ctDNA分析技術及各瘤種ctDNA檢測建議

2022年ctDNA分析技術及各瘤種ctDNA檢測實用建議（全文）為了就ctDNA檢測的部分非標準化流程及臨床的潛在應用達成共識，歐洲腫瘤學會（ESMO）精準醫(yī)學工作組召集領域內(nèi)專家審查了相關研究數(shù)據(jù)并最終給出了相關建議。專家小組審查了解釋陽性或陰性結果時循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測技術需要考慮的因素，以及ctDNA檢測用于不同階段腫瘤患者的研究證據(jù)，并給出一般性建議和針對相關腫瘤的建議。ctDNA檢測技術血漿DNA主要源于細胞死亡、細胞凋亡和壞死，其他生物學過程也可能有所貢獻。在癌癥患者中，血漿DNA的不同片段可能來源于腫瘤一一ctDNA。從理論上講，ctDNA代表了許多不同腫瘤亞克隆釋放的DNA混合物，可代表特定腫瘤的異質性，因此可以更好地“描述”腫瘤的基因組圖譜。ctDNA具有多種潛在的臨床應用，包括用于篩查、描述早期疾病特征、局部治療后分子殘留病灶（MRD）的檢測、預測復發(fā)、晚期腫瘤患者的分子分型、療效的早期評估、治療應答監(jiān)測和耐藥機制的檢測或鑒定（圖1）。Early，陽!ges 巨日怖needdlsesseEarly，陽!ges 巨日怖needdlsesseScrwiirq 阪cu￡|i時ml Mdeciiar MoieaiirAdipirre-OnTin-keralaMamkM叫AcQjiiBdman油fing infkkjddiseaserda^sfl adjuvantpji-loTnrapv/rMpmsimstin?nwttlmhg血聞酣 Ene咿gtffliRBiandn?hrr*<h<iMUagmsiOdntfftlocal FoE，闡 Frtoww?incai$母珂］iwra?E側me雌 衲附 血咐圖1ctDNA的潛在臨床應用在腫瘤患者中，ctDNA片段因腫瘤特征而異，包括腫瘤部位、疾病負擔、增殖和凋亡率、壞死程度、炎癥、腫瘤微環(huán)境以及宿主相關現(xiàn)象。ctDNA檢測成功的關鍵在于選擇合適的ctDNA分析類型來解決特定的科學和臨床問題。目前，沒有適合所有應用場景的單一ctDNA檢測方法。例如，在早期疾病檢測或MRD分析時，可能需要對有限的ctDNA進行超靈敏分析（例如甲基化分析或患者特異性測序分析），而在轉移性患者中，檢測治療耐藥相關突變或腫瘤遺傳異質性時，需要使用不同的檢測方法。ctDNA分析前的相關變量ctDNA分析需要了解可能影響特定臨床環(huán)境中結果的準確性和可重復性的分析前變量和分析參數(shù)。主要的分析前變量包括影響ctDNA釋放的患者特異性因素、樣本量、收集管、儲存條件和治療方案等?；颊咛禺愋砸蛩匕ㄉ頎顩r（例如劇烈運動）、炎癥以及急性和慢性醫(yī)學狀態(tài)。ctDNA水平可能會受到化療、靶向治療、免疫治療、放療等的影響，可分為兩個階段：由相關治療對腫瘤細胞和正常細胞造成的直接影響引起的急性變化（數(shù)天至數(shù)周）；與治療導致腫瘤縮小相關的長期動態(tài)學變化（數(shù)周至數(shù)月）。因此，應根據(jù)科學問題和臨床背景謹慎計劃血漿采集的時間。假陰性結果此外，多種因素可能導致ctDNA的假陰性或假陽性結果。臨床上，許多患者雖然處于晚期疾病階段，但ctDNA水平可能較低，導致檢測不到ctDNA突變。不同類型突變的檢測靈敏度也不同。不同技術對于單核苷酸突變的檢測能力不同于結構變異（例如融合）或拷貝數(shù)變異（例如拷貝數(shù)擴增）。基于組織的檢測中，RNA為基礎的分析用于基因融合或剪接體變異逐漸增加，而ctDNA分析檢測這類變異的敏感性卻較低。血漿中的ctDNA濃度也與腫瘤分期和體積相關。因此，ctDNA結果的解釋需要考慮到ctDNA的含量可能不足以檢測到特定的變異類型。假陽性結果血漿DNA主要來源于凋亡的造血細胞，這些細胞中的克隆擴增有可能導致ctDNA假陽性結果，而且這種風險很容易隨時間變化而改變。不確定潛能的克隆性造血（CHIP）隨著年齡、既往全身治療、吸煙而發(fā)生頻率增加。CHIP中的基因突變部分可與實體瘤驅動基因突變重合。這種假陽性可通過白細胞DNA測序在很大程度上排除。ctDNA分析技術因素的相關推薦：應根據(jù)臨床問題仔細選擇用于ctDNA分析的血液取樣時間。不同的因素會影響ctDNA的釋放（例如正在接受的治療、并發(fā)炎癥、手術）。手術后檢測MRD，理想情況下應在手術后至少1周取樣；對于愈合時間較長的大手術，可能需要2周或更長時間。對于晚期腫瘤患者的基因分型，在有應答的積極治療期間或非進展期腫瘤中應避免采血，以盡量減少假陰性結果。應謹慎選擇收集血液樣本的采集管，取決于至治療時間（time-to-processing）和使用的檢測方法。如果DNA提取前需儲存血漿，應長期儲存于-80°C，應保持最小溫度變化，應盡可能減少連續(xù)凍融。假陰性（實際存在于腫瘤中但未檢測出感興趣的突變）是ctDNA檢測的重要問題之一，可能原因是血漿樣本DNA水平低、檢測靈敏度不足或未從腫瘤中“脫落”。對于涉及含有CHIP變異的基因突變，ctDNA檢測分析時，CHIP是常見假陽性原因。對于腫瘤抑制基因（例如DNA修復基因）臨床可及的檢測，推薦對血漿DNA和WBCDNA進行同步分析。對于此類檢測，建議從血漿ctDNA檢測患者中常規(guī)采集血沉棕黃層（富含WBC），以便在必要時有可用樣本檢測以排除CHIP。腫瘤易感基因中的致病性胚系突變（例如BRCA1、BRCA2、PALB2）可在ctDNA中檢測到，此類變異的檢測需要使用經(jīng)過驗證的測定法進行反復驗證，以確認體細胞突變或胚系突變的特征。未來，臨床基因分型分析應適用于評估腫瘤純度，以允許對未檢測到的結果進行可靠預測，并允許可靠的真陰性預測。CtDNA檢測潛在的臨床適應證ctDNA檢測臨床有效性的證據(jù)水平使經(jīng)過驗證且足夠靈敏的ctDNA檢測可用于晚期疾病基因分型的常規(guī)實踐。該建議適用于單核苷酸突變，和小的插入和缺失突變的檢測。該建議得到來自肺癌、膽管癌、乳腺癌、胃腸道腫瘤和其他瘤種的前瞻性研究證據(jù)的支持一一使用液體活檢指導治療可產(chǎn)生類似的療效。晚期腫瘤患者基因分型腫瘤特異性推薦表結語液體活檢，尤其是ctDNA檢測，已越來越多地用于臨床實踐。目前已有足夠證據(jù)支持，基因分型用于指導晚期癌癥的治療決策的臨床實用性，液體活檢可作為腫瘤組織檢測的可替代方案，特別是在組織活檢不可行或時間不允許的情況下尤為重要。臨床應用中必須考慮不完全敏感性，特別是ctDNA對基因融合和拷貝數(shù)異常的敏感性較低。應進一步開發(fā)新技術以有力地區(qū)分“真”與“假”陽性或陰性結果，這是未來先進基因分型檢測的主要優(yōu)勢。CHIP產(chǎn)生“假”陽性結果是ctDNA基因分型分析的明顯弱點。理論上，ctDNA檢測對比組織檢測可更準確地捕獲腫瘤異質性，但仍需要開展大型臨床試驗以評估這種