DB21-T 3120-2019水產(chǎn)動物物種分子鑒定 COI、16S rRNA分子標(biāo)記法

ICS65.150

B51

備案號：62025-2019DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3120—2019

水產(chǎn)動物物種分子鑒定

COI、16SrRNA分子標(biāo)記法

TechnicalspecificationforspeciesmolecularidentificationusingCOIand

16SrRNAofaquaticanimals

DB21/T3120—2019

水產(chǎn)動物物種分子鑒定COI、16SrRNA分子標(biāo)記法

1范圍

本方法規(guī)定了水產(chǎn)動物物種分子鑒定COI、16SrRNA分子標(biāo)記法的相關(guān)術(shù)語和定義，標(biāo)記方式，試

劑、儀器和設(shè)備，樣品采集、保存和前處理，DNA提取和檢測，序列擴(kuò)增和測序，以及物種鑒定的方法。

本方法適用于水產(chǎn)動物物種分子鑒定COI、16SrRNA分子標(biāo)記法。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

水產(chǎn)動物物種分子鑒定aquaticspeciesmolecularidentification

指利用分子生物學(xué)手段,對水產(chǎn)動物樣本（尤其適用于形態(tài)學(xué)特征相近、模糊或丟失的樣本）的分

子標(biāo)記進(jìn)行分析，鑒定生物種類的過程。

3.2

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction（PCR）

用一對寡核苷酸引物、四種脫氧核糖核苷酸（dNTPs）為原料，在合適的溫度、離子條件和耐熱DNA

聚合酶催化下，在體外人工合成特異DNA片段的過程。

3.3

DNA序列測定DNAsequencing

測定DNA分子的核苷酸序列。

3.4

序列比對alignment

為確定兩個(gè)或多個(gè)序列之間的相似性和同源性，將他們按照一定的規(guī)律進(jìn)行排列。

3.5

1

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DNA條形碼-COI

細(xì)胞色素c氧化酶亞基I（cytochromeccoxidasesubunitI）。

3.6

16SrRNA

16S核糖體核糖核酸（16SribosomalRNA）。

4標(biāo)記方式

水產(chǎn)動物的COI和16SrRNA的DNA序列進(jìn)化速度較快，同時(shí)又相對保守，可作為分子標(biāo)記條形碼用于

物種鑒定。通過PCR技術(shù)擴(kuò)增水產(chǎn)動物的COI和16SrRNA基因部分序列，測序后在已知數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列

比對，確定物種分類信息。本方法同時(shí)對COI和16SrRNA兩種分子標(biāo)記條形碼進(jìn)行分析，并在GenBank

（/genbank）和BOLDSystem（）兩個(gè)數(shù)

據(jù)庫中比對，確保鑒定成功率和準(zhǔn)確率。

5試劑、儀器和設(shè)備

5.1試劑

實(shí)驗(yàn)僅使用分析純試劑，水應(yīng)符合GB/T6682一級水要求。主要包含以下內(nèi)容：

——無水乙醇；

——95%乙醇；

——TE緩沖液（pH7.6）（100mol/LTris-Cl，pH7.6；10mmol/LEDTA，pH8.0）；

——Taq酶（5U/μL）；

——超純水；

——10×PCR緩沖液（500mmol/LKCl；100mmol/LTris-Cl，pH8.3；15mmol/LMgCl2）；

——引物（10μmol/L）；

——dNTP混合液（每種脫氧核糖核苷三磷酸濃度2.5mmol/L）；

——溴化乙錠（10mg/mL）；

——瓊脂糖；

——電泳標(biāo)記物（markers）；

——平衡酚；

——氯仿/異戊醇（24:1）；

——10×Tris硼酸（10×TBE）電泳緩沖液；

——滅菌蒸餾水；

——液氮；

——細(xì)胞裂解液（20mmol/L）。

5.2儀器和設(shè)備

實(shí)驗(yàn)用儀器和設(shè)備主要包含以下內(nèi)容：

——凝膠成像分析系統(tǒng)；

——PCR儀；

——低溫高速離心機(jī)（4℃，12000轉(zhuǎn)）；

2

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——穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；

——單道可調(diào)移液器；

——電子天平（0.001g）；

——水浴恒溫震蕩器；

——電泳槽；

——紫外分光光度計(jì)；

——遺傳分析儀。

6樣品采集、保存和前處理

6.1樣品采集、保存

樣本采集和后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)在生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選擇DNA含量高、多糖等含量低的肌肉、腸道、體

腔液、魚鰭等組織進(jìn)行采樣，樣品可通過-20℃冷凍、或4℃冰鮮等方式暫時(shí)保存。

6.2樣品前處理

將樣品切成5mm左右直徑的小塊或薄片，用滅菌蒸餾水洗凈，按1:10左右比例將樣品放入盛有95%

乙醇的離心管中，4℃保存。

7DNA提取和檢測

7.1DNA提取

7.1.1取0.1g左右樣品置于陶瓷研缽中，加少許液氮研碎。將粉末轉(zhuǎn)入400μL~500μL細(xì)胞裂解液

離心管中，37℃溫浴1h后轉(zhuǎn)入50℃水浴3h，期間經(jīng)常搖動。

7.1.2反應(yīng)液冷卻后加500μL平衡酚，緩慢顛倒10min混勻。12000rpm離心15min，轉(zhuǎn)上層水相于

新離心管中（重復(fù)此過程一次）。

7.1.3加氯仿/異戊醇450μL，混勻后12000rpm離心10min。轉(zhuǎn)上層水相于新離心管中，加1/10體

積3mol/LNaAc和2.5倍體積無水乙醇，混勻，置于-20℃環(huán)境下1h。

7.1.412000rpm離心15min，棄上清。以70%冷乙醇洗滌1~2次，真空抽干或自然吹干，加入TE緩

沖液溶解，-20℃保存。

7.2DNA檢測

7.2.1純度檢測

吸取1μL~3μLDNA，瓊脂糖凝膠100V電泳30min，如條帶整齊、亮度高，則純度滿足實(shí)驗(yàn)要求。

7.2.2濃度檢測

分別于260nm和280nm波長下測定DNA的紫外吸收值。DNA濃度(μg/mL)=[A260/(0.020×L)]×稀釋

倍數(shù)，式中L為比色池厚度，單位cm。DNA濃度在10μg/mL以上時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

8序列擴(kuò)增和測序

3

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8.1引物

水產(chǎn)動物PCR擴(kuò)增引物參見附錄A。

8.2PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增應(yīng)在以下體系和條件下進(jìn)行：

——PCR擴(kuò)增體系：10×PCR緩沖液10μL、上下游引物各1μL、DNA提取液5μL、Taq酶0.5μL，

dNTP混合液8μL、超純水定容至50μL；

——PCR擴(kuò)增條件：一個(gè)循環(huán)反應(yīng)（95℃5min），30個(gè)循環(huán)反應(yīng)（94℃30s，50℃30s，72℃60

s），72℃10min，結(jié)束PCR反應(yīng)。

8.3測序

利用遺傳分析儀對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，得到DNA序列信息。

9物種鑒定

9.1序列比對鑒定

將COI基因序列在GenBank和BOLDSystem中進(jìn)行核苷酸序列比對，將16SrRNA基因序列在GenBank

中進(jìn)行核苷酸序列比對。比對結(jié)果認(rèn)定如下：

——序列比對檢出標(biāo)準(zhǔn)為序列相似度≥99%；

——綜合COI和16SrRNA的比對結(jié)果形成最終鑒定結(jié)果；

——若出現(xiàn)2個(gè)及以上比對結(jié)果，則選取相似度高且結(jié)果一致的鑒定物種作為鑒定結(jié)果；

——對于鑒定成功的樣本，記錄于《水產(chǎn)動物物種分子鑒定記錄表》（見附錄B）；

——對于無匹配結(jié)果，或結(jié)果矛盾的樣本，作為未檢出樣本處理。

9.2未檢出樣本

未檢出樣本記錄于《未檢出水產(chǎn)動物分類記錄表》（詳見附錄C）。

4

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AA

附錄A

（資料性附錄）

水產(chǎn)動物物種分子鑒定PCR擴(kuò)增引物

表A.1水產(chǎn)動物物種分子鑒定PCR擴(kuò)增引物

物種引物序列

硬骨魚綱F:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'

軟骨魚綱R:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3'

F:5'-TATTATTAGACAAGAATCTGGTAAA-3'

甲殼綱

R:5'-AGGAAATGTTGAGGGAAGAAAGTAA-3'

雙殼綱F:5'-ACAAATCAYAARGAYATYGG-3'

腹足綱R:5'-ACCAATCATAAAGATATTGG-3'

F:5'-ACAAAYCATAAAGAYATTGG-3'

頭足綱

R:5'-GTAAATATATGRTGGGCTCA-3'

COI基因海參綱

F:5'-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3'

PCR擴(kuò)增引海膽綱

R:5'-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3'

物海星綱

F:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC-3'

缽水母綱

R:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'

F:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'

哺乳綱

R:5'-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3'

F:5'-ACTCAGCCATCTTACCTGTGATT-3'

爬行綱

R:5'-TGGTGGGCTCATACAATAAAGC-3'

通用F:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'

（選用）R:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'

通用

（除甲殼F:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3'

綱和頭足R:5'-TCCATAGGGTCTTCTCGTC-3'

16SrRNA綱）

基因PCR擴(kuò)

F:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3'

增引物甲殼綱

R:5'-TCCATAGGGTCTTATCGTC-3'

F:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3'

頭足綱

R:5'-TCCATAGGGTCTTTTCGTC-3'

注：COI基因PCR擴(kuò)增引物可選用特異引物或通用引物。

5

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BB

附錄B

（資料性附錄）

水產(chǎn)動物物種分子鑒定記錄表

表B.1水產(chǎn)動物物種分子鑒定記錄表

鑒定人；地點(diǎn)；

時(shí)間年月日時(shí)分至年月日時(shí)分

序號樣本編號樣品名稱樣品來源鑒定結(jié)果備注

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

記事：

采樣人記錄人校對人

6

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CC

附錄C

（資料性附錄）

未檢出水產(chǎn)動物分類記錄表

表C.1未檢出水產(chǎn)動物分類記錄表

鑒定人；地點(diǎn)；

時(shí)間年月日時(shí)分至年月日時(shí)分

序號樣本編號樣品名稱樣品來源未檢出結(jié)果備注

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

記事：

采樣人記錄人校對人

_________________________________

7

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參考文獻(xiàn)

[1]MitaniT,AkaneA,TokiyasuT,etal.Identificationofanimalspeciesusingthepartial

sequencesinthemitochondrial16SrRNAgene.Legalmedicine,2009,11:S449-S450.

[2]LakraWS,GoswamiM,