基因工程乙肝疫苗的制備

基因工程乙肝疫苗的制備【摘要】基因工程乙肝疫苗是通過構(gòu)建含有乙肝表面抗原的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞，制備乙肝病毒表面的有效蛋白。本文主要介紹基因工程疫苗--重組酵母乙肝疫苗制備的基本原理和工藝流程，以及乙肝疫苗的純度分析方法?！娟P(guān)鍵詞】乙肝疫苗重組質(zhì)粒工藝流程1.基因工程乙肝疫苗產(chǎn)生背景疫苗是人類目前可以徹底消滅某一疾病的唯一武器，接種疫苗被認(rèn)為是最有效、最經(jīng)濟(jì)的疾病預(yù)防手段。《發(fā)展中國家消滅乙型肝炎免疫接種計(jì)劃實(shí)施指南》中指出：“世界上四分之三的人口生活在中或高乙肝流行區(qū)，因此，唯一的策略就是有效地減少乙肝的流行，最終消滅乙肝······”世界衛(wèi)生組織肝炎專家及計(jì)劃免疫全球咨詢組認(rèn)為：控制全球乙型肝炎及減少死亡的策略是開展大規(guī)模的嬰兒及學(xué)齡前兒童的乙肝疫苗接種。我國衛(wèi)生部制定的目標(biāo)是從92年開始在全國逐步推行乙型肝炎（HB）計(jì)劃免疫。92年全國共生產(chǎn)血源疫苗1500萬人份，尚不能滿足新生兒接種需要，如考慮其他人群，缺口更大。為了實(shí)現(xiàn)HB計(jì)劃目標(biāo)，進(jìn)一步為控制全球HB做出貢獻(xiàn)，我們必須大規(guī)模提高HB疫苗的產(chǎn)量和進(jìn)一步提高質(zhì)量。血源HB疫苗原料為無癥狀帶毒者的HBsAg陽性血漿。血源價(jià)格昂貴，供應(yīng)量有限，采集困難。因此血源疫苗的產(chǎn)量和成本受到原料的限制。利用基因工程重組微生物細(xì)胞表達(dá)HBsAg生產(chǎn)HB疫苗的技術(shù)，原料易得，價(jià)廉，適宜進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，有可能大幅度降低成本。2.使用重組酵母的原因和重組酵母構(gòu)建2.1使用重組酵母的原因使用重組酵母進(jìn)行乙肝疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，有如下幾點(diǎn)原因：（1）.酵母對培養(yǎng)基的要求低，價(jià)廉易得。（2）.酵母細(xì)胞生長快，故生產(chǎn)率高。（3）.動物細(xì)胞生長慢，容易染菌，對操作要求嚴(yán)。（4）.酵母系統(tǒng)容易放大，動物細(xì)胞系統(tǒng)放大難。2.2重組酵母構(gòu)建HBV只有3200bp，為雙鏈的DNA,是一個(gè)相當(dāng)小的病毒。其基因組共有四個(gè)ORF，編碼以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白（L、M、S）。故重組酵母可用以下方法：目的基因分離目的基因分離重組質(zhì)粒的構(gòu)建（切，接）導(dǎo)入酵母細(xì)胞（轉(zhuǎn)）培養(yǎng)酵母細(xì)胞（增）檢測正確表達(dá)目的產(chǎn)物的酵母（檢）（1）.根據(jù)已經(jīng)測定的編碼乙肝病毒表面抗原決定簇基因序列，用化學(xué)合成法直接合成目的基因或者通過鳥槍法克隆目的基因。用識別相同黏性末端的限制性內(nèi)切酶將外源DNA和質(zhì)粒分子切開。（切）（2）.用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段連接到質(zhì)粒分子上，構(gòu)成DNA重組分子。（接）（3）.借組細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入酵母細(xì)胞內(nèi)。（轉(zhuǎn)）（4）.短時(shí)間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，以擴(kuò)增DNA重組分子。（增）（5）.篩選和鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的酵母細(xì)胞，獲得外源基因高效表達(dá)的基因工程菌。（檢）3.酵母表達(dá)的HBsAg之特性重組酵母表達(dá)的HBsAg在沒有化學(xué)處理的條件下自發(fā)地構(gòu)成平均直徑為22nm的球形顆粒。這些顆粒含有未糖基化的HBsAg多肽和主要由酵母特有的磷脂構(gòu)成的脂基。其氨基酸的構(gòu)成、羥基和氨基酸末端序列分析、質(zhì)譜儀分析的肽譜等表明，重組酵母忠實(shí)地表達(dá)和生產(chǎn)了HBsAg。酵母生產(chǎn)的HBsAg在細(xì)胞內(nèi)以顆粒形式存在，其中的亞單位通過非共價(jià)鍵不緊密地結(jié)合在一起。在細(xì)胞外它轉(zhuǎn)變成第二種形式，即單個(gè)多肽通過二硫鍵結(jié)合成二聚體，最后二聚體之間形成二硫鍵，得到二硫鍵交聯(lián)的顆粒。它在表觀上、化學(xué)性質(zhì)和免疫性等方面都與血源HBsAg類似。HBsAg比大部分生物分子要大，但比細(xì)胞要小，很適宜用膜分離方法純化。HBsAg表現(xiàn)出很強(qiáng)的疏水性，可用硫酸銨或聚乙二醇進(jìn)行分步沉淀，或用疏水層析純化。HBsAg含有大量的二硫鍵，是其對熱穩(wěn)定的主要原因。在制備血源疫苗時(shí)，可運(yùn)用長時(shí)間保溫法以滅活HBV。但在制備重組HBsAg時(shí)沒有必要?？蛇x用更加溫和的條件。HBsAg對蛋白酶的抵抗力很強(qiáng)，可在pH為2的時(shí)候耐胰蛋白酶的處理。HBsAg因其脂含量高，密度比一般蛋白低。利用其密度特性，可進(jìn)行梯度離心分離。4.疫苗的工作原理任何疾病的疫苗都遵循以下免疫原理：（1）.將疫苗注射到人體內(nèi)，疫苗通常含有已經(jīng)死亡或者弱化的病毒。而乙肝疫苗就是一類沒有感染能力的病毒蛋白，能引起機(jī)體的特異性反應(yīng)。（2）.免疫系統(tǒng)識別出體內(nèi)的外來物質(zhì)（病毒和細(xì)菌），這些外來物質(zhì)也被稱之為抗原。（3）.一旦發(fā)現(xiàn)抗原，免疫系統(tǒng)就分泌出被稱為抗體的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)在血液中流動，將抗原殺死以消滅身體感染的病毒（或者與病毒蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，使之失去生物活性）?？贵w是由淋巴細(xì)胞制造的。這些細(xì)胞也被稱為B細(xì)胞，它的主要功能是產(chǎn)生能夠特異性與抗原結(jié)合的抗體。（4）.人體會儲存這些抗體，淋巴細(xì)胞也會有記憶這種特殊抗原的功能。所以再次染病時(shí)，它們會及時(shí)消滅此種疾病的病毒，然而抗體的針對性很強(qiáng)，所以曾經(jīng)接種過乙肝疫苗的人，面對其他疾病時(shí)仍舊會感染（值得注意的是：當(dāng)人體感染真正的病毒時(shí)，抗體會不停繁殖，直到病毒最終被消滅。而疫苗會提供數(shù)量恰到好處的抗原，以幫助人體完成識別病毒和免疫反應(yīng)的過程，從而使人