分光光度計(jì)基線校正的原理和方法

【原創(chuàng)】關(guān)于分光光度計(jì)基線校正的原理和方法/shtml/20081115/1587186/對(duì)于雙光束而言在使用前必須要做基線校正（也稱為基線記憶），對(duì)于此項(xiàng)工作的原理和操作方法許多使用者的認(rèn)識(shí)不盡相同；為此談?wù)勎业恼J(rèn)識(shí)。

（一）為何要做基線校正？

眾所周知、光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)基本是由光源（氘燈、鎢燈）—單色器（光柵、狹縫）—檢測(cè)器（光敏二極管、光電倍增管）等三部分組成的。在我們使用的波長(zhǎng)區(qū)域中（一般紫外可見儀器均在190nm～1100nm范圍里，）上述部件在不同的波長(zhǎng)下的響應(yīng)值（光源的發(fā)射強(qiáng)度、單色器的色散強(qiáng)度、檢測(cè)器的放大倍數(shù)）均不相同；通俗地說、即使沒有樣品，儀器如果不做基線校正，那么在190nm至1100nm的范圍中，吸光值或透過率不會(huì)是一條直線，這是一種客觀的物理現(xiàn)象，如下圖；

盡管上圖反映的是單光束的能量圖，但在基線未校正狀態(tài)下，即使改用雙光束測(cè)量方式來掃描一個(gè)樣品，其所得到的圖譜或吸光值也是不可信的。

（二）被校正的基線種類和用途

（1）系統(tǒng)基線：

所謂系統(tǒng)基線就是儀器固有的波長(zhǎng)范圍的總基線；例如一臺(tái)儀器出廠設(shè)計(jì)的波長(zhǎng)全程范圍是190nm至1100nm，那么它的系統(tǒng)基線就是這個(gè)范圍。一般來講，作為分析人員對(duì)一臺(tái)儀器做全程掃描測(cè)試是比較少見的；之所以要做系統(tǒng)基線的目的一般是將儀器的光學(xué)系統(tǒng)的響應(yīng)值校正到基本一致；這就類似馬拉松賽跑一樣，只要大家在同一起跑處（注意：不是起跑線）比賽，前后差幾米出發(fā)無所謂。

（2）用戶基線：

所謂用戶基線就是分析者自己設(shè)定的測(cè)量波長(zhǎng)區(qū)域的一段基線；由于這是分析所需要的區(qū)域，為了保證測(cè)試的準(zhǔn)確性，故用戶基線的校正是非常重要和必要的；這就類似百米賽跑一樣，運(yùn)動(dòng)員要在同一個(gè)起跑線上比賽而不能搶跑，否則無法準(zhǔn)確計(jì)算成績(jī)。

（三）基線校正的方法

（1）系統(tǒng)基線：

系統(tǒng)基線的校正較為簡(jiǎn)單，一般情況下樣品室內(nèi)不放樣品，僅做光學(xué)系統(tǒng)的校正；如果一定要使用全波段的測(cè)量那另當(dāng)別論。同時(shí)需要注意的是：系統(tǒng)基線無需經(jīng)常校正，一般半個(gè)月或一個(gè)月校正校正一次即可。對(duì)有的儀器來說，系統(tǒng)基線校正過于頻繁反而會(huì)造成基線漂移嚴(yán)重。

（2）用戶基線校正：

正確的校正方法是：兩只比色杯盛有空白溶液分別放置在樣品及參比光路中，校正波長(zhǎng)范圍要大于分析波長(zhǎng)范圍；例如、分析設(shè)定范圍為220nm～500nm，那么校正波長(zhǎng)就要設(shè)定為210nm～510nm；等待校正結(jié)束后再將波長(zhǎng)設(shè)定回到原來的220nm～500nm范圍。這種校正方法的優(yōu)點(diǎn)是：如果校正波長(zhǎng)與分析波長(zhǎng)完全吻合一致，有可能在校正后的基線兩端出現(xiàn)大的噪聲；如果校正范圍大于實(shí)際分析范圍并掐頭去尾后可以提高分析精度。我將這種校正方法起名為“豆芽菜原理”，目的是便于記牢；（因?yàn)槲覀兂远寡坎藭r(shí)均要掐頭去根，僅吃中間部分，故以前的飯館將炒豆芽這道菜稱為“炒掐菜”；對(duì)不起、跑題了）。關(guān)于這種校正方法，許多使用者往往不知曉或忽略掉了，在此順便介紹給版友。

值得注意的是，有的者在做基線校正時(shí)，參比一側(cè)不放參比溶液，也就是用空氣來做參比對(duì)照。這種方法在可見區(qū)對(duì)有的樣品也許有時(shí)影響不大，但在紫外區(qū)影響就會(huì)很明顯了。嚴(yán)格的說，用空氣做參比所測(cè)得的結(jié)果不是真正意義上的校正光譜。

（四）基線校正的

（1）基線校正時(shí)要保證儀器有一定的預(yù)熱時(shí)間

（2）每更換一種參比溶液后均要重新做基線校正

（3）如果參比溶液的吸光度大于樣品的吸光度值時(shí)測(cè)試結(jié)果會(huì)出現(xiàn)負(fù)值，此時(shí)要考慮使用何種溶液做基線校正了。

（4）做基線校正時(shí)要考慮試劑的使用波長(zhǎng)范圍問題，因?yàn)橛械脑噭┰谀硞€(gè)波長(zhǎng)以下的吸光度值會(huì)無限大，這時(shí)去做校正會(huì)超出儀器的有效量程范圍，無法得到