基因重組和基因工程總結(jié)-貽宏

DNA的重組同源性重組為在兩個同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。左邊為片段重組體（切開的鏈與原來斷裂的鏈?zhǔn)峭粭l）右邊為拼接重組體E.coli的同源重組RecA蛋白攜帶單鏈DNA對雙鏈DNA的入侵RecBCD復(fù)合物負(fù)責(zé)切開雙鏈和對雙鏈進(jìn)行解旋，有內(nèi)切酶和外切酶和解旋酶的活性，都需要ATP.還需要DNA連接酶，和RuvC內(nèi)切酶進(jìn)行中間體的切割。一旦RecBCD識別出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便發(fā)生變化，其3’→5’外切酶活性受到抑制，5’→3’外切酶活性被激活，由原來優(yōu)先降解3’末端鏈，改變?yōu)橹唤到?’末端鏈。RecBCD酶活性變化的結(jié)果是產(chǎn)生3’末端帶有Chi位點的ssDNA。分支遷移由結(jié)合在Holliday分支點上的RuvA和RuvB蛋白催化。RuvA以四聚體的形式識別并結(jié)合到Holliday分支點上。RuvB蛋白為催化分支遷移的解旋酶.特異位點重組1λ噬菌體DNA的整合通過整合酶識別其與大腸桿菌的重組位點內(nèi)的相同序列。整合十分高效。反轉(zhuǎn)錄病毒的整合酶則將LTR（內(nèi)含增強子和啟動子）整合到宿主。hin基因編碼倒位酶hix（為反向重復(fù)序列）為特異性的重組位點，這個地方一重組，應(yīng)該會導(dǎo)致第一個啟動子激活，引起hin基因的表達(dá)，表達(dá)的產(chǎn)物又連到hix位點上，在輔助因子Fis的作用下，h片段倒位。（h片段位于2個hix之間，所以是hix先倒，再倒H片段）磷酸鈣轉(zhuǎn)染其原理是借助形成一種DNA-磷酸鈣沉淀物，使其粘附于細(xì)胞表面，通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用而使DNA被細(xì)胞捕獲。DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染DEAE-葡聚糖是陽離子多聚物，它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取，用DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染成功地應(yīng)用于瞬時表達(dá)的研究，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不是十分可靠。電穿孔是功能強大的將核酸、蛋白及其它分子導(dǎo)入多種細(xì)胞的高效技術(shù)。通過高強度的電場作用，瞬時提高細(xì)胞膜的通透性，從而吸收周圍介質(zhì)中的外源分子。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射與原核相比，多了真核調(diào)控序列，主要是增強子還有真核起始序列還有不是所有整合表達(dá)載體都有整合序列。還有多了polyA加尾信號，真核細(xì)胞藥物抗性基因。單一的黏端連接易產(chǎn)生載體自連和多拷貝現(xiàn)象和DNA片段的反向插入。這時用兩種限制性內(nèi)切酶分別切割載體和目的DNA，形成兩個不同的黏性末端就可以避免這種情況的發(fā)生，實現(xiàn)定向克隆。α-互補篩選β糖苷酶要在兩個片段都存在的情況下才有活性，當(dāng)外源基因插入，α片段基因完整性破壞，表達(dá)失敗，所以無法分解底物，使其在IPTG存在的情況下，變成藍(lán)色，故顯白色。重組技術(shù)應(yīng)用根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識疾病的分子機制。制備單抗和生長因子等?；蛑委熡糜谥委焼位虿『椭匕Y聯(lián)合免疫缺陷和帕金森病等?；蛟\斷Southern印記雜交用于診斷基因缺陷Northern印記雜交用于檢測mRNA篩選重組DNA的方法1利用標(biāo)記補救篩選2抗生素標(biāo)記基因3利用插入失活和插入表達(dá)、互補篩選4利用噬菌體的包裝特性5限制性內(nèi)切酶加電泳法6PCR法7