王鴻利遺傳性凝血因子和抗凝因子缺陷

上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院上海血液學(xué)研究所王鴻利王學(xué)鋒等遺傳性凝血因子和抗凝因子缺陷癥的診斷與血友病A的基因治療研究背景研究背景遺傳性凝血因子缺陷癥和抗凝因子缺陷癥分別導(dǎo)致遺傳性出血病和血栓病患者往往自幼發(fā)病，持續(xù)終生，致殘率高、危害性大、甚至導(dǎo)致死亡，并遺傳至后代替代治療仍是目前唯一有效的治療手段，基因治療是根治本病的最佳選擇研究?jī)?nèi)容

研究?jī)?nèi)容研究對(duì)象qp項(xiàng)目血友病A血友病B合計(jì)攜帶者診斷741791產(chǎn)前診斷40646研究對(duì)象研究方法家系資料實(shí)驗(yàn)表型基因診斷臨床資料體外表達(dá)研究臨床診斷臨床治療研究流程出血病以血友病A為例出血為特征大關(guān)節(jié)肌肉腰大肌內(nèi)臟皮膚粘膜皮膚淤斑顱內(nèi)出血研究方法-臨床診斷研究方法-臨床診斷血栓病以抗凝血酶缺陷癥為例淺靜脈炎深靜脈血栓內(nèi)臟靜脈血栓肺栓塞研究方法-家系調(diào)查（FVIII)研究方法-家系調(diào)查（FVII)研究方法-家系調(diào)查（AT缺陷癥)研究方法-篩選試驗(yàn)和表型診斷實(shí)驗(yàn)1.凝血因子缺陷癥篩選試驗(yàn)：①APTT↑，PT正常：因子VIII缺陷癥（血友病A）、因子IX缺陷癥（血友病B）、因子XI缺陷癥因子XII缺陷癥②APTT正常，PT↑：因子VII缺陷癥③APTT↑，PT↑：因子X缺陷癥、因子V缺陷癥、凝血酶原缺陷癥、纖維蛋白原（Fg）缺陷癥④APTT正常，PT正常：因子XIII缺陷癥研究方法-篩選試驗(yàn)和表型診斷實(shí)驗(yàn)2.vWD篩選試驗(yàn)：①BT②APTT③FVIII:C3.抗凝因子缺陷篩選試驗(yàn)：①APCR②proGlobal試驗(yàn)研究方法-篩選試驗(yàn)和表型診斷實(shí)驗(yàn)4.凝血因子缺陷癥表型診斷試驗(yàn)：Fg(clauss法)FII:AgFII:CFV:AgFV:CFVII:AgFVII:CFVIII:AgFVIII:CFIX:AgFIX:CFX:AgFX:CFXI:AgFXI:CFXII:AgFXII:CFXIII:AgFXIII:CvWFR:cofvWF:Ag多聚體分析研究方法-篩選試驗(yàn)和表型診斷實(shí)驗(yàn)AT:AAT:AgPC:APC:AgTPS:AFPS:At-PA:At-PA:AgPAI:APAI:AgPLG:APLG:Agα2-AP:Aα2-AP:AgTAFI:ATAFI:Ag5.抗凝因子缺陷癥的表型診斷試驗(yàn)：研究方法-分子（基因）診斷DNA/RNA抽提RFLPPCR擴(kuò)增（RT-PCR、ASPCR）直接核酸測(cè)序DGGE檢測(cè)流程研究方法-分子（基因）診斷研究方法-分子（基因）診斷研究方法-分子（基因）診斷3.因子VIII缺陷癥（血友病A）：基因位點(diǎn)檢測(cè)：BclI、CA13、CA22的STR以及DXS52（ST14）陽(yáng)性率49%直接測(cè)序陽(yáng)性率100％研究方法-分子（基因）診斷4.因子IX缺陷癥（血友病B）：用長(zhǎng)距離PCR（LD-PCR）測(cè)定DXS102、DXS1211、DXS1192、DXS8031、DXS8094和DXS1227等6個(gè)位點(diǎn)的STR作基因分析，陽(yáng)性率達(dá)100%研究方法-分子（基因）診斷5.其他凝血因子缺陷癥：無(wú)（異常）纖維蛋白原血癥、凝血酶原缺陷癥、因子V、VII、X、XI、XII、XIII缺陷癥采用PCR擴(kuò)增所有外顯子及其側(cè)翼序列，基因測(cè)序的方法進(jìn)行基因診斷采用限制性酶切分析（RFLP)或等位基因特異性PCR（ASPCR）對(duì)發(fā)現(xiàn)的基因突變進(jìn)行驗(yàn)證研究方法-分子（基因）診斷6.抗凝因子缺陷癥：AT缺陷癥、PC缺陷癥、PS缺陷癥采用PCR擴(kuò)增所有外顯子及其側(cè)翼序列，基因測(cè)序的方法進(jìn)行基因診斷采用限制性酶切分析或ASPCR對(duì)發(fā)現(xiàn)的基因突變進(jìn)行驗(yàn)證轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞生物代謝標(biāo)記活性與抗原檢測(cè)免疫熒光染色Western印跡構(gòu)建突變基因cDNA的表達(dá)載體研究方法-體外表達(dá)研究研究流程HewittJ,etal.SevereFVIIdeficiencycausedbyanewpointmutationcombinedwithapreviouslyundetectedgenedeletion.BrJHaematol.2005;128(3):380-5.研究方法-體外表達(dá)研究其他研究:根據(jù)突變位點(diǎn)的特殊性，設(shè)計(jì)特異性的功能研究試驗(yàn)例如針對(duì)在信號(hào)肽或糖基化位點(diǎn)發(fā)生的突變等，可采用體外無(wú)細(xì)胞蛋白翻譯試驗(yàn)，研究突變導(dǎo)致缺陷癥的詳細(xì)分子發(fā)病機(jī)制PCR擴(kuò)增外周血DNA抽提（攜帶者）羊水DNA抽提（胎兒）直接核酸測(cè)析間接聯(lián)鎖分析明確診斷內(nèi)含子1,22倒位研究方法-血友病攜帶者和產(chǎn)前診斷LaveryS.Preimplantationgeneticdiagnosis:newreproductiveoptionsforcarriersofhaemophilia.Haemophilia.2004;10:126-32研究流程傳統(tǒng)方法：采集羊水單細(xì)胞植入前診斷研究方法-攜帶者和產(chǎn)前診斷研究方法-血友病攜帶者和產(chǎn)前診斷傳統(tǒng)方法血友病AFⅧ內(nèi)含子22倒位（INV22）、DXS52、BclⅠ、內(nèi)含子13（CA13）和內(nèi)含子22（CA22）等5個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)血友病B應(yīng)用DXS102、DXS1211、DXS1192、DXS8031、DXS8094和DXS1227等6個(gè)位點(diǎn)的STR作基因分析

體外受精胚胎發(fā)育6-8細(xì)胞1~2個(gè)單卵裂球細(xì)胞FVIII/IX基因分析正常胚胎植入宮內(nèi)活檢取單個(gè)細(xì)胞單細(xì)胞PCR技術(shù)植入前遺傳學(xué)診斷

（preimplantationgeneticdiagnosis，PGD）研究方法研究結(jié)果與討論凝血因子性質(zhì)抗凝因子性質(zhì)凝血/抗凝因子機(jī)制遺傳性凝血因子缺陷癥種類基因突變種類參考文獻(xiàn)國(guó)內(nèi)國(guó)外無(wú)（異常）纖維蛋白原血癥331凝血酶原缺陷癥322凝血因子V缺陷癥4243，4凝血因子VII缺陷癥11275，6凝血因子VIII缺陷癥48227，8凝血因子IX缺陷癥148969，10凝血因子X缺陷癥3911凝血因子XI缺陷癥3512凝血因子XII缺陷癥1613凝血因子XIII缺陷癥4914血管性血友病416115，16國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀抗凝因子缺陷癥基因突變種類參考文獻(xiàn)種類國(guó)內(nèi)國(guó)外抗凝血酶缺陷癥12717蛋白C缺陷癥233518，19蛋白S缺陷癥114820國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀(PGD)國(guó)際報(bào)道45種相關(guān)基因突變遺傳性凝血因子缺陷癥數(shù)量突變位點(diǎn)低（無(wú)）纖維蛋白原血癥5FgFGA基因4bpdel(g1892~1899)和1238bpdel（g1978~3215）,FGBArg17Stop,Gly347Arg,FGGArg275His凝血因子Ⅶ缺陷癥11Arg304Trp、Arg304Gln、Trp359Met、Arg353Gln,His348Gln、Arg152Gln、IVS1+5G>A、啟動(dòng)子-55G→T、-323insertion(-323po/p10)、G73A凝血因子VIII缺陷8Arg531Cys,Arg538Stop,Ala704Thr,Tyr1680Cys,Arg1966Stop,Arg2116Stop,Arg2150His,Arg2209Stop凝血因子Ⅸ缺陷癥5啟動(dòng)子區(qū)A13G,G6463A,G17747CG20414A,G308648A凝血因子Ⅹ缺陷癥1Thr318Met凝血因子Ⅺ缺陷癥1Glu323Lys凝血因子ⅪI缺陷癥11627位的C/T

血管性血友病2R1374S，S1506L

蛋白C缺陷癥抗凝血酶缺陷癥31Arg15Trp,Phe139Val,K150或151delVal404Thr國(guó)內(nèi)首次報(bào)道38種相關(guān)基因突變類別基因突變位點(diǎn)分子發(fā)病機(jī)制參考文獻(xiàn)凝血因子VII缺陷癥Phe40Cys,IVS1a+g>a滯留、降解（Phe40Cys），無(wú)凝血活性（IVS1a+g>a）42凝血因子VIII缺陷癥His99Arg分泌正常，功能障礙凝血因子X缺陷癥Ser-30Arg分泌障礙凝血因子XI缺陷癥Leu172ProGly400Val形成二聚體的滯留凝血因子XIII缺陷癥Ser413Trp，Arg77Cys分泌障礙，降解加速43蛋白C缺陷癥Cys64Trp,Phe139Val分泌障礙，降解加速抗凝血酶缺陷癥13889delG.C2603T、C2759T滯留，降解加速（13889delG）；功能障礙（