制纖維蛋白溶解?？梢?，血管內(nèi)皮損傷在血栓形成中起重要作用。1.1OS介導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷OS是指體內(nèi)的ROS和自由基產(chǎn)生過多，氧化與抗氧化作用失衡，機(jī)體傾向于氧化，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，損傷組織。近年來研究表明，OS是血管內(nèi)皮損傷的重要機(jī)制之一。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體的ROS總是處于不斷產(chǎn)生和不斷被超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化物清除的動態(tài)平衡中。當(dāng)ROS產(chǎn)生過多并超過機(jī)體自身抗氧化能力時(shí)，機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)難以短時(shí)間內(nèi)清除全部ROS，形成OS狀態(tài)。此時(shí)，過多的ROS與一氧化氮（NitricOxide，NO）快速結(jié)合產(chǎn)生過氧亞硝酸鹽，降低內(nèi)皮細(xì)胞NO生物利用度并導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，引起血管內(nèi)皮損傷。1.2Nrf2抗氧化信號通路Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子，存在于機(jī)體的多種組織（如心、肝、脾、腎等）的細(xì)胞內(nèi)，在機(jī)體抵抗OS損傷，維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。機(jī)體處于正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞質(zhì)中的Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-likeECH-associatedprotein1，Keap1）與Nrf2結(jié)合形成異二聚體，抑制Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核而無法發(fā)揮Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)Nrf2與Keap1解離，游離的Nrf2即可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，這是Nrf2激活的經(jīng)典機(jī)制。機(jī)體處于OS狀態(tài)時(shí)，Nrf2激活，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidantresponsiveelement，ARE）結(jié)合形成Nrf2-ARE信號通路，啟動下游抗氧化因子的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化損傷作用[19]。目前已闡明Nrf2調(diào)控的下游抗氧化因子有：醌氧化還原酶1（NQO1）、血紅素氧合酶1（hemeoxygenase1，HO-1）、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS-transferase，GST）、SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GPx）和谷胱甘肽還原酶（glutathionereductase，GR）等。Ge等使用異丙酚后處理小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟中OS降低且Nrf2、HO-1表達(dá)增加，進(jìn)而減輕小鼠肝臟缺血/再灌注損傷，保護(hù)肝細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧刺激引起的OS損傷。Ishikado等證明柳樹皮提取物可通過激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和秀麗隱桿線蟲中的Nrf2信號通路來緩解OS損傷。2中西醫(yī)治療VT研究概況2.1西醫(yī)治療目前西醫(yī)治療措施主要是藥物治療和手術(shù)取栓治療。常用藥物有抗凝血藥、抗血小板藥和溶栓藥。抗凝藥有肝素和華法林等，主要通過加強(qiáng)凝血過程中特定凝血因子的滅活而實(shí)現(xiàn)抗凝作用，但臨床上容易引起患者血小板減少和出血等不良反應(yīng)?？寡“逅幱邪⑺酒チ趾吐冗粮窭椎?，通過封閉血小板膜上的受體或抑制血小板血栓素A2合成，抑制血小板活化，阻止血栓形成。其治療效果顯著，但多禁用于于肝、腎功能損害的患者。溶栓藥有阿替普酶和瑞替普酶等，將內(nèi)源性纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，降解血塊中的纖維蛋白，其溶栓效果肯定，安全性好，但昂貴的價(jià)格制約了其在臨床上的普及推廣。這三類藥物抗栓作用確切，但均存在不同程度的出血風(fēng)險(xiǎn)及其他不良反應(yīng)。2.2中醫(yī)治療中醫(yī)理論中，VT屬血瘀證“脈痹”的范疇，由氣滯血瘀、氣機(jī)不暢導(dǎo)致。目前中醫(yī)對VT治療主要從益氣、活血和化瘀著手，將微觀辨證與宏觀辨證相結(jié)合，配合中藥內(nèi)服外治。與西醫(yī)防治相比，中醫(yī)中藥防治作用溫和，不良反應(yīng)小，安全性高，突出了中醫(yī)中藥的獨(dú)特優(yōu)勢。3FeCl3誘導(dǎo)動物VT模型研究現(xiàn)狀近年來的VT研究常用下腔靜脈完全結(jié)扎法、下腔靜脈狹窄法、FeCl3腐蝕法和電解下腔靜脈法制備動物模型。其中使用FeCl3外敷靜脈管壁制備動物VT模型操作簡便、重復(fù)性好，接近于臨床自發(fā)性血栓的組織形態(tài)特征。據(jù)報(bào)道，3.5%FeCl3溶液能較好地誘導(dǎo)形成靜脈血栓，可作為誘導(dǎo)靜脈血栓的閾濃度。Joglekar等將飽和浸潤20%FeCl3溶液的濾紙置于下腔靜脈10min，撤去濾紙，血栓繼續(xù)穩(wěn)定形成45min制備出血小板/糖蛋白IP-IX/血管性血友病因子依賴性的閉塞性血栓。Wei等將棉片充分浸潤于40%FeCl3溶液，貼敷于新西蘭兔上矢狀竇5min，隨后注射凝血酶成功建立腦靜脈竇血栓模型?？梢姡現(xiàn)eCl3溶液的濃度和外敷時(shí)間是成功建立VT模型的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)，浸有10%FeCl3的濾紙外敷大鼠下腔靜脈5min后，撤去濾紙，血栓繼續(xù)穩(wěn)定形成30min，所建立的VT模型穩(wěn)定、死亡率低、成栓率高。目前，使用FeCl3外敷靜脈管壁制備動物VT模型的確切作用機(jī)制仍存在爭議，Schoenwaelder等發(fā)現(xiàn)在血管局部應(yīng)用FeCl3溶液后，F(xiàn)e3+離子被攝取并轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮，通過胞吐作用進(jìn)入血管腔不斷積累。血管腔內(nèi)較高濃度的Fe3+產(chǎn)生的氧化效應(yīng)會引起內(nèi)皮毒性及剝蝕作用，導(dǎo)致內(nèi)皮破損不斷積累。血管腔內(nèi)較高濃度的Fe3+產(chǎn)生的氧化效應(yīng)會引起內(nèi)皮毒性及剝蝕作用，形成血栓。Ciciliano等發(fā)現(xiàn)FeCl3對內(nèi)皮細(xì)胞活性影響呈濃度依賴性，且在血液中對血細(xì)胞和血漿蛋白的電荷依賴性聚集作用起重要作用。4螞蟥抗血栓研究現(xiàn)狀水蛭，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)目》：“水蛭，味咸，平。主逐惡血、瘀血，月閉，破血瘕積聚，無子，利水道，生池澤”，具有活血化瘀通經(jīng)之效，是治療血瘀證的傳統(tǒng)動物類中藥。水蛭品種繁多，全世界約有400-500種，我國已發(fā)現(xiàn)89種。2015版《中國藥典》收載的藥用水蛭為水蛭科動物螞蟥（WhitmaniapigraWhitman）、水蛭（HirudonipponicaWhitman）或柳葉螞蟥（WhitmaniaacranulataWhitman）的干燥全體。其中，螞蟥是我國臨床上使用最多的水蛭品種。螞蟥提取物的主要化學(xué)成分為蛋白質(zhì)和多肽類大分子，臨床應(yīng)用及動物實(shí)驗(yàn)表明其具有顯著的抗凝、抗血栓、抗血小板聚集和抗癌轉(zhuǎn)移等藥理作用。Liu等在螞蟥干燥體中分離出名為WP-30的新型抗血栓肽，在體外可選擇性抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，在體內(nèi)抑制動靜脈分流血栓形成。但目前對螞蟥的研究主要集中在提取炮制工藝和入藥成分上，鮮有探討螞蟥抑制血栓形成的具體分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)室前期在大鼠動-靜脈旁路血栓、狹窄法誘導(dǎo)的下腔靜脈血栓和FeCl3誘導(dǎo)頸動脈血栓模型中發(fā)現(xiàn)，AEW能抑制三種血栓形成，且抗VT形成的作用更為明顯。有研究者發(fā)現(xiàn)，螞蟥提取物具有良好的清除ROS和自由基的能力，但對于其抗氧化機(jī)制并未進(jìn)行深入的研究和解釋。因此，本論文將建立FeCl3損傷血管誘導(dǎo)大鼠下腔靜脈血栓模型，從Nrf2介導(dǎo)抗氧化反應(yīng)減輕血管損傷探究AEW抑制FeCl3誘導(dǎo)VT形成的作用機(jī)制。5小結(jié)VT形成與內(nèi)皮損傷息息相關(guān)。FeCl3腐蝕下腔靜脈，作為制備動物VT模型的方法，通過高價(jià)鐵離子在靜脈壁的不斷蓄積和強(qiáng)氧化作用，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷而誘導(dǎo)血栓形成。Nrf2信號通路可啟動下游抗氧化因子的表達(dá)，抵御氧化損傷。而OS緩解可保護(hù)血管內(nèi)皮，抑制VT形成。螞蟥提取物抗VT形成作用顯著，且具有良好的清除ROS和自由基的能力。因此，本論文將基于Nrf2介導(dǎo)抗氧化反應(yīng)減輕血管損傷探討AEW抑制FeCl3誘導(dǎo)VT形成的作用機(jī)制，這與目前常用抗栓藥物的作用機(jī)制明顯不同，具有重要的研究價(jià)值，有助于我們進(jìn)一步理解VT形成的機(jī)制，并為中藥螞蟥的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究部分1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動物及喂養(yǎng)環(huán)境由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供60只200-250gSPF級的SD大鼠，雄性雌性大鼠各30只。由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物房提供本批實(shí)驗(yàn)大鼠合格的喂養(yǎng)環(huán)境。室內(nèi)溫度和相對濕度分別控制22-25℃和50-60%，12h照明/12h黑暗交替。1.2藥物與試劑藥品/試劑批號/貨號廠家螞蟥干體江蘇省天下農(nóng)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司華法林鈉片18170102B上海信宜九福藥業(yè)有限公司生理鹽水140911A佛山雙鶴藥業(yè)有限公司速眠新注射液160623長沙拜特生物科技研究所有限公司戊巴比妥鈉170108德國默克FeCl3?6H2O20131102-1廣州化學(xué)試劑廠4%多聚甲醛P0099碧云天中性樹膠20170824國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司OCT冰凍切片包埋劑4583日本櫻花RIPA裂解液（強(qiáng)）CW2333S北京康為世紀(jì)PMSF（100mM）CW20221北京康為世紀(jì)甲醇20170912天津市富宇精細(xì)化工有限公司TrisFD2010弗德生物甘氨酸FD2040弗德生物SDSFD2040弗德生物1MTris-Hcl（pH=6.8）FD2070弗德生物1MTris-Hcl（pH=8.8）FD2080弗德生物Acrylamide/BisSolution29:1FD2060弗德生物TEMEDT0761Bio-Rad過硫酸銨FD2050弗德生物Tween-20FD0020弗德生物牛血清白蛋白（BSA）CCSS001401DMRCGlobalPrestainedProteinLadder26616美國賽默飛5×loadingbufferCW00275北京康為世紀(jì)ChemiluminescentHRPsubstrateP90720美國MilliporeBCA蛋白濃度測定試劑盒CW0014S北京康為世紀(jì)丙酮20150901廣州化學(xué)試劑廠Triton-X-100T0694Amresco正常山羊血清CW0130S北京康為世紀(jì)DAPI染色液AR1176博士德生物技術(shù)有公司抗熒光衰減封片劑S2100北京索萊寶活性氧（ROS）測試盒E004南京建成丙二醛（MDA）測試盒A003-1南京建成總抗氧化能力檢測試劑盒S0121碧云天超氧化物歧化酶（SOD）測試盒A001-3南京建成過氧化氫酶檢測試劑盒S0051碧云天谷胱甘肽測試盒A061-1南京建成兔單克隆Anti-Nrf2抗體ab137550英國Abcam兔單克隆Anti-GAPDH抗體2118S美國CSTGoatanti-RabbitIgG(HRP)二抗7074S美國CSTGoatanti-Rabbit熒光二抗A23220美國Abbkine1.3實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器型號廠家電子天平JJ3000常熟市雙杰測試儀器廠分析天平EL204上海梅特勒-托利多儀器有限公司渦旋儀XW-80A海門市其林貝爾儀器制造有限公司組織脫水機(jī)STP120美國ThermoScientific組織包埋機(jī)A81010100美國ThermoScientific石蠟切片機(jī)HM340E美國ThermoScientific冷凍切片機(jī)CryoStarNX50HOVPD美國ThermoScientific全自動組織染色機(jī)A81500101美國ThermoScientific熒光顯微鏡BDS300重慶奧特光學(xué)儀器有限公司激光共聚焦顯微鏡ZeissLSM800withAiryscan上?？柌趟救詣訕悠房焖傺心xJXFSTPRP-32上海凈信公司臺式冷凍離心機(jī)D3024R美國賽洛捷克公司數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6金壇市醫(yī)療儀器廠酶標(biāo)儀MultiskanGO美國ThermoScientific轉(zhuǎn)移電泳儀電源DYY-7C北京六一生物科技有限公司雙垂直電泳槽DYCZ-25D北京六一生物科技有限公司水平搖床WD-9045B北京六一生物科技有限公司化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Tanon-5200上海天能科技有限公司1.4實(shí)驗(yàn)耗材注射器、棉線、固定板、剃毛刀、碘伏、棉簽、手術(shù)刀、手術(shù)剪、玻璃分針、Whatman濾紙、保鮮膜、手術(shù)鑷、離心管、吸頭、多種規(guī)格離心管、載玻片、粘附載玻片、蓋玻片、吸水紙、免疫組化筆、PVDF膜等。2實(shí)驗(yàn)方法2.1AEW制備參照論文《水蛭提取物遲釋給藥系統(tǒng)研究》進(jìn)行AEW的制備：50g螞蟥干燥全體打粉，粗粉經(jīng)水提后冷凍干燥得到14.16g的凍干粉（3.5g螞蟥干粉/g凍干粉）。其提取流程如Figure1所示：Figure1PreparationofAEW.2.2動物分組及給藥2.2.1動物分組遵循對照和隨機(jī)原則，本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)將60只大鼠按體重分成6組：正常組、假手術(shù)組、模型組、AEW低劑量組（lowdoseofAEWgroup，AEW-L）、AEW高劑量組（highdoseofAEWgroup，AEW-H）和華法林組，每組雄性、雌性大鼠各5只。2.2.2給藥劑量設(shè)計(jì)2015版《中國藥典》中螞蟥的人用劑量為1-3g/d。本研究選取人用劑量為1g/d。根據(jù)生藥量相等折算，則AEW凍干粉的人用劑量為0.28g/d。根據(jù)等效劑量換算，AEW凍干粉的大鼠給藥劑量為29.2mg/kg/d。人臨床給予華法林的給藥劑量為2.5-5mg/d，根據(jù)等效劑量換算得到大鼠的給藥劑量范圍為0.26-0.52mg/kg/d。為確保華法林的抗凝血作用及避免出血，結(jié)合文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)試，重新確定連續(xù)給藥5天的華法林劑量為：0.2mg/kg/d。華法林鈉片的平均片重為75.0mg，每片含華法林2.5mg，故大鼠給予華法林鈉片的給藥劑量為6.0mg/kg/d，灌胃體積為10mL/kg/d。試驗(yàn)組別給藥途徑給藥類別給藥劑量（mg/kg/d）給藥體積（mL/kg/d）正常組灌胃蒸餾水10假手術(shù)組模型組AEW-L組AEW凍干粉溶液14.6AEW-H組29.2華法林組華法林鈉溶液6.02.3溶液配制AEW-H溶液（2.92mg/mL）：精密稱取146mg的凍干粉，溶于50mL蒸餾水即得。AEW-L溶液（1.46mg/mL）：精密量取16mLAEW-H溶液，溶于16mL蒸餾水即得。華法林鈉溶液（0.6mg/mL）：精密稱取18mg華法林鈉片粉末，溶于30mL蒸餾水即得。10%FeCl3溶液：精密稱取0.5gFeCl3?6H2O（含F(xiàn)eCl30.3g），加入3mL蒸餾水充分溶解即得。10%SDS溶液：精密稱取0.2gSDS粉末，加入2mL蒸餾水充分溶解即得。10%過硫酸胺（APS）溶液：稱取0.2gAPS粉末，溶于2mL蒸餾水即得。5X電泳緩沖液：分別將已準(zhǔn)確稱量好的15gTris粉末、72g甘氨酸粉末和5gSDS粉末依次裝入1000mL容量瓶內(nèi)，緩慢倒入蒸餾水加至刻度線，振搖使溶解充分即得。1X電泳緩沖液：精密量取200mL5X電泳緩沖液于1000mL容量瓶內(nèi)緩慢倒入蒸餾水加至刻度線，振搖使溶解充分即得。10X轉(zhuǎn)膜液：分別將已準(zhǔn)確稱量好的30gTris粉末、154g甘氨酸粉末和1gSDS粉末依次裝入1000mL容量瓶內(nèi)，緩慢倒入蒸餾水加至刻度線，振搖使溶解充分即得。1X轉(zhuǎn)膜液：精密量取100mL10X轉(zhuǎn)膜液和200mL甲醇于1000mL容量瓶內(nèi)緩慢倒入蒸餾水加至刻度線，振搖使溶解充分即得。10XTBS緩沖液：分別將已準(zhǔn)確稱量好的24gTris粉末和80gNaCl粉末依次裝入1000mL容量瓶內(nèi)，緩慢倒入蒸餾水加至刻度線，振搖使溶解充分即得。1XTBST溶液：精密稱取100mL10XTBS緩沖液于1000mL容量瓶內(nèi)緩慢倒入蒸餾水加至刻度線，臨用前再加入1mL吐溫-20，振搖使溶解充分即得。5%BSA封閉液：精密稱取2.5gBSA粉末，加入50mL1XTBST充分溶解即得。2.4FeCl3誘導(dǎo)大鼠下腔靜脈血栓模型制備各組每天灌胃一次，連續(xù)灌胃5天。于末次給藥后1h進(jìn)行手術(shù)造模。術(shù)前12h，禁食不禁水。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（0.6mL/kg），肌肉注射速眠新（0.2mL/kg）。麻醉起效后大鼠腹部剃毛，仰臥位固定，腹部涂抹碘酒進(jìn)行皮膚表面消毒。沿腹中線切開腹腔，朝手術(shù)者左側(cè)方向輕微撥開腹腔臟器，充分暴露下腔靜脈。玻璃分針仔細(xì)分開下腔靜脈與腹主動脈約1.2cm，穿過保鮮膜（2cm×1.8cm），再在保鮮膜與下腔靜脈間穿過浸滿10%FeCl3溶液的Whatman濾紙（1.0cm×1.0cm）。濾紙包裹下腔靜脈，再裹上保鮮膜以防FeCl3損傷周圍組織。5min后抽出保鮮膜和濾紙，再讓血栓穩(wěn)定形成30min。假手術(shù)組以浸有蒸餾水的Whatman濾紙作為對照。正常組大鼠不進(jìn)行任何處理。30min后，馬上頸總動脈采血到不含抗凝劑的采血管。采血管常溫靜置30min后，1600×g、4℃離心10min，分離上清（即血清）并分裝，-80℃保存，用于檢測T-AOC、SOD和CAT活力以及GSH/GSSG比值。3指標(biāo)檢測3.1血栓濕重動物頸總采血后即可取栓。剪取濾紙包裹處的造模血管段，吸干殘留血液，稱量栓重（包含靜脈壁和血栓）。取1/3組織OCT包埋后液氮速凍，-80℃保存用于ROS檢測；1/3組織置于4%多聚甲醛溶液中固定48h以上用于組織病理學(xué)分析；剩余組織保存于-80℃，用于檢測脂質(zhì)過氧化水平和Nrf2蛋白表達(dá)。3.2組織病理學(xué)分析蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法普遍應(yīng)用于組織學(xué)、病理學(xué)等領(lǐng)域的臨床、科研及教學(xué)，是目前觀察分析各種組織生理、病理相關(guān)形態(tài)結(jié)構(gòu)最常用的技術(shù)手段。實(shí)驗(yàn)步驟如下：（1）組織脫水：取出固定液中的組織，逐一放置于包埋盒中，開始脫水：甲醛（1h、60轉(zhuǎn)）×2?70%酒精（1.5h、70轉(zhuǎn)）?80%酒精（1.5h、70轉(zhuǎn)）?96%酒精（1.5h、70轉(zhuǎn)）?100%酒精×3（1.0h、70轉(zhuǎn)）?二甲苯（1.5h、70轉(zhuǎn)）?二甲苯（1.5h、60轉(zhuǎn)）?石蠟（2h、60轉(zhuǎn)）×2。（2）石蠟包埋。（3）石蠟切片機(jī)切片（4μm），貼附于載玻片上。（4）染色：染色前0.5h-1h置于60℃烘箱中熔蠟，同時(shí)使組織更加貼附以防染色過程中脫片。開始染色：二甲苯3min×3?100%酒精1min×2?95%酒精1min?75%酒精1min?流水1min?蘇木精7min?流水1min?酒精分化3s?流水10min?95%酒精30s?伊紅（醇溶）30s?95%酒精30s?100%酒精2min×2?二甲苯3min×2。（5）染色完成后，用吸頭緩慢吸取并滴加數(shù)滴中性樹膠于玻片，待中性樹膠全部浸潤組織，蓋上蓋玻片等待中性樹膠完全凝固。（6）將完全干燥凝固后的組織切片置于顯微鏡下，觀察組織的各項(xiàng)病理形態(tài)結(jié)構(gòu)，拍照記錄。3.3血栓組織中ROS檢測取-80℃冰箱中OCT包埋的組織，冰凍切片機(jī)切片（6μm），貼附于粘附載玻片上。免疫組化筆緊貼組織四周畫圓，組織表面均勻滴加20μLDCFH-DA稀釋液，37℃烘箱避光孵育30min。PBS浸洗玻片3次（1min/次），吸水紙吸干PBS，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。3.4血栓組織中脂質(zhì)過氧化水平檢測丙二醛（malondialdehyde，MDA）是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞自由基與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)所得的產(chǎn)物之一，作為標(biāo)示組織細(xì)胞中脂質(zhì)是否過氧化的重要依據(jù)，可根據(jù)所測得的丙二醛含量判別機(jī)體組織氧化損傷的程度[41]。檢測步驟如下：將血栓組織放入EP管，置于離心機(jī)離心10min，設(shè)置參數(shù)為12000×g、4℃。離心后吸取上清液，硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。分別將乙酸和2-硫代巴比妥酸依次加入到含標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的EP管中，再將樣板和標(biāo)準(zhǔn)品置于100℃水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng)，等待1h，直至溶液出現(xiàn)紅棕色。MDA含量和紅棕色深度呈正相關(guān)。將樣品放入酶標(biāo)儀中，設(shè)置檢測光譜為532nm，測定其吸光度并通過吸光度計(jì)算組織中MDA含量。3.5血清中T-AOC檢測取-80℃冰箱中凍存的血清，顯色法檢測血清T-AOC。ABTS在氧化劑作用下可被氧化成綠色的ABTS?+，在抗氧化物存在時(shí)ABTS?+的產(chǎn)生會受到抑制，在414nm處測定ABTS?+的吸光度即可計(jì)算樣本的T-AOC。檢測步驟如下：用移液槍準(zhǔn)確吸取20μL過氧化物酶工作液，加入到總抗氧化能力檢測試劑盒的全部包被微孔中。用移液槍準(zhǔn)確吸取10μL蒸餾水于空白對照孔中，再依次準(zhǔn)確吸取10μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液于標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測孔，最后準(zhǔn)確吸取10μL血清于樣本檢測孔，混勻。用移液槍準(zhǔn)確吸取170μLABTS工作液于試劑盒全部微孔中，混勻。將試劑盒置于室溫孵育，6min后放入酶標(biāo)儀中，設(shè)置檢測光譜為414nm，測定其吸光度并通過吸光度計(jì)算血清中T-AOC含量。3.6血清中SOD活力檢測取-80℃冰箱中凍存的血清，WST-1法檢測血清SOD活力。相關(guān)檢測步驟以超氧化物歧化酶（SOD）測試盒說明書為準(zhǔn)。3.7血清中CAT活力檢測取-80℃冰箱中凍存的血清，顯色法檢測CAT活力。檢測步驟如下：（1）用移液槍分別準(zhǔn)確吸取10μL需要檢測的血清、30μL過氧化氫酶檢測緩沖液和10μL250mM過氧化氫溶液于1.5mL離心管中，每加入一種溶液立即充分混勻?？瞻讓φ瘴?0μL過氧化氫酶檢測緩沖液和10μL250mM過氧化氫溶液于另一離心管，立即充分混勻即可。將離心管置于25℃數(shù)顯恒溫水浴鍋待其反應(yīng)3min。準(zhǔn)確吸取450μL過氧化氫酶反應(yīng)終止液于兩支離心管中，混勻，制備終止完全的反應(yīng)體系。分別準(zhǔn)確吸取40μL過氧化氫酶檢測緩沖液和10μL終止完全的上述反應(yīng)體系于第三支離心管，混勻。準(zhǔn)確吸取第（3）步驟已混勻且終止完全的反應(yīng)體系10μL于96孔板中，加入200μL顯色工作液（稀釋的過氧化物酶）。將孔板置于25℃數(shù)顯恒溫水浴鍋中，等待30min孵育完全后，放入酶標(biāo)儀中，設(shè)置檢測光譜為520nm，測定其吸光度并通過吸光度計(jì)算血清中CAT活力。3.8血清中GSH/GSSG比值檢測取-80℃冰箱中凍存的血清，利用DTNB（顯色劑）的循環(huán)反應(yīng)，檢測總谷胱甘肽（totalglutathione，T-GSH）和氧化型谷胱甘肽（glutathionedisulfide，GSSG）的含量。谷胱甘肽還原酶可以將GSSG還原成GSH，而GSH可以和顯色劑DTNB反應(yīng)生成黃色產(chǎn)物。酶標(biāo)儀檢測405nm處的吸光度，計(jì)算血清中GSH/GSSG比值。具體操作步驟參照南京建成提供的谷胱甘肽測試盒說明書。3.9免疫熒光檢測組織中Nrf2蛋白表達(dá)（1）取-80℃冰箱中OCT包埋的組織，冰凍切片機(jī)切片（6μm），貼附于粘附載玻片上。（2）玻片置于預(yù)冷的丙酮中固定15min，PBS浸洗玻片3次，3min/次。（3）免疫組化筆在組織四周畫圓，吸取0.5%Triton-X-100緩緩滴于組織，待液滴覆蓋組織后，將玻片放置在通風(fēng)環(huán)境通透20min，期間維持室溫。通透完全后吸取適量PBS浸洗玻片，每次3min，總共清洗3次。（4）待玻片浸洗完全，用吸水紙吸干浸洗液。吸取正常山羊血清滴加在玻片表面，將玻片放置0.5h進(jìn)行封閉，期間維持室溫。封閉完全后用吸水紙輕輕吸干玻片表面的封閉液，不洗。（5）用移液槍吸取Nrf2一抗（1:1000）于玻片，將玻片放入濕盒置于4℃環(huán)境16h。再吸取適量PBST浸洗玻片，每次5min，總共清洗3次。（6）清洗完畢后吸取適量熒光二抗（1:1000）于玻片，將玻片放入濕盒置于室溫環(huán)境1h，再吸取適量PBST浸洗玻片，每次5min，總共清洗3次。（7）二抗孵育并清洗完畢后，吸取適量DAPI于玻片，置于暗處環(huán)境5min，再吸取適量PBST浸洗玻片，每次5min，總共清洗4次。（8）清洗完畢后吸取適量抗熒光衰減封片劑于玻片，蓋上蓋玻片，將蓋玻片置于激光共聚焦顯微鏡下，觀察并進(jìn)行圖像收集、匯總、處理。3.10Westernblot檢測組織中Nrf2蛋白表達(dá)（1）組織提蛋白：取-80℃冰箱中凍存的組織，每1mg組織加10μL裂解液（RIPA:PMSF=100:1）。混合后放入全自動樣品快速研磨儀勻漿2次，1min/次。將研磨后的勻漿放入離心管，置于臺式冷凍離心機(jī)離心10min，離心機(jī)參數(shù)設(shè)置為12000×g、4℃，離心結(jié)束后吸取上清液。（2）測定蛋白濃度：具體操作步驟以BCA蛋白濃度檢測試劑盒的說明書為準(zhǔn)，得到的樣品放入酶標(biāo)儀中，設(shè)置檢測光譜為562nm，測定其吸光度并通過吸光度計(jì)算蛋白濃度。（3）樣本稀釋并煮沸：用蒸餾水和1×loadingbuffer將蛋白稀釋成終濃度為2.5μg/μL，夾防爆夾沸水中變性5min，分裝保存于-20℃。（4）配膠：先配下層分離膠，注膠后用水壓平，靜置30min。倒去水加上層濃縮膠，并立即插入電泳梳，靜置30min。配好的膠浸泡于蒸餾水中，4℃保存。（5）上樣：上樣體積均為20μL/孔，最終上樣量為50μg/孔。（6）SDS電泳：加樣結(jié)束后，打開轉(zhuǎn)移電泳儀電源，將雙垂直電泳槽調(diào)至80V直流穩(wěn)定電壓開始電泳；當(dāng)溴酚藍(lán)隨著電泳移動至上、下層凝膠界面處，將80V電壓調(diào)高至120V恒壓繼續(xù)電泳；當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至凝膠底部時(shí)，結(jié)束電泳。（7）轉(zhuǎn)膜：將配置好的1×轉(zhuǎn)膜液倒入托盤中，取出凝膠放入托盤，剪切出含目的蛋白的凝膠區(qū)域，測量并記錄該區(qū)域長寬數(shù)據(jù)；依據(jù)剪切的長寬數(shù)據(jù)裁剪出適宜大小的PVDF膜并放入甲醇中活化2-3min，按照黑底-海綿-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-海綿-紅底的順序放好膠和膜，中間避免出現(xiàn)氣泡。小分子蛋白（<70kDa）轉(zhuǎn)膜條件為300mA恒流50min，大分子蛋白（>70kDa）轉(zhuǎn)膜條件為300mA恒流120min。（8）洗膜：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜裝入適當(dāng)大小的盒子，傾倒TBST至完全浸沒膜表面，將盒子放置在水平搖床5min，調(diào)節(jié)搖床為中速，該操作重復(fù)3次。（9）膜封閉：將盒子內(nèi)剩余的TBST傾倒，加入5%BSA，將盒子放置在水平搖床1h，調(diào)節(jié)搖床為慢速，。（10）洗膜：傾倒TBST至完全浸沒膜表面，將盒子放置在水平搖床5min，調(diào)節(jié)搖床為中速，該操作重復(fù)3次。（11）孵一抗：TBST稀釋一抗Nrf2（1:1000）、GAPDH（1:2000），膜放入相應(yīng)一抗中，4℃冰箱過夜（16h）。（12）洗膜：傾倒TBST至完全浸沒膜表面，將盒子放置在水平搖床5min，調(diào)節(jié)搖床為中速，該操作重復(fù)3次。（13）孵二抗：5%BSA稀釋兔二抗（1:3000），室溫孵育，將盒子放置在水平搖床1h，調(diào)節(jié)搖床為中速。（14）洗膜：傾倒TBST至完全浸沒膜表面，將盒子放置在水平搖床5min，調(diào)節(jié)搖床為中速，該操作重復(fù)3次。（15）顯影：吸取適量發(fā)光液滴于膜上，將膜放入暗室的載物對焦平臺，對準(zhǔn)電動鏡頭，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光和圖像收集、匯總、處理。（16）灰度測定：ImageJ軟件分析各蛋白條帶的灰度值。4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，ANOVA單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，P≤0.05為顯著差異，P≤0.01為極顯著差異。5實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.1AEW降低栓重正常組和假手術(shù)組不形成血栓；模型組大鼠形成質(zhì)地較松軟的暗紅色血栓，且靜脈壁與血栓緊密粘連；AEW低劑量組大鼠形成的血栓有所減小，靜脈壁與血栓仍緊密粘連；AEW高劑量組和華法林組大鼠形成的血栓均明顯減小，靜脈壁與血栓有粘連（Figure2A）。與正常組相比，假手術(shù)組并未出現(xiàn)顯著的栓重差異。與假手術(shù)組相比，F(xiàn)eCl3顯著誘導(dǎo)血栓形成，模型組栓重增加了261.5%（P<0.01）。與模型組相比，AEW高劑量組栓重降低了29.3%（P<0.01）（Figure2B）。Figure2Representativepicturesofharvestedtissues(A).EffectofAEWonthrombusweight(B)inratsofFeCl3-inducedIVCthrombosis.Datawereexpressedasmean±SEM,n=8forB.**P<0.01vs.shamgroup;##P<0.01vs.modelgroup;aP<0.05vs.AEW-Lgroup.5.2AEW減輕血管損傷正常靜脈壁結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)依次分為外膜、中膜及內(nèi)膜。外膜主要為膠原纖維，內(nèi)含神經(jīng)纖維；中膜位于內(nèi)膜和外膜之間，由平滑肌細(xì)胞層構(gòu)成；內(nèi)膜由單層的內(nèi)皮細(xì)胞緊密排列而成，是三層中最薄的一層。與正常組相比，假手術(shù)組并未出現(xiàn)顯著的血管壁形態(tài)差異（Figure3）。因此，后續(xù)指標(biāo)檢測不再設(shè)正常組。與假手術(shù)組相比，10%FeCl3嚴(yán)重?fù)p傷靜脈壁，可見靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的脫落和周圍平滑肌細(xì)胞的深染。與模型組相比，AEW高劑量顯著改善血管損傷（Figure3）。Figure3EffectsofAEWonthemorphologyofveinwallsinratsofFeCl3-inducedIVCthrombosis.I,intima;M,media;A,adventitia;E,endothelium;SMC,smoothmusclecell.HEstaining.Scalebar,10μm.5.3AEW減少組織中ROS累積和MDA含量與假手術(shù)組相比，F(xiàn)eCl3顯著增多組織中ROS累積（Figure4A）和MDA含量（P<0.01，F(xiàn)igure4B）。與模型組相比，A