皮膚變態(tài)反應(yīng)-局部淋巴結(jié)試驗(yàn)DA

附件4皮膚變態(tài)反應(yīng)：局部淋巴結(jié)試驗(yàn):DASkinSensitization:LocalLymphNodeAssay:DA（LLNA:DA）1范圍本方法規(guī)定了局部淋巴結(jié)試驗(yàn)（LLNA:DA）的基本原則和試驗(yàn)要求。本方法適用于化妝品用化學(xué)原料皮膚變態(tài)反應(yīng)的檢測(cè)。2試驗(yàn)?zāi)康拇_定重復(fù)接觸化妝品用化學(xué)原料對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚局部是否可引起變態(tài)反應(yīng)及其程度。3定義3.1皮膚變態(tài)反應(yīng)（過敏性接觸性皮炎）skinsensitization，allergiccontactdermatitis皮膚對(duì)一種物質(zhì)產(chǎn)生的免疫源性皮膚反應(yīng)。在人類這種反應(yīng)可能以瘙癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰為特征。動(dòng)物的反應(yīng)不同，可能只見到皮膚紅斑和水腫。3.2皮膚刺激性dermalirritation皮膚涂抹受試物后局部產(chǎn)生的原發(fā)可逆性炎性變化。3.3刺激指數(shù)stimulationindex評(píng)價(jià)受試物皮膚致敏能力的值，是試驗(yàn)組與溶劑對(duì)照組增殖率的比值。4試驗(yàn)原理過敏原引起染毒部位回流淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖，其增殖程度與過敏原的劑量和效力成比例。通過生物發(fā)光法測(cè)定耳廓淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞ATP含量（與活細(xì)胞數(shù)相關(guān)）從而評(píng)價(jià)其增殖程度。生物發(fā)光法利用熒光素酶（luciferase）催化ATP和熒光素（luciferin）反應(yīng)同時(shí)發(fā)光，其發(fā)光強(qiáng)度與ATP濃度線性相關(guān)。通過計(jì)算受試物組與溶劑對(duì)照組ATP含量比值即刺激指數(shù)評(píng)價(jià)受試物的皮膚致敏性。ATP5試驗(yàn)的基本原則5.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境選用SPF級(jí)BALB/c或CBA/J小鼠，8～12周齡，雌性，未孕或未曾產(chǎn)仔的。體重差異應(yīng)不超過平均體重的20%。其他品系或雄性小鼠如經(jīng)驗(yàn)證LLNA:DA反應(yīng)不存在明顯品系或性別間差異亦可使用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國(guó)家相應(yīng)規(guī)定，選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制。5.2動(dòng)物試驗(yàn)前準(zhǔn)備試驗(yàn)前動(dòng)物應(yīng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境中至少適應(yīng)5d。將動(dòng)物隨機(jī)分組標(biāo)記（不要做任何形式的耳朵標(biāo)記），檢查皮膚應(yīng)健康無損傷。試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)應(yīng)記錄動(dòng)物體重。5.3可靠性檢查每次試驗(yàn)均需設(shè)置陽性對(duì)照組，陽性物一般采用25%己基肉桂醛（CAS號(hào)101-86-0）或25%丁子香酚（CAS號(hào)97-53-0），溶劑為丙酮：橄欖油（AOO，4:1，v/v）。當(dāng)陽性物與受試物的溶劑不同時(shí)，需另單獨(dú)設(shè)置陽性物的溶劑對(duì)照組。5.4試驗(yàn)期間每天觀察動(dòng)物臨床癥狀及耳朵局部刺激癥狀，并做完整記錄。6試驗(yàn)方法進(jìn)行本試驗(yàn)前，需通過預(yù)試驗(yàn)（每組1～2只動(dòng)物）排除受試物引起全身毒性和（或）局部皮膚中度刺激性。篩選最大劑量水平要求：液體受試物達(dá)到100%濃度，固體或懸浮液達(dá)到最大可能濃度。6.1動(dòng)物與分組動(dòng)物隨機(jī)分為陰性（溶劑）對(duì)照組、陽性對(duì)照組和受試物組（至少3個(gè)濃度），每組至少4只動(dòng)物。6.2受試物配制固體受試物應(yīng)溶于或懸浮于適當(dāng)溶劑中并稀釋，液體受試物可以直接或稀釋用。受試物應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。6.3溶劑的選擇常用溶劑為丙酮：橄欖油（AOO，v/v4:1）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲乙酮（MEK）、丙烯乙二醇、二甲基亞砜（DMSO）等。6.4劑量水平受試物最高濃度應(yīng)不引起動(dòng)物全身毒性和（或）局部皮膚中度刺激性，通過預(yù)試驗(yàn)按合適濃度梯度如100%、50%、25%、10%、5%、2.5%、1%、0.5%等選擇三個(gè)連續(xù)的試驗(yàn)濃度。6.5試驗(yàn)步驟6.5.1第1d動(dòng)物隨機(jī)分組、標(biāo)記、稱重、記錄臨床癥狀。將1%十二烷基硫酸鈉（SLS）均勻涂抹到小鼠雙側(cè)耳朵背部皮膚。刷子或棉簽應(yīng)浸泡在SLS溶液中，并在小鼠每個(gè)耳朵背部重復(fù)涂抹4～5次。1h后再涂抹受試物或?qū)φ?5μL/耳。6.5.2第2d、第3d、第7d操作同第1d，重復(fù)1%SLS溶液預(yù)處理和受試物或?qū)φ胀磕ā?.5.3第4～6d不做任何處理。6.5.4第8d記錄小鼠體重和出現(xiàn)的任何臨床癥狀，第7d染毒后約24～30h人道處死動(dòng)物，摘取小鼠雙側(cè)頜下淋巴結(jié)，同時(shí)分離耳廓打孔稱重。試驗(yàn)期間每天觀察記錄小鼠臨床癥狀及耳朵局部刺激癥狀并按表1進(jìn)行評(píng)分，任何時(shí)候局部刺激紅斑評(píng)分≥3和（或）耳廓厚度（耳廓重）≥25%，為中度皮膚刺激性。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，不應(yīng)出現(xiàn)中度皮膚刺激性反應(yīng)。表1紅斑評(píng)分癥狀分值無紅斑0輕微紅斑（勉強(qiáng)可見）1明顯紅斑2中度-重度紅斑3嚴(yán)重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成46.5.5淋巴細(xì)胞懸液的制備將每只小鼠分離的淋巴結(jié)夾在兩片載玻片之間，施加輕微壓力壓碎，拉動(dòng)兩個(gè)載玻片使之分開。將每片載玻片在培養(yǎng)皿上固定一定的角度，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，同時(shí)用細(xì)胞刮刀將載玻片上組織輕輕刮下，每只小鼠淋巴結(jié)制成1mL細(xì)胞懸液。吸取20μL淋巴細(xì)胞懸液加到1.98mLPBS中混勻制成2mL樣品，注意不要吸取肉眼可見的膜。用相同方法制備第二個(gè)2mL樣品（每只小鼠制備兩份平行樣品）。6.5.6細(xì)胞增殖測(cè)定（淋巴細(xì)胞ATP含量測(cè)定）用ATP測(cè)定試劑盒熒光素/熒光素酶法測(cè)定淋巴結(jié)中ATP含量，以相對(duì)發(fā)光單位（RLU）表示生物發(fā)光。由于動(dòng)物處死后其ATP含量隨時(shí)間逐漸下降，因此每只動(dòng)物從處死到ATP含量測(cè)定時(shí)間應(yīng)保持一致，約30min內(nèi)。每只動(dòng)物從分離頜下淋巴結(jié)到ATP測(cè)定系列操作務(wù)必在20min內(nèi)完成，且每只動(dòng)物處理時(shí)間保持一致。每只動(dòng)物測(cè)定2份2mL細(xì)胞樣品，取其ATP發(fā)光均值用于后續(xù)計(jì)算。7數(shù)據(jù)處理刺激指數(shù)（stimulationindex,SI）為受試物組或陽性對(duì)照組RLU均值與溶劑對(duì)照組RLU均值比值，計(jì)算公式如下：刺激指數(shù)EC1.8（estimatedconcentrationneededtoproduceSI=1.8）為SI=1.8時(shí)受試物的濃度。當(dāng)受試物3個(gè)濃度分別為SI＞1.8和SI＜1.8時(shí)，計(jì)算公式如下：EC1.8=c+當(dāng)受試物3個(gè)濃度均為SI≥1.8時(shí)，計(jì)算公式如下：EC1.8注：a、c為相鄰兩點(diǎn)受試物的濃度，b、d為相應(yīng)SI值。數(shù)據(jù)應(yīng)以表格形式顯示每只小鼠的RLU值、每組的RLU均值與標(biāo)準(zhǔn)差、每個(gè)受試物各劑量組的平均SI值，計(jì)算每個(gè)受試物的EC1.8值并判定致敏強(qiáng)度。對(duì)所有數(shù)據(jù)應(yīng)采用SPSS軟件或其他適當(dāng)合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。8結(jié)果判定刺激指數(shù)SI≥1.8，受試物為致敏陽性。對(duì)于1.8≤SI≤2.5臨界值是否判斷為陽性，應(yīng)結(jié)合考慮劑量-效應(yīng)關(guān)系、統(tǒng)計(jì)顯著性、系統(tǒng)毒性或皮膚刺激性