ELISA實驗原理及操作

實驗五免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用

——ELISA1精選ppt一、實驗?zāi)康牧私夂驼莆彰庖呙讣夹g(shù)的測定原理。掌握酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)的操作步驟，學(xué)會利用競爭ELISA的方法，定量測定抗體或抗原。了解免疫酶技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的重要意義及應(yīng)用價值。2精選ppt二、實驗原理免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabellingtechnique）:是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標(biāo)記抗體或抗原進行的抗原抗體反應(yīng)。

特點：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位分類：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測定。3精選ppt免疫酶技術(shù)(enzymeimmunoassay)：

是將抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢測技術(shù)。

就是利用酶標(biāo)記抗體或抗原，以檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。4精選ppt酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay）

是一類常用的免疫酶技術(shù)。是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行。常用的酶：辣根過氧化物酶(HRP)堿性磷酸酶（AP）。5精選pptELISA檢測抗原

Ag+ Ab*?Ag-Ab*6精選pptELISA檢測抗體

Ab+ Ag*?Ab-Ag*7精選pptELISA檢測抗體Ag+Ab1?Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*?Ag-Ab1-Ab2*8精選ppt9精選ppt競爭ELISA檢測

抗原10精選ppt固定OD值11精選ppt12精選ppt實驗材料：羊抗人血清白蛋白抗體（一抗）已知含量的人血清白蛋白（作標(biāo)準(zhǔn)曲線）待檢人血清白蛋白辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊抗體（二抗）包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液洗板液或稀釋液：PH7.4，0.01mol/LPBS底物溶液：OPD-H2O2終止液：2mol/LH2S04酶標(biāo)反應(yīng)板（一條/人）13精選ppt三、操作步驟包被抗原

抗原用包被液（CBS）稀釋至合適濃度，加入到酶標(biāo)板中，100μl/孔，放入濕盒中，4℃過夜。次日，用洗板液洗板3次（將洗板液加入每孔，1min后傾去），以洗去未包被的游離抗原?？乖?00ul/孔濕盒中，4℃過夜酶標(biāo)板14精選ppt抗原與抗體的預(yù)孵育制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

在稀釋板中，用PBS倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)抗原，每種濃度的抗原最終為50μl，分別在各抗原孔中加入250μl一定濃度的抗體，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中30min。待測抗原：

取50μl未知濃度的抗原按照同上操作。待測抗原50ulPBS50ul50ul稀釋液50ul50ul100ul標(biāo)準(zhǔn)抗原250ul抗體稀釋板37℃，30min15精選ppt3.與固相抗原的競爭結(jié)合

取稀釋板中預(yù)孵育的抗原抗體混合液100μl，加入酶標(biāo)板的抗原孔中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中60min。洗板3次。100ul稀釋板酶標(biāo)板37℃，60min洗板3次16精選ppt4.酶標(biāo)二抗的結(jié)合

酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋至工作濃度后，加入每孔中，100ul/孔，置濕盒中放37℃30min。洗板3次。5.加入底物顯色液（用前再配制，并置棕色瓶內(nèi)）每孔加入底物顯色液，100ul/孔，濕盒中37℃保溫一定時間。6.終止反應(yīng)

待出現(xiàn)明顯顏色反應(yīng)（或一定時間）后，加入終止液，50ul/孔以終止反應(yīng)。7.結(jié)果測定用酶標(biāo)儀在492nm波長下測定OD值。以標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算未知抗原的濃度。17精選ppt四、思考題在定量測定抗原時，直接ELISA與競爭ELISA有何區(qū)別？從理論上分析一下各自的優(yōu)缺點。在實際操作中，你認為有