家畜螨病診斷與防控技術(shù)規(guī)范

1家畜螨病診斷與防控技術(shù)規(guī)范本文本文件規(guī)定了家畜螨病診斷與防控技術(shù)規(guī)范。本文件適用于5類家畜（牛、羊、豬、兔、馬）螨病診斷與防控技術(shù)規(guī)范。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T393-2020綠色食品農(nóng)藥使用準(zhǔn)則NY/T5030-2016無公害農(nóng)產(chǎn)品獸藥使用準(zhǔn)則NY/T473-2016綠色食品畜禽衛(wèi)生防疫準(zhǔn)則NY/T472-2013綠色食品獸藥使用準(zhǔn)則3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1疥螨（Sarcoptesscabiei）一種寄生于家畜（主要危害牛、羊、豬、兔和馬）皮膚表皮層內(nèi)的外寄生蟲，蟲體較小，乳白色，呈近圓形或龜形，背面隆起似半球形，腹面扁平，可引起家畜的疥螨病，參見附錄A.1.1。3.2綿羊癢螨（Psoroptesovis）一種寄生于家畜（主要危害牛、羊、兔和馬）皮膚表面的外寄生蟲，其成螨個(gè)體較疥螨大，肉眼可見，呈長(zhǎng)圓形，可引起家畜的癢螨病，參見附錄A.1.2。3.3牛足螨（Chorioptesbovis）和德州足螨（Chorioptestexanus）兩種寄生于家畜（主要危害牛、羊和馬）皮膚表面的外寄生蟲，其形態(tài)與癢螨相似，呈卵圓形，可引起家畜的足螨病，參見附錄A.1.3。3.4疥螨病（Sarcopticmange）由疥螨（Sarcoptesscabiei）寄生于家畜皮膚表皮內(nèi)引起相應(yīng)的臨床癥狀的外寄生蟲病。3.5癢螨?。≒soropticmange）由綿羊癢螨（Psoroptesovis）寄生于家畜皮膚表面引起相應(yīng)的臨床癥狀的外寄生蟲病。23.6足螨?。–horopticmange）由足螨屬（Chorioptes）的螨蟲（主要包括牛足螨和德州足螨）寄生于家畜皮膚表面引起相應(yīng)的臨床癥狀的外寄生蟲病。4診斷4.1流行特點(diǎn)4.1.1易感動(dòng)物疥螨主要危害牛（黃牛、牦牛和水牛）、羊（綿羊和山羊）、豬、兔和馬；綿羊癢螨主要危害牛（黃牛、牦牛和水牛）、羊（綿羊和山羊）、兔和馬，牛足螨和德州足螨主要危害牛（黃牛、奶牛、牦牛和水牛）、羊（綿羊和山羊）和馬。4.1.2傳染源與傳播途徑感染有疥螨科（Sarcoptidae）和癢螨科（Psoroptidae）螨蟲的動(dòng)物是傳染源，主要通過患病動(dòng)物和健康動(dòng)物的直接接觸而感染，其次可通過與被患病動(dòng)物的病原所污染的畜舍、畜欄、場(chǎng)地、各種飼養(yǎng)用具等間接接觸而感染，還可通過飼養(yǎng)員的衣服和手把螨蟲傳播給健康動(dòng)物。4.2臨床癥狀4.2.1疥螨病家畜疥螨病主要以劇癢，皮膚脫毛、增厚、彈性降低和畜體消瘦為主要臨床特征。家畜感染疥螨后，常因家畜種類差異及家畜機(jī)體免疫水平的不同，各種家畜的皮膚損傷及隨后的病程發(fā)展和臨床癥狀可表現(xiàn)出一定的差異（見附錄B）。4.2.2癢螨病家畜癢螨病主要以瘙癢、結(jié)痂、皮膚增厚和消瘦為主要臨床特征。家畜感染綿羊癢螨后，因宿主不同可表現(xiàn)出不同的臨床癥狀和皮膚損傷（見附錄C）。4.2.3足螨病家畜患足螨病后患處脫毛，皮膚發(fā)紅、增厚、發(fā)癢、結(jié)痂，特別是在家畜營(yíng)養(yǎng)狀況和養(yǎng)殖條件差時(shí)癥狀更加明顯。家畜感染足螨后，因家畜種類的不同其所表現(xiàn)的臨床癥狀也稍有差異（見附錄D）。4.3實(shí)驗(yàn)室檢查（見附錄E）4.3.1顯微鏡檢測(cè)采集的痂皮經(jīng)適當(dāng)?shù)奶幚砗箸R檢發(fā)現(xiàn)螨蟲蟲體和/或蟲卵。4.3.2血清學(xué)檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)家畜血清中IgG抗體陽(yáng)性。4.3.3分子生物學(xué)檢測(cè)3聚合式酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)到結(jié)痂中螨蟲的核酸。4.4結(jié)果判定4.4.1疑似患病動(dòng)物符合4.2.1或4.3.2陽(yáng)性判定為疑似疥螨?。环?.2.2或4.3.2陽(yáng)性判定為疑似癢螨?。环?.2.3陽(yáng)性判定為疑似足螨病。4.4.2確診患病動(dòng)物符合4.3.1或4.3.3陽(yáng)性判定疥螨病患病動(dòng)物；符合4.3.1陽(yáng)性判定癢螨病患病動(dòng)物；符合4.3.1陽(yáng)性判定足螨病患病動(dòng)物。5預(yù)防控制5.1患病家畜的防治5.1.1治療患病家畜使用殺螨藥物（阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、二嗪農(nóng)、巴胺磷、氰戊菊酯和雙甲脒等）進(jìn)行治療，肉用或乳用家畜使用殺螨藥物時(shí)要嚴(yán)格注意其休藥期。5.1.2環(huán)境的殺螨處理治療家畜的同時(shí)，還需要采用外用殺螨藥對(duì)圈養(yǎng)家畜籠舍及運(yùn)動(dòng)場(chǎng)等外環(huán)境進(jìn)行殺螨處理。5.1.3病死家畜的處理的發(fā)病死亡家畜要進(jìn)行嚴(yán)格的無害化處理，防止病原擴(kuò)散。5.2預(yù)防保持家畜廄舍（籠舍）清潔干燥、通風(fēng)、透光、不擁擠。放牧家畜定期用殺螨藥物進(jìn)行藥浴、投喂口服殺螨藥物或采用澆潑劑處理，定期用殺螨劑噴灑廄舍（籠舍）和飼養(yǎng)用具。對(duì)小型籠舍可用火焰殺螨處理。螨病的常發(fā)地區(qū)，定期對(duì)家畜進(jìn)行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)可疑家畜，立即隔離治療。新引進(jìn)的家畜，隔離觀察15～30天，確診無螨后方能合群。肉用或乳用家畜使用殺螨藥物進(jìn)行預(yù)防時(shí)要嚴(yán)格注意其休藥期。獸醫(yī)和飼養(yǎng)人員接觸患病家畜時(shí)應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的安全防護(hù)，預(yù)防人體感染。4（資料性）病原學(xué)A.1形態(tài)A.1.1疥螨（Sarcoptesscabiei）分類上屬于疥螨科（Sarcoptidae）的疥螨屬（Sarcoptes），為雌雄異體，蟲體可分為假頭和軀體兩部分，身體上有橫、斜的皺紋。假頭位于蟲體前端，短而寬，有一呈蹄鐵形的咀嚼式口器。蟲體背面前端有一幾丁質(zhì)胸甲，呈長(zhǎng)方形；末端正中有一肛門；兩側(cè)有對(duì)稱的剛毛；體表有大量的波狀皮紋、三角形鱗片、棒狀刺。蟲體腹面有4對(duì)粗短、呈圓錐形的足；前2對(duì)足向前伸，比后足長(zhǎng)，可從背面看見，位于蟲體前1/3；后2對(duì)足伸向后方，短，從背面不能見到，位于蟲體后1/3（見圖A.1、圖A.2）。雄螨：蟲體大小為200～300微米×150～200微米，第1、2、4對(duì)足上有吸盤，第3對(duì)足上僅有一根長(zhǎng)剛毛；生殖孔位于蟲體第4對(duì)足之間，周圍有呈倒“V”字形的幾丁質(zhì)構(gòu)造。雌螨：蟲體大小為300～500微米×250～400微米。第1、2對(duì)足上有吸盤，第3、4對(duì)足上各有一根長(zhǎng)剛毛；生殖孔（產(chǎn)卵孔）位于蟲體腹面中央，近末端有一陰道。圖A.1疥螨（成螨）背面觀圖A.2疥螨（成年雌螨）腹面觀A.1.2綿羊癢螨（Psoroptesovis）分類上屬于癢螨科（Psoroptidae）的癢螨屬（Psoroptes）的螨蟲，其成螨蟲體大小500～900微米×200~520微米，肉眼可見，蟲體可分為假頭和軀體兩部份。假頭位于蟲體前端，其基部背面后方無粗短垂直剛毛，由呈圓錐形的刺吸式口器，較長(zhǎng)。軀體背面表皮有細(xì)皺紋；蟲體透明的淡褐色角皮上有稀疏的剛毛和細(xì)皺紋。肛門位于軀體末端。足較長(zhǎng)，特別是前兩對(duì)足較后兩對(duì)足粗大。5雄螨：第1、2、3對(duì)足上有吸盤，吸盤位于分三節(jié)的柄上，第4對(duì)足特別短，無剛毛和吸盤。軀體末端有兩個(gè)大結(jié)節(jié)，上有長(zhǎng)剛毛數(shù)根；腹面后部有兩個(gè)吸盤；生殖器居于第4基節(jié)之間。雄螨有性吸盤和尾突（見圖A.3）。雌螨：第1、2、4對(duì)足上有吸盤，第3對(duì)足上各有兩根長(zhǎng)剛毛。軀體腹面前部有一個(gè)寬闊的生殖孔，后端有縱裂的陰道；軀體末端為肛門（見圖A.4）。圖A.3綿羊癢螨（雄螨）腹面觀圖A.4綿羊癢螨（雌螨）背面觀A.1.3足螨（Chorioptes）分類上屬于癢螨科（Psoroptidae）的足螨屬（Chorioptes）的螨蟲，其成螨體長(zhǎng)300微米～500微米，蟲體分為假頭和軀體兩個(gè)部分。假頭由背面的1對(duì)螯肢、1對(duì)須肢和1個(gè)口下板組成。蟲體體表有細(xì)紋；口器較短，呈錐形；足長(zhǎng)，跗節(jié)吸盤的柄短而不分節(jié)；肛門位于蟲體末端（見圖A.5）。雌螨：4對(duì)足，第1、2、4對(duì)足上有吸盤，第3對(duì)足上有剛毛。雄螨：4對(duì)足，第1、2、3、4對(duì)足上均有吸盤，第4對(duì)足極短，從背面不能被看見。生殖孔位于第3、4對(duì)足之間。體末端有2個(gè)結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)的前方腹面有1對(duì)環(huán)狀性吸盤，性吸盤上有剛毛。圖A.5足螨（雌螨）背面觀6（資料性）疥螨病臨床癥狀B.1牛皮膚病變常見于肩部、頸背部、尾根部、臀部、頭部及四肢，嚴(yán)重時(shí)可波及全身。B.2羊綿羊：始發(fā)于嘴唇四周、角兩側(cè)、鼻邊緣和耳根部，嚴(yán)重時(shí)蔓延至整個(gè)頭部及頸部，其中以頭部出現(xiàn)癥狀最明顯。病變部可形成堅(jiān)硬的灰白色痂皮，故俗稱“石灰頭”。山羊：多發(fā)生在被毛稀疏的皮膚，如嘴唇四周、眼圈、鼻梁和耳根部，嚴(yán)重時(shí)可蔓延到腋下、腹下和四肢曲面，甚至全身。病羊出現(xiàn)煩燥不安、劇癢，被毛脫落，病變部位逐步向四周延伸、擴(kuò)大，皮膚增厚，形成皺褶和龜裂。B.3豬各種年齡和品種的豬均可感染，臨床癥狀主要表現(xiàn)為兩種類型：皮膚過敏反應(yīng)型：常見于乳豬和保育豬，主要是由螨蟲引起的遲發(fā)型和速發(fā)型超敏反應(yīng)。常起始于眼周、頰部和耳根，后蔓延至背部、軀干兩側(cè)、后肢內(nèi)側(cè)及全身。病豬出現(xiàn)劇癢，到處摩擦或以蹄搔彈患部，至摩擦部出血，患部脫毛、結(jié)痂、皮膚增厚，形成皺褶和龜裂。皮膚角化過度型：又稱為慢性疥螨病，常見于經(jīng)產(chǎn)母豬、種公豬和成年豬。由于出現(xiàn)皮膚過度角質(zhì)化和結(jié)締組織增生，病豬皮膚變厚，形成大的皮膚皺褶、龜裂、脫毛，被毛粗糙多屑，常見成年豬耳廓內(nèi)側(cè)、頸部周圍、四肢下部，尤其是踝關(guān)節(jié)處形成灰色、松動(dòng)的厚痂，經(jīng)常用蹄搔癢或在墻壁、欄柵上摩擦皮膚，造成脫毛和皮膚損壞、開裂和出血。B.4兔皮膚病變常發(fā)于四肢，后蔓延至嘴及鼻周圍等處。B.5馬皮膚病變始發(fā)于頭部、體側(cè)、軀干及頸部，后蔓延至肩部、髻甲及全身。7（資料性）癢螨病臨床癥狀C.1牛黃牛、奶牛和牦牛：患牛臨床上皮損區(qū)皮膚發(fā)紅，皮損區(qū)出現(xiàn)淡黃色的結(jié)痂，中等感染病例出現(xiàn)鱗狀皮屑；皮損區(qū)多出現(xiàn)在尾根、背部和肩胛部，嚴(yán)重病例皮損區(qū)可蔓延到全身?；寂Ｆ姘W，常在木柱等物體上摩擦，或用舌舔吮患部，皮膚損傷，脫毛，滲出液凝固形成痂皮。皮膚增厚，失去彈性。水牛：水牛的癢螨病發(fā)病部位、臨床癥狀與黃牛、奶牛和牦牛的癢螨病相似，但形成的痂皮較薄，呈“油漆起爆”狀，痂皮薄似紙，表面平整，一端稍微翹起，另一端則與皮膚緊貼。若揭開痂皮，可見許多仍在爬動(dòng)的黃白色的螨蟲。C.2羊綿羊：初始發(fā)于背部和臀部，后很快地蔓延到體側(cè)。初期，患羊呈現(xiàn)輕度至中度瘙癢，表現(xiàn)為晃頭、后肢搔抓患部、在木柱、墻壁等處擦癢，皮損區(qū)形成結(jié)節(jié)，后形成淺黃色脂肪樣的痂皮；隨病程加重，瘙癢加劇，患羊體上的毛結(jié)成束或軀體下部泥濘不清潔，后零散的毛叢懸垂在羊體上，最后毛束逐漸地大片脫落，甚至全身脫光。病羊呈現(xiàn)貧血癥狀，高度營(yíng)養(yǎng)障礙，在寒冷季節(jié)，加上皮膚脫毛，可引起綿羊的大批死亡。山羊：多發(fā)生于耳殼內(nèi)面。病羊食欲不佳，常搖動(dòng)耳朵；病變部發(fā)癢，常在硬物上摩擦。患部形成硬而堅(jiān)實(shí)、緊貼皮膚的黃白色痂皮塊，炎癥常蔓延至外耳道。C.3兔兔患病時(shí)主要發(fā)生在外耳道內(nèi)，可引起猛烈的外耳道炎；盯聹過盛分泌，干涸成痂，厚厚地嵌在耳道內(nèi)如紙卷樣，甚至完全堵塞耳道；耳變重下垂；病變部發(fā)癢，病兔搖頭，搔耳；還可能延至篩骨及腦部，引起癲癇發(fā)作。C.4馬常發(fā)生于鬃部、鬣部、尾部、頜間部、股內(nèi)側(cè)及鼠蹊部?；疾可w有淺黃色脂肪樣的柔軟痂皮，容易剝離。鄰近的皮膚亦迅速脫毛。乘馬及挽馬常發(fā)生于裝置鞍具、頸套、鞍褥的部位。8（資料性）足螨病臨床癥狀D.1牛牛（黃牛、奶牛、牦牛和水牛）常初始發(fā)于尾根部和尾根部?jī)蓚?cè)的凹槽，皮損處覆蓋干燥的細(xì)白色鱗片，皮損區(qū)發(fā)癢，后皮損區(qū)可蔓延到會(huì)陰、大腿內(nèi)側(cè)，甚至蔓延到骶部和背部或乳房；嚴(yán)重病例，在皮損區(qū)呈現(xiàn)厚的結(jié)痂，瘙癢明顯。D.2羊綿羊：主要寄生于綿羊的蹄部及腿外側(cè)山羊：主要寄生于山羊的頸部、耳及尾根等處。D.3馬馬的足螨寄生于馬的肛周皺褶、后肢遠(yuǎn)端及尾部等處。9（規(guī)范性）實(shí)驗(yàn)室檢查E.1顯微鏡檢測(cè)E.1.1痂皮的采集E.1.1.1疥螨病痂皮的采集剪去患部和健康部皮膚交界處的毛后，采用經(jīng)火焰消毒后的小刀垂直于皮膚面用力刮取交界處痂皮，直至刮處皮膚微有出血痕跡，刮破處涂碘伏消毒，將刮取物收集到容器內(nèi)，待檢。E.1.1.2癢螨病與足螨病痂皮的采集用鑷子夾取患病部皮膚表面的痂皮或者用消毒小刀用力刮取患病部皮膚表面的痂皮，取痂皮處涂碘伏消毒，將痂皮收集到容器內(nèi)，待檢。E.1.2鏡檢E.1.2.1熱源發(fā)將E.1.1采集的痂皮放入平皿內(nèi)，將平皿放入25～37℃的恒溫箱中0.5～1h后，將平皿置于顯微鏡下檢查，若檢測(cè)到螨蟲和/或螨卵則判定為陽(yáng)性。E.1.2.2直接圖片檢查法將E.1.1采集的痂皮放置于載玻片上，滴加1滴5%甘油（丙三醇）水溶液，加蓋載玻片，搓壓玻片至病料散開，分開載片，加蓋片后置顯微鏡下檢查，若檢測(cè)到螨蟲和/或螨卵則判定為陽(yáng)性。E.1.2.3濃集法當(dāng)螨蟲數(shù)量較少時(shí)，可采用濃集法收集螨蟲鏡檢。將E.1.1刮取的較多痂皮放入10%氫氧化鈉溶液并浸泡過夜或加熱煮5min左右，待其溶液自然沉淀15min，取沉淀物鏡檢?；?qū)⑸鲜龀恋砦镛D(zhuǎn)入試管中，再加入60%硫代硫酸鈉溶液，試管口加蓋玻片，靜置5～10min后，取蓋玻片鏡檢。若鏡檢到螨蟲和/或螨卵則判定為陽(yáng)性。E.2血清學(xué)檢測(cè)E.2.1方法采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA）檢測(cè)待檢血清樣品中相應(yīng)螨蟲的IgG抗體。E.2.2操作方法E.2.2.1抗原制備E.2.2.1.1疥螨重組烯醇化酶蛋白（rSar-Eno）的制備采用RT-PCR方法從兔源疥螨cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增疥螨Sar-Eno基因，將目的片段連接到pET32a(+)載體，并經(jīng)公司測(cè)序核實(shí)序列正確后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，采用1.0mMIPTG37℃誘導(dǎo)8h后，采用SDS電泳驗(yàn)證表達(dá)情況（rSar-Eno約65kDa）。進(jìn)一步將正確表達(dá)的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，將菌液離心、超聲破碎、鎳柱純化、透析及超濾后，獲得純化后的疥螨重組烯醇化酶蛋白（rSar-Eno采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，分裝保存于-80℃?zhèn)溆?。E.2.2.1.2綿羊癢螨重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白（rPsoc27）的制備采用RT-PCR方法從綿羊癢螨cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增Psoc27基因，將目的片段連接到pET32a(+)載體，并經(jīng)公司測(cè)序核實(shí)序列正確后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21（DE3）的感受態(tài)細(xì)胞，采用1.0mMIPTG37℃誘導(dǎo)8h后，采用SDS電泳驗(yàn)證表達(dá)情況（rPsoc27約75kDa）。進(jìn)一步將正確表達(dá)的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，將菌液離心、超聲破碎、鎳柱純化、透析及超濾后，獲得純化后的綿羊癢螨重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白（rPsoc27采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，分裝保存于-80℃?zhèn)溆?。E.2.2.2抗原包被聚乙烯板用0.1M的碳酸鹽緩沖液（pH9.6）將E.2.2.1的抗原稀釋到最佳濃度（rSar-Eno14.5μg/mL，rPsoc2746.0μg/mL）后加入聚乙烯板，每孔100μL，4℃包被過夜。次日，棄孔內(nèi)液體，每孔加入PBST緩沖液（0.01MPBS+0.05%Tween-20,pH7.4）300μL，洗板3次，每次5min，拍干；E.2.2.3加封閉液每孔加5%脫脂奶粉（W/V，5g脫脂奶粉+100mLPBS）300μL，37℃封閉1.5h。棄孔內(nèi)液體，洗滌同E.2.2.2。E.2.2.4加待檢血清每孔加入用PBS緩沖液（0.01MPBS,pH7.4）稀釋的待檢血清100μL（rSar-Eno=1:640；rPsoc27=1:100每板同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性孔、標(biāo)準(zhǔn)陰性孔以及空白對(duì)照孔，分別加入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清以及稀釋液PBS作為對(duì)照。37℃溫育1h后，棄孔內(nèi)血清，洗滌同E.2.2.2。E.2.2.5加酶標(biāo)二抗用PBS緩沖液（0.01MPBS,pH7.4）將辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗稀釋至工作濃度，加入100μL，37℃溫育1h。棄孔內(nèi)液體，洗滌同E.2.2.2。E.2.2.6加底物顯色每孔加入底物TMB（3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺）溶液100μL，37℃避光溫育20min。E.2.2.7終止反應(yīng)每孔加入2M硫酸（H2SO4）50μL終止反應(yīng)，20min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果。E.2.3結(jié)果判定以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm的吸光值（OD值若陽(yáng)性對(duì)照OD值/陰性對(duì)照OD值的比例大于2.1,則實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。P為待檢血清孔OD值，N為陰性對(duì)照孔OD值，以P/N≥2.1判為陽(yáng)性，P/N<2.1判為陰性。E.3分子生物學(xué)檢查方法E.3.1方法采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，以線粒體COXI基因?yàn)榘谢?，?duì)螨蟲特異性DNA片段進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)。E.3.2操作方法E.3.2.1DNA的提取根據(jù)市售的微量基因組DNA提取試劑盒說明書分別提取附錄E.1.1.1痂皮和疥螨蟲體（事先在遇冷的研缽中加液氮研成粉末）的DNA，備用。E.3.2.2PCR擴(kuò)增擴(kuò)增總體積為25μL，包括PCRMixture12.5μL，待檢樣品DNA模板1.0μL，上、下游引物各1.0μL（10pmol/μL,引物序列5’-GTGTGGAACTGGTAGAGG-3’，5’-CAGATCAAGCAAAAAGAGTTAAG-3’滅菌蒸餾水加至25.0μL。同時(shí)設(shè)置疥螨DNA的陽(yáng)性對(duì)照組和設(shè)置滅菌蒸餾水的陰性對(duì)照組。擴(kuò)增條件如下：94°C預(yù)變性3min；94°C變性30s,54°C復(fù)性20s，72°C延伸20s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸8min；8℃儲(chǔ)存10min。產(chǎn)物預(yù)期大小為212bp。E.3.2.3結(jié)果判定取6μLPCR產(chǎn)物（包括待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照）及5μLDNA標(biāo)準(zhǔn)Marker，加入1.8%瓊脂糖凝膠板的孔內(nèi)（含Goldview核酸染料），經(jīng)5V/cm電泳，電泳20min，于紫外凝膠成像儀或凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立條件：當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)212bp擴(kuò)增條帶，空白對(duì)照未出現(xiàn)目的條帶。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立的情況下，待檢樣品出現(xiàn)預(yù)期大?。?12bp）條帶即為陽(yáng)性（見圖E.1）。圖E.1PCR方法標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果若需要進(jìn)一步確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果，可將電泳檢測(cè)呈陽(yáng)性的PCR剩余產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序，疥螨COXI基因參考序列（212bp）為：GTGTGGAACTGGTAGAGGAACTGGCTGAACTATTTATCCTCCTTTATCTAGAATCACTTATCATTCAAATATGTCTGTAGATTTTACAATTGTAAGATTACATATTGCTGGAATTTCTTCTATTTTAAGTTCTATCAATTTTATTGTAACTATTTATAATATAAAAATAAAAGGAATAAGATGATCAAACTTAACTCTTTTTGCTTGATCTG參考文獻(xiàn)[1]郝桂英,楊光友,賴松家,等.兔螨凈等3種殺蟲藥物對(duì)離體兔癢螨的殺滅試驗(yàn).中國(guó)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