醫(yī)學(xué)知識一5、內(nèi)毒素檢查法在藥品生產(chǎn)質(zhì)控的應(yīng)用修改

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查在藥品生產(chǎn)質(zhì)控上的應(yīng)用馮聚錦湛江安度斯生物有限公司2009年3月第二稿2一、鱟試驗(yàn)對藥品生產(chǎn)質(zhì)控的意義藥品生產(chǎn)企業(yè)實(shí)施GMP的意義在于使人們對藥品質(zhì)量的控制從傳統(tǒng)的成品檢驗(yàn)，上升到對藥品生產(chǎn)全過程進(jìn)行有效監(jiān)控的現(xiàn)代質(zhì)量管理模式。美國食品及藥物監(jiān)督管理局（FDA）自2004年起大力推行“過程分析技術(shù)”(ProcessAnalyticalTechnology,PAT)，更凸顯了醫(yī)藥發(fā)達(dá)國家對藥品生產(chǎn)過程質(zhì)控的高度重視。2024/3/83在醫(yī)藥工業(yè)的GMP條件下，“熱原就是內(nèi)毒素，控制內(nèi)毒素就控制了熱原”已成為共識?；谶@種認(rèn)識，許多國家的藥典已由細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)取代熱原檢查項(xiàng)并且成為了發(fā)展的趨勢，將會有越來越多的藥典品種使用鱟試劑檢查。不僅如此，鱟試驗(yàn)法在醫(yī)藥工業(yè)上目前是注射藥品生產(chǎn)質(zhì)控的最好方法，它為眾多的藥品生產(chǎn)企業(yè)帶來顯著的經(jīng)濟(jì)效益。4

中國和美國是世界上應(yīng)用鱟試劑最早的國家，也是鱟試劑產(chǎn)量及用量最多的國家。盡管如此，兩國在鱟試劑應(yīng)用的水平、程度及范圍上仍有明顯的差異。中國藥典2005年版收載的BET品種有160多種，而USP收載的BET品種超過700種。2024/3/870%＜30%生產(chǎn)質(zhì)控應(yīng)用領(lǐng)域的比較30%3%30%25%42%美國＞70%—

——

—5%＞90%中國終產(chǎn)品檢驗(yàn)終點(diǎn)顯色動態(tài)顯色動態(tài)濁度凝膠法方法學(xué)應(yīng)用的比較在醫(yī)藥發(fā)達(dá)國家，一個注射藥品生產(chǎn)體系的建立或GMP認(rèn)證，都要求在生產(chǎn)質(zhì)控上應(yīng)用鱟試驗(yàn)方法。我國目前的GMP認(rèn)證還沒有這方面的要求，應(yīng)該說是個缺陷，但發(fā)展趨勢必然會補(bǔ)充相應(yīng)的要求。5二、生產(chǎn)質(zhì)控的基本特點(diǎn)及要求按控制的時機(jī)分類：事前控制：對正在生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量控制有效；事后控制：對正在生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量控制無效，只對以后生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量控制有效。按控制的方式分類：靜態(tài)控制：對已完成的生產(chǎn)工序的質(zhì)控?zé)o效，只對以后的生產(chǎn)工序的質(zhì)控有效；動態(tài)控制：對正在進(jìn)行或?qū)⒁M(jìn)行的生產(chǎn)工序的質(zhì)控有效。2024/3/862024/3/8生產(chǎn)質(zhì)控對檢驗(yàn)方法的要求采樣方便、微量操作簡單、快速檢查準(zhǔn)確、靈敏結(jié)果可靠，數(shù)據(jù)處理自動化鱟試驗(yàn)法目前是滿足藥品生產(chǎn)質(zhì)控的最好方法鱟試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)：采樣方便、微量：0.1~1ml操作簡便、快速：7~60分鐘靈敏、準(zhǔn)確：最低可測0.001EU/mL的內(nèi)毒素含量，定量檢測的范圍可涵蓋0.001~1,000EU/mL。技術(shù)成熟，自動化程度高鱟試驗(yàn)是目前能使藥品生產(chǎn)的熱原控制實(shí)現(xiàn)動態(tài)監(jiān)控和事前控制的唯一方法。7三、藥品生產(chǎn)過程內(nèi)毒素的控制方法內(nèi)毒素監(jiān)控體系（1）監(jiān)控對象重要的媒體及原料水是制藥工業(yè)最重要的媒體，是首要的監(jiān)控對象使用量大的原料生產(chǎn)過程添加的各種輔劑與中間體接觸的各種用具、器皿及終產(chǎn)品的包裝容器2024/3/88各工序前后中間體內(nèi)毒素水平的變化

至少在生產(chǎn)過程的重要工序之間要設(shè)置檢測點(diǎn)，例

如在除熱原工序后設(shè)置檢測點(diǎn)，檢測該工序除熱原（干烤、過濾、吸附）的效果。又如在分裝工序前需抽檢，確保中間體內(nèi)毒素水平不超出控制水平才進(jìn)行分裝。烘箱等除熱原設(shè)備的驗(yàn)證2024/3/89生產(chǎn)原料生產(chǎn)用具、容器入庫清洗、除熱原備用工序1原料分裝輔劑工序2工序3終成品入庫水輔劑Δ1Δ2Δ3Δ6Δ8Δ4Δ5Δ7Δ9Δ10鱟試驗(yàn)檢查Δ1Δ2Δ3Δ內(nèi)毒素檢測點(diǎn)

工序運(yùn)行路線

取樣

檢測結(jié)果反饋2024/3/8（2）藥品生產(chǎn)過程細(xì)菌內(nèi)毒素監(jiān)控體系10建立內(nèi)毒素監(jiān)控體系的步驟確定藥品的內(nèi)毒素限值L；分析藥品生產(chǎn)過程，合理設(shè)置內(nèi)毒素監(jiān)測點(diǎn)；制定各監(jiān)測點(diǎn)合理的內(nèi)毒素控制水平Lx；進(jìn)行干擾性驗(yàn)證試驗(yàn)確定各監(jiān)測點(diǎn)樣品的有效濃度或有效稀釋范圍，選擇所用鱟試劑的靈敏度。進(jìn)行日常的內(nèi)毒素監(jiān)測檢查。2024/3/811內(nèi)毒素控制限值的確定如果終產(chǎn)品的內(nèi)毒素限值為L，各監(jiān)測點(diǎn)的內(nèi)毒素控制水平為LX，則LX＜L。某些原料或中間體在其后的生產(chǎn)工序中將要被稀釋，計(jì)算其稀釋后的內(nèi)毒素含量ED，如果ED＜1/4L，可以允許該原料或中間體的內(nèi)毒素控制水平LX＞L。例如，某種主要原料在生產(chǎn)時將要被稀釋10倍使用，如果L為0.5EU/ml，可以允許該原料的內(nèi)毒素控制水平LX

1.25EU/ml。2024/3/812

如果能確實(shí)保證在除熱原工序后的中間體的內(nèi)毒素含量少于1/4L，可允許該工序前的LX適當(dāng)大于L。在制定各監(jiān)控點(diǎn)LX時，應(yīng)注意熱原具有積累性。制藥企業(yè)需要根據(jù)自身的生產(chǎn)條件及工藝水平來制定合理的LX值。在歐美通常以1/10L~1/4L作為LX。2024/3/813

千萬不要以藥典的內(nèi)毒素限值作為控制值

據(jù)了解，不少企業(yè)的質(zhì)檢人員以藥典給出的該品種的內(nèi)毒素限值作為產(chǎn)品質(zhì)量的控制值或者作為產(chǎn)品出廠放行的合格值。這種做法其實(shí)不好，原因如下：

（1）藥典給出的藥品的內(nèi)毒素限值是對藥品質(zhì)量的最低要求。任何有一定質(zhì)量能力的企業(yè)都不應(yīng)以這最低的要求作為自己產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)。

（2）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是一項(xiàng)生物檢查，有較寬的精確范圍。特別是凝膠法鱟試驗(yàn)，精確度只有值的50~200%，當(dāng)產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量值接近限值時，很容易出現(xiàn)結(jié)果的不確定性。

（3）理想的產(chǎn)品放行值應(yīng)≤1/4藥典限值。2024/3/814各監(jiān)控點(diǎn)樣品的干擾驗(yàn)證目的：找出每個監(jiān)測點(diǎn)的供試品的無干擾濃度抽取監(jiān)測點(diǎn)的適量樣品選擇凝膠法鱟試劑的靈敏度或定量鱟試劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍；計(jì)算檢測樣品的最大有效稀釋倍數(shù)MVD樣品與鱟試劑相容性的初篩試驗(yàn)；樣品與鱟試劑的干擾試驗(yàn)2024/3/815

干擾驗(yàn)證舉例（凝膠法）：

某生物制品在冷凍干燥前的分裝液（S）為120mg/ml,Lx<0.05EU/mg(L<0.2Eu/mg)。1）Ls<0.05Eu/mg×120mg/ml＝6.0Eu/ml；2）若選用λ=0.125Eu/ml的TAL，最大有效稀釋；

163）取分裝液(S)用BET水作1:48倍稀釋，得供試液（S48）；4）取λ=0.125Eu/ml的TAL對S48作干擾試驗(yàn)；5）如果干擾試驗(yàn)結(jié)果表明S48對BET無干擾，就把這個濃度定為S的日常監(jiān)測濃度，即每批產(chǎn)品分裝前，取S稀釋成S48，用λ=0.125EU/mL的TAL作檢查。如果檢查結(jié)果為陽性，表明S的內(nèi)毒素含量超標(biāo)（≥0.05Eu/mg），不能進(jìn)入分裝凍干工序；如果檢查結(jié)果為陰性，S可進(jìn)行分裝凍干。17生產(chǎn)過程細(xì)菌內(nèi)毒素監(jiān)控的常規(guī)檢查采樣把樣品制備成供試液（如前S48）鱟試驗(yàn)檢查結(jié)果分析將信息反饋至生產(chǎn)控制系統(tǒng)18四、細(xì)菌內(nèi)毒素的快速檢測方法鱟試驗(yàn)在生產(chǎn)質(zhì)控上應(yīng)用的方法較靈活，不受藥典法規(guī)的限制，既可采用藥典法規(guī)接受的鱟試驗(yàn)方法，也可采用更新更先進(jìn)的技術(shù)和方法。以下介紹幾種有代表性的最新的快速鱟試驗(yàn)方法。細(xì)菌內(nèi)毒素快速檢測試劑盒湛江安度斯公司的發(fā)明專利屬于凝膠法原理：使用高靈敏度的試劑作低靈敏度使用反應(yīng)時間只需20-25分鐘操作方便、簡單用途：生產(chǎn)過程細(xì)菌內(nèi)毒素的限量快速檢測2024/3/819特點(diǎn)：使用方便

快速檢測盒內(nèi)配置與國際使用接軌的單次試驗(yàn)鱟試劑（TAL）。使用這種單次試驗(yàn)TAL時，直接加0.2ml樣品復(fù)溶試劑兼檢測，不必象使用0.1ml/支TAL那樣要先加0.1ml的水復(fù)溶試劑，然后再加0.1ml樣品檢測。20同一試劑盒有多個靈敏度供選擇

在每一批號的快速檢測試劑盒上都標(biāo)示有至少兩個可供選擇的靈敏度。使用時選擇不同的靈敏度(λ0)對應(yīng)有不同的反應(yīng)時間(T0)。如批號為0809082的快速檢測試劑盒，靈敏度標(biāo)示如下：λ0T00.25EU/mL20±1分鐘0.125EU/mL25±1分鐘21CSE無需稀釋

我們知道，作鱟試驗(yàn)最繁瑣耗時的操作就是稀釋標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE）?？焖贆z測試劑盒配備了無需稀釋一步到位的CSE，使實(shí)驗(yàn)真正快速方便。配套器具，得心應(yīng)手

作快速鱟試驗(yàn)時，如果配合使用安度斯公司提供的可調(diào)移液器、采樣瓶、可定時的干式恒溫儀等實(shí)驗(yàn)器具，可真正體會到BET實(shí)驗(yàn)的快速、準(zhǔn)確及方便。

22名稱規(guī)格數(shù)量鱟試劑（TAL）0.2ml/支λ：0.125EU/ml/0.25EU/ml8支工作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE）5EU/支1支BET水2ml/支1支

試劑盒組成23

使用方法：（λ=0.125EU/mL）檢查項(xiàng)目反應(yīng)管數(shù)每管加樣陰性對照（溶液D）20.2mLBET水陽性對照（溶液C）20.2mLBET水+0.01mLE5供試品陽性對照（溶液B）20.2mLS+0.01mLE5

供試品（溶液A）20.2mLS24光度法定性快速檢測法屬動態(tài)濁度或動態(tài)顯色法需要使用動態(tài)光度儀及相應(yīng)軟件方法及步驟1）確定供試品原液（S0）的內(nèi)毒素限值（L或Lx）2）確定供試品無干擾濃度，如S8

3）制備不含可測內(nèi)毒素的供試品S84）制備含L8濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的陽性供試品S8L8

2024/3/8

255）在日常監(jiān)測時，以S8L8與TAL反應(yīng)的時間T0作為判斷其它供試品內(nèi)毒素含量的標(biāo)準(zhǔn)：凡是反應(yīng)時間T<T0的供試品，其內(nèi)毒素含量>L8，即原液S0的內(nèi)毒素含量>L凡是反應(yīng)時間T>T0的供試品，其內(nèi)毒素含量<L8，即原液S0的內(nèi)毒素含量<L；只需供試品的動態(tài)曲線一達(dá)到預(yù)設(shè)光度值，即可知道該供試品是否合格。甚至分析供試品動態(tài)曲線的走勢就可知道供試品是否合格。2024/3/8預(yù)設(shè)透光度值S8L8產(chǎn)品不合格產(chǎn)品合格T1T0

T2S8NC100%92%RtT(秒)26光度法定量快速檢測法屬動態(tài)濁度法或動態(tài)顯色法需要使用安度斯軟件“生物探針-2002”方法及步驟

1）預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素與TAL反應(yīng)制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，存檔。最理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線是用同體系模型法建立（參閱本公司講義2005年3月版）；

2）檢測開始前調(diào)出存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線

3）反應(yīng)開始后，只要各供試品的動態(tài)曲線一達(dá)到預(yù)設(shè)光度值，界面上的表格中立即顯示出該供試品的內(nèi)毒素含量2024/3/827供試品內(nèi)毒素含量調(diào)用的標(biāo)準(zhǔn)曲線2024/3/828注意事項(xiàng)制備存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線的TAL必須與檢測試劑相同；供試品應(yīng)在無干擾濃度且不超過MVD濃度內(nèi)檢測。2024/3/8294、便攜式檢測系統(tǒng)——PTS

PTS是美國查爾斯河實(shí)驗(yàn)室公司(CharlesRiverLaboratories,Inc.)最新推出的生物分析系統(tǒng)

PTS是一種便攜式、可現(xiàn)場使用、快速、定量的檢測系統(tǒng)。細(xì)菌內(nèi)毒素的定量快速檢測僅是PTS的功能之一，其它生物測定的功能正在陸續(xù)推出。30

PTS是由便攜式光度儀和檢測試劑卡兩部分組成。31

技術(shù)原理——動態(tài)顯色法鱟試驗(yàn)每塊試劑卡中有四條反應(yīng)通道如下：系統(tǒng)內(nèi)置存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器自動測定吸光度及進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。供試品

陽性對照

通道(2條)加樣孔LAL顯色底物CSE反應(yīng)池抽吸孔供試品

檢查通道

（2條）32

實(shí)驗(yàn)方法開啟儀器預(yù)熱至37℃插入試劑卡在試劑卡的四個加樣孔中各加入25l(0.025ml)供試品溶液按“檢測”鍵（Enter）約7~15分鐘后屏幕上顯示如下檢測結(jié)果：回收率：？供試品含量：？EU/mL變異系數(shù)：CV=?%33

PTS的特點(diǎn)使用極靈敏可靠的鱟試驗(yàn)技術(shù)獲得美國FDA認(rèn)證體積小巧，僅1公斤重，內(nèi)置電源，可在任何現(xiàn)場使用7-15分鐘可獲得定量的檢測結(jié)果只需極簡單的操作：插入檢測卡片→加入樣品→自動檢測并顯示檢測結(jié)果34無需用戶建立標(biāo)準(zhǔn)曲線無外部恒溫孵育要求檢測范圍：10-0.1EUmL

5-0.05EU/mL

1-0.01EU/mL可顯示樣品內(nèi)毒素含量、回收率、變異系數(shù)檢測結(jié)果可貯存、打印或下載到電腦35

PTS的應(yīng)用水制備系統(tǒng)的監(jiān)控研發(fā)產(chǎn)品的檢測生產(chǎn)現(xiàn)場半成品的快速檢測醫(yī)療器械的質(zhì)量監(jiān)控——如血液透析36

目前PTS可分析的項(xiàng)目細(xì)菌內(nèi)毒素檢測（7~15分鐘）β-葡聚糖檢測（10~30分鐘）微量蛋白檢測（20分鐘）革蘭氏陰性、陽性細(xì)菌及酵母菌/霉菌鑒別（3-7分