探討IL-17中和在自發(fā)性腦出血患者神經(jīng)功能和神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的作用

探討IL-17中和在自發(fā)性腦出血患者神經(jīng)功能和神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的作用目的自發(fā)性腦出血(sICH)是一系列嚴(yán)重的高起病率、高致死、致殘率的腦血管事件。在實(shí)驗(yàn)動物模型和細(xì)胞水平上，最新研究發(fā)現(xiàn)IL-17細(xì)胞因子與sICH的發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切。此次研究的目的主要是闡明IL-17對sICH患者的在神經(jīng)功能的臨床價(jià)值和作用機(jī)制。方法我們對45例重度腦出血患者以及45例正常健康人的血清IL-17水平進(jìn)行動態(tài)的檢測，我們采用建立完善的臨床量表對自發(fā)性腦出血病人的神經(jīng)功能損傷程度和神經(jīng)功能恢復(fù)的狀況進(jìn)行詳細(xì)評估并打分。分別對不同分組的實(shí)驗(yàn)小鼠的神經(jīng)功能損傷進(jìn)行詳細(xì)的分析和評價(jià)。在此同時(shí)，建立細(xì)胞再生體系/共培養(yǎng)體系，根據(jù)組成成分不同將其分成三組，第一組是NSC培養(yǎng)體系,第二組是NSC+TCRγδ細(xì)胞組，第三組是NSC+TCRγδ細(xì)胞+IL-17中和組。最后我們通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)儀器測試了NSCs（神經(jīng)干細(xì)胞）分化、nestin(巢蛋白)、GFAP（膠質(zhì)纖維酸性蛋白）和MAP2（成熟神經(jīng)元特異性標(biāo)志物）的細(xì)胞存活率和不同的生物標(biāo)志物。結(jié)果sICH患者血清中的IL-17水平含量與自發(fā)性腦出血病人神經(jīng)功能恢復(fù)相互之間呈顯著負(fù)相關(guān)，(p<0.001)。在細(xì)胞水平研究中，結(jié)果表明在細(xì)胞培養(yǎng)/共同培養(yǎng)體系中，IL-17中和可能會促進(jìn)NSC的生存能力，這種NSC的生存能力將受到TCRγδ+共培養(yǎng)體系的影響(p=0.031)，TCRγδ細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下NSCs存活率明顯降低(p=0.023)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，研究結(jié)果認(rèn)為IL-17中和提高NSC定向分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，而不是定向分化神經(jīng)元細(xì)胞。結(jié)論IL-17作為一種促進(jìn)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，這種細(xì)胞因子具有非常強(qiáng)烈的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用，這種神經(jīng)細(xì)胞毒性作用顯著影響著sICH患者的神經(jīng)功能恢復(fù)狀況?？赡苁怯捎贗L-17促炎因子抑制了NSC向功能神經(jīng)細(xì)胞的分化從而影響病人預(yù)后的功能恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)研究得出IL-17中和的功能會削弱IL-17促炎因子抑制作用，IL-17中和不僅可以加強(qiáng)NSCs的定向分化水平，并且可以顯著的促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。關(guān)鍵詞腦內(nèi)出血；神經(jīng)干細(xì)胞；白介素17；中和；定向分化AbstractObjectiveToinvestigatetheeffectofIL-17onneuralfunctionandneuralstemcelldifferentiationinpatientswithspontaneousintracerebralhemorrhageObjectivespontaneousintracerebralhemorrhage(sich)isaseriesofseverecerebrovasculareventswithhighmorbidity,mortalityanddisability.attheexperimentalanimalmodelandcelllevel,recentstudieshavefoundthatil-17cytokinesarecloselyrelatedtothepathogenesisofsich.theaimofthisstudywasmainlytoelucidatetheclinicalvalueandmechanismofil-17inneurofunctioninpatientswithsich.Methodsweperformedadynamictestofserumil-17levelsin45patientswithsevereintracerebralhemorrhageandin45normalandhealthypatients.weusedawell-establishedclinicalscaletoevaluatethedegreeofneurologicalimpairmentandneurologicalrecoveryinpatientswithspontaneousintracerebralhemorrhageindetailandrated.Theneurologicaldamageofdifferentgroupsofexperimentalmicewasanalyzedandevaluatedindetail.Atthesametime,thecellregenerationsystem/co-culturesystemwasestablished,whichwasdividedintothreegroupsaccordingtothecomposition,thefirstgroupwasNSCculturesystem,thesecondgroupwasNSCTCR\947;δcellgroup,thethirdgroupwasNSCTCil-17neutralizationgroupinr\947;δcells.finally,wetestedthecellviabilityanddifferentbiomarkersofnscs(neuralstemcells)differentiation,nestin(nestin),gfap(glialfibroacidprotein),andmap2(matureneuron-specificmarker)throughrelevantexperimentalinstruments.ResultTherewasasignificantnegativecorrelationbetweenserumIL-17levelsinsICHpatientsandneurologicalrecoveryinpatientswithspontaneousintracerebralhemorrhage(p<0.001).theresultssuggestthatIL-17neutralizationmaypromoteNSCviabilityincellculture/co-culturesystems,whichwillbeaffectedbyTCRγδco-culturesystems(p=0.031).ThesurvivalrateofNSCswassignificantlydecreased(p=0.023)underco-cultureofTCR\947;δcells.theresultssuggestthatIL-17neutralizationenhancesdirectionaldifferentiationintoastrocytesratherthandirecteddifferentiationofneurons.ConclusionsIL-17asacytokinepromotinginflammatoryresponse,thiscytokinehasaverystrongneurocytotoxiceffect,whichsignificantlyaffectstheneurologicalrecoverystatusofsICHpatients.probablybecauseIL-17proinflammatoryfactorsinhibitthedifferentiationofNSCtofunctionalnervecellsandthusaffectthefunctionalrecoveryofpatientprognosis.TheIL-17neutralizingfunctioncanweakenIL-17pro-inflammatoryfactorinhibition,IL-17neutralizingcannotonlystrengthentheNSCsdifferentiationlevel,butalsopromotetherecoveryofnervefunction.[Keywords]Intracerebralhemorrhage;neuralstemcells;interleukin17;neutralization;directionaldifferentiation探討IL-17中和在自發(fā)性腦出血患者神經(jīng)功能和神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的作用1前言自發(fā)性腦出血(sICH)是一系列嚴(yán)重的高起病率、高致死、致殘率的腦出血疾病的統(tǒng)稱，一般由非創(chuàng)傷或者先天疾病因素導(dǎo)致，如高齡、高血壓、血清膽固醇水平低、飲酒、顱腦血管畸形和吸煙及醫(yī)源性用藥等甚至不明原因。在中國這種病人的數(shù)量約占所有中風(fēng)病人數(shù)量的8%-15%，全世界范圍內(nèi)，在一些發(fā)展中國家如非洲或亞洲國家中自發(fā)性腦出血患者占中風(fēng)病人的比重更高，而且往往導(dǎo)致意想不到的壞結(jié)果，自發(fā)性腦出血患者一個(gè)月的死亡率大約占30%-55%，它往往導(dǎo)致較高的致殘率及致死率，同時(shí)不幸的是超過30%的存活者遺留神經(jīng)功能缺損[1,2]。近幾十年來，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，為了達(dá)到更好的治療效果，如今醫(yī)療技術(shù)手段和治療措施也在不斷進(jìn)步并且高超的技術(shù)和手段得到大規(guī)模推廣和應(yīng)用，目前全國范圍內(nèi)出現(xiàn)了大型的醫(yī)療機(jī)構(gòu)急救中心，目的給了更快捷搶救病人，但是僅能有限的挽救生命或提高病患的生存率，在外科手術(shù)治療方面，比如各種精細(xì)操作的開顱手術(shù)清除血腫，講究顯微操作小骨窗，起到了極少損壞責(zé)任血管或神經(jīng)，但是經(jīng)過人類共同的努力，目前仍缺乏有效的治療方案和措施來降低sICH患者的致殘及死亡率或改善腦出血患者的預(yù)后。尤其是那些從病理分類中的腦出血急性期幸存下來的患者，雖然生命保住了，可能會引發(fā)長期的認(rèn)知及肢體活動功能障礙，這些預(yù)后不良的患者所帶來的治療和術(shù)后康復(fù)治療費(fèi)用，顯然會加重家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，與此同時(shí)，每況愈下的生活質(zhì)量也給病人和家屬帶來心里壓力和精神負(fù)擔(dān)[3]，因此為了挽救一個(gè)家庭，必須研究一種新的方法降低病死率成為醫(yī)學(xué)界攻克的當(dāng)務(wù)之急。一般情況下，sICH患者起病后患者通常會經(jīng)歷兩個(gè)病理生理過程:第一個(gè)過程是原發(fā)性腦損傷，繼而發(fā)生繼發(fā)性腦損傷。原發(fā)性腦損傷通常在出血后的最初幾分鐘內(nèi)發(fā)生。因?yàn)樽园l(fā)性腦出血患者短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)大的血腫在這個(gè)階段扮演者重要的角色[4]，并且血腫量的大小和出血時(shí)間直接影響腦出血患者的預(yù)后效果包括認(rèn)知及肢體活動功能，相比較而言，自發(fā)性腦出血患者出血時(shí)間越短，顱內(nèi)血腫量越小，往往患者預(yù)后越理想，深究其原因，我們認(rèn)為一定時(shí)間內(nèi)的血腫增加量是導(dǎo)致sICH患者顱內(nèi)壓增高的最重要原因，血腫和顱內(nèi)壓關(guān)系可成正相關(guān)，隨著單位時(shí)間內(nèi)血腫腔的出血量增多，從而使得顱內(nèi)壓隨之越高，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)壓增高是島之間sICH患者死亡的重要原因。MacLaughlin等［5］和Yuan等［6］在大量的研究中得出結(jié)論均顯示顱內(nèi)壓檢測儀，在臨床治療中監(jiān)測患者顱內(nèi)壓，根據(jù)顱內(nèi)壓的大小的變化，調(diào)整脫水劑的使用量降低患者院內(nèi)病死率起到了關(guān)鍵性作用。一般常見顱內(nèi)壓增高的因素有多種，其中小腦出血最常見的是由小腦占位性病變所致，隨著時(shí)間變化，單位時(shí)間內(nèi)血腫出血量的增加導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高，造成患者意識上逐漸神智昏迷，最終患者死亡的原因可能是因?yàn)檎泶罂尊薜男纬?，相比于其他部位，如基底?jié)出血，前者更容易致一定的致殘率和致死率［7-8］。從病理學(xué)角度分析，以動脈壁發(fā)生病理生理改變?yōu)榛A(chǔ),一般的血流動力學(xué)變化或其它誘因即可引起血管破裂,此時(shí)血液從血管內(nèi)溢出就引發(fā)了臨床上常見疾病-自發(fā)性腦出血,自發(fā)性腦出血會導(dǎo)致正常腦組織及細(xì)胞損傷，形成一定空間的占位效應(yīng)，當(dāng)單位時(shí)間內(nèi)出血量迅速增加,就會導(dǎo)致其穿破了腦實(shí)質(zhì),繼而引發(fā)一系列的病癥，如腦室/蛛網(wǎng)膜下腔出血,若腦出血量增多形成積血可以引起腦室被阻塞或腦表面被壓迫，因此腦脊液循環(huán)受到影響。同理其占位效應(yīng)和腦脊液循環(huán)受阻導(dǎo)致顱內(nèi)壓隨之升高,等顱高壓到一定程度導(dǎo)致腦疝的發(fā)生，而固有顱內(nèi)壓的大小、腦出血伴發(fā)的損害、出血的速度和量對顱內(nèi)壓增高程度起著關(guān)鍵作用。腦出血時(shí)，在血流動力學(xué)壓力和血腫壓力趨于平衡、血管痙攣、凝血機(jī)制三者的共同參與下,大約30min左右出血會停止,大約6小時(shí)左右血腫不再擴(kuò)大（頭顱CT檢查所示）。顱內(nèi)壓增高除引起導(dǎo)致腦疝的發(fā)生外，還可以直接損傷腦細(xì)胞以及使腦血管功能發(fā)生變化，例如使毛細(xì)血管和小靜脈受壓,導(dǎo)致小靜脈壓升高、通透性增加,最終血漿滲出發(fā)生組織水腫。一般在出血6小時(shí)左右頭顱CT觀察可見腦組織水腫,水腫在3-4天時(shí)達(dá)到高峰。腦血管功能發(fā)生變化亦可發(fā)生于小動脈,此時(shí)小動脈出現(xiàn)不同程度的狹窄,引起腦組織發(fā)生缺血缺氧性改變,從而加重組織損傷。小動脈功能改變所引起的腦組織缺血缺氧性損傷隨著顱內(nèi)壓升高以及持續(xù)時(shí)間延長而逐漸加重,與病灶距離越遠(yuǎn)的腦組織損傷越輕。然而，由于腦出血(STICH)的外科手術(shù)治療并未能提供充足并具有說服力的證據(jù)來顯示出早期手術(shù)切除血腫的療效[9]，所以研究者們的目光轉(zhuǎn)移到了對繼發(fā)性腦損傷的研究上來，以探索自發(fā)性腦出血的發(fā)病機(jī)制和治療原則及策略為研究重中之重。sICH產(chǎn)生的繼發(fā)性腦損傷可能的原因是由于腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血液的存在而觸發(fā)一系列的連鎖反應(yīng)，自發(fā)性腦出血后的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)主要表現(xiàn)為各種活化的炎癥細(xì)胞的積聚。這些反應(yīng)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，包括趨化因子、細(xì)胞因子、蛋白酶和其他促炎分子。進(jìn)而激活細(xì)胞毒性、興奮性、氧化性和炎性途徑等[10-12]。由于血腦屏障(blood-brainbarrier,BBB)通常在sICH發(fā)病后被中斷，在外周循環(huán)中的中性粒細(xì)胞和各種免疫細(xì)胞趁機(jī)在被破壞后的血腦屏障中逐漸浸潤到大腦組織中去，相應(yīng)引發(fā)腦內(nèi)各種細(xì)胞產(chǎn)生一系列的連鎖性炎癥反應(yīng)。因此，自發(fā)性腦出血患者局部的一系列的炎癥反應(yīng)通常起關(guān)鍵作用，并與sICH的病理過程和患者功能恢復(fù)有密切聯(lián)系[13,14]。在sICH患者所有治療方案中，在有時(shí)效性的臨床前試驗(yàn)中，證實(shí)NSCs移植具有良好的治療預(yù)后效果，試驗(yàn)證實(shí)NSCs移植可以有效地促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)育，從而改善腦卒中動物的神經(jīng)功能缺陷，神經(jīng)干細(xì)胞移植，它的特點(diǎn)是具有較強(qiáng)的自我更新和多向分化的能力，因此在sICH患者中把NSCs移植作為一種潛在的治療策略[15]。然而，NSCs的作用機(jī)制，特別是NSCs如何定向分化為某些特定的功能神經(jīng)細(xì)胞，截止到目前臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中仍未得到明確的答案，NSCs如何分化的機(jī)制一直是臨床應(yīng)用中需要及時(shí)解決的關(guān)鍵問題。由于sICH患者局部性和全身性發(fā)生著復(fù)雜的病理生理性及綜合病變的改變，炎癥相關(guān)的微環(huán)境與NSCs的分化可能相互作用，進(jìn)而進(jìn)一步影響患者神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)[16,17]。一些白介素家族的細(xì)胞因子，包括IL-1β,IL-6,IL-8andIL-10，我們對這些細(xì)胞因子的發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)行了深入的探索[18]。最近研究表明IL-17，一種從TCRγδ細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，研究結(jié)果證實(shí)IL-17這種細(xì)胞因子在動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c中風(fēng)的發(fā)病機(jī)理密切的關(guān)聯(lián)[19、20]。除此之外，基于當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證明IL-17中和在應(yīng)用于某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有顯著的治療效果[17]。然而，IL-17在sICH發(fā)病機(jī)制中神經(jīng)功能恢復(fù)中的臨床價(jià)值和作用機(jī)制一直是尚待解決的謎團(tuán)。在本研究中，我們將首先探討IL-17在sICH患者中的臨床價(jià)值，同時(shí)也繼續(xù)深入探討IL-17在體內(nèi)發(fā)病機(jī)制及體外神經(jīng)發(fā)生中的潛在的影響及作用。研究方案本課題的研究分為兩部分第一部分：首先采集重度自發(fā)性腦出血患者以及正常健康人血清標(biāo)本，然后對人體血清中IL-17水平進(jìn)行動態(tài)的檢測，通過檢測自發(fā)性腦出血以及健康人群中血清IL-17含量變化來比較兩者之間的差異性，并且采用相對應(yīng)的臨床量表（包括GCS評分量表及GOS評分量表）對sICH病人的神經(jīng)功能損傷程度以及神經(jīng)功能恢復(fù)的狀況進(jìn)行詳細(xì)評估。第二部分：從細(xì)胞水平，建立細(xì)胞模型分組，第一組是NSCs培養(yǎng)體系，第二組是NSCs+TCRγδ細(xì)胞培養(yǎng)體系，第三組是nsc+TCRγδ細(xì)胞+IL-17中和培養(yǎng)體系，檢測時(shí)間分別在24h-72h內(nèi)每隔24h測一次，運(yùn)用蛋白免疫印跡技術(shù)，ELISA檢測和CCK-8檢測TCRγδ細(xì)胞及IL-17單抗于神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)對IL-17表達(dá)影響，來探討血清IL-17細(xì)胞因子水平與臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)性，2材料與方法2.1臨床資料我們收集樣本的來源是從2017年1月至2018年3月份期間，從安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科并且所有患者均在癥狀出現(xiàn)后4小時(shí)內(nèi)就診于我院急診科治療的45例重度自發(fā)性腦出血患者，以及45例地域、年齡、性別相匹配的健康對照組，所有對照組都是從我院門診體檢中心篩選的健康人群，實(shí)驗(yàn)組及對照組之間的種族、地域、年齡、性別等人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所有這些患者均符合各種腦血管病診斷關(guān)鍵要點(diǎn)所述的ICH診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：1、頭顱CT（computedtomography）或者頭顱MRI（MagneticResonanceImaging）提示顱內(nèi)出血；2、至少3名5年以上從醫(yī)經(jīng)歷的副主任醫(yī)師診斷為出血性腦卒中；3、收縮壓<180mmHg，舒張壓<110mmHg。自發(fā)性腦出血的排除標(biāo)準(zhǔn)：1）因其他原因（經(jīng)過全腦血管造影或腦血管成像檢查等篩選化為不明原因）引起的腦內(nèi)出血，2）由車禍或高處墜落傷導(dǎo)致的外傷性顱內(nèi)血腫等外傷性的腦內(nèi)出血性疾??；3）患者本身有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、比如嚴(yán)重慢性心肺功能疾病，循環(huán)和呼吸功能不穩(wěn)定的患者24h內(nèi)導(dǎo)致死亡、腎衰竭在透析過程的患者e、特發(fā)性血小板減少癥患者、血友病患者等；4）由長期服用影響血凝機(jī)制的藥物導(dǎo)致的腦內(nèi)出血；比如長期服用三七、華法令房顫患者、長期服用阿司匹林凝血機(jī)制不良患者；5）患者既往有惡性腫瘤或良性腫瘤，行顱內(nèi)腫瘤切除術(shù)后或自發(fā)性腦出血術(shù)后引發(fā)術(shù)區(qū)再次出血的患者等；6）患者有神經(jīng)系統(tǒng)性疾??；健康組剔除標(biāo)準(zhǔn)；1）患有嚴(yán)重的免疫系統(tǒng)性疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重意識障礙等。2)患者有中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的疾病等。納入原則：調(diào)查人員通過設(shè)計(jì)流行病學(xué)調(diào)查表進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，并詳細(xì)記錄所有納入實(shí)驗(yàn)的患者樣本臨床流行病學(xué)資料，納入的信息一般包含（性別及年齡）家族史、食物習(xí)慣、抽煙情況、長期高血脂情況、是否有飲酒情況、用藥史（抗凝藥物、抗血小板聚集藥物）、長期的血壓控制不佳、長期血糖控制不佳、顱內(nèi)出血血腫大小、部位（位于幕上還是幕下）、血腫邊緣距離皮層的多少、血腫壓迫各腦室及腦池程度、中線移位程度、腦出血是否破入腦室、是否形成腦積水等。全部流行病學(xué)資料統(tǒng)計(jì)是由專職培訓(xùn)人員進(jìn)行記錄及匯總，目的保證資料的可靠性及完整性，參與本研究的自發(fā)性腦出血患者均提前告知其被納入實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，所有患者和對照組均獲得患者或家屬知情同意。所有涉及人類參與研究的臨床驗(yàn)證執(zhí)行的程序均經(jīng)中國安徽醫(yī)科大學(xué)臨床研究倫理委員會批準(zhǔn)，且符合機(jī)構(gòu)和國家的道德標(biāo)準(zhǔn)，并且按照《赫爾辛基原則宣言》開展進(jìn)行的。納入人群處理事項(xiàng)：這些樣本收集的時(shí)間是從2017年1月至2018年3月份。并且所有患者均在癥狀出現(xiàn)后4小時(shí)內(nèi)入院。然后在入院時(shí)（第1天、第3天、第7天和第14天）通過連續(xù)收集患者靜脈血清樣本。按照同樣的收集方法，我們從對照組中收集健康人群靜脈血清樣本進(jìn)行健康檢查。所有血清樣本需要通過專業(yè)操作者操作離心機(jī)分層后抽取上層淡黃色血清樣本放入抗凝試管中，特別注意，所有經(jīng)分離處理后患者的血清樣本均儲存于-80℃。為了避免血清蛋白含量被降解，因此采集后所有患者血清樣本盡量防止反復(fù)凍融，與此同時(shí)，我們采用格拉斯哥昏迷評分(GCS)對每位患者入院時(shí)的神經(jīng)損傷程度進(jìn)行評估并打分，入院后第14天的患者恢復(fù)情況我們采用格拉斯哥預(yù)后評分(GOS)對進(jìn)行評估打分。兩名以上10年以上從醫(yī)經(jīng)歷的臨床副主任醫(yī)師采用盲法的方案對患者進(jìn)行評估打分并取平均值。人血清采集處理方法：實(shí)驗(yàn)采用的真空采血管是含有EDTA抗凝劑，患者前臂靜脈通常被選為穿刺部位進(jìn)行采集樣本，一般抽取前臂淺靜脈血標(biāo)本容量為5-10ml左右，采集完畢后小心輕放抗凝管，避免紅細(xì)胞破裂溶解，用ELISA試驗(yàn)方法來檢測人血清和不同共培養(yǎng)細(xì)胞組的IL-17細(xì)胞因子的水平。2.2細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)方法：試劑選擇除另有說明外，所有試驗(yàn)當(dāng)中所需的試劑均為商業(yè)獲得并嚴(yán)格按照規(guī)定使用。小鼠NSC系(NE-4C)來自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海，中國)?？贵w老鼠IL-17A中和抗體都是從BD生物科學(xué)公司購買(美國CA)?？剐∈驡FAP抗體、抗小鼠MAP2抗體和抗小鼠nestin一抗WesternBlotting(蛋白印跡法)檢測的主要抗體都是統(tǒng)一購自伊萊瑞特公司(武漢，中國)。用于人類和小鼠IL-17A檢測的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自瑞博奧公司(GA,美國)。CCK-8試劑盒購自美國西格瑪公司。共培養(yǎng)體系1.細(xì)胞模型分組第一組是NSCs培養(yǎng)體系，第二組是NSCs+TCRγδ細(xì)胞培養(yǎng)體系，第三組是nsc+TCRγδ細(xì)胞+IL-17中和培養(yǎng)體系，檢測時(shí)間分別在24h-72h內(nèi)每隔24h測一次第一組是NSCs培養(yǎng)體系小鼠神經(jīng)干細(xì)胞NE-4C細(xì)胞系的常規(guī)培養(yǎng)首先強(qiáng)調(diào)的是整個(gè)無菌操作都應(yīng)該在酒精燈的周圍，將細(xì)胞培養(yǎng)將小鼠神經(jīng)干細(xì)胞冷凍后的NE-4C細(xì)胞立即在37℃水浴中進(jìn)行預(yù)處理，目的是將其緩慢解凍。然后將NE-4C細(xì)胞放置在容量為2ml，含有1%抗青霉素-鏈霉素雙抗體，1%谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，10%熱滅活胎牛血清(FBS)的杜爾貝克改良的eagle培養(yǎng)基(DMEM)，置于37℃、5%CO2、時(shí)間控制在20分鐘，相對濕度為95%的適宜條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別經(jīng)過將細(xì)胞復(fù)蘇及換液后，傳代培養(yǎng)于無菌培養(yǎng)瓶中（比例為1：2或1：3），加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。第二組是NSCs+TCRγδ細(xì)胞培養(yǎng)體系，細(xì)胞樣本的制備：工作人員將生長狀態(tài)良好的小鼠NE-4C細(xì)胞接種于多聚賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)板，待NE-4C細(xì)胞完全貼壁后；正常對照組常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組按照NE-4C：γδT=1:5的比例加入γδT細(xì)胞共培養(yǎng)24h。其中抗IL-17單抗組同時(shí)加入2ug/mlIL-17抗體共同孵育24h。收集細(xì)胞上清液進(jìn)行后續(xù)ELISA檢測第三組是nsc+TCRγδ細(xì)胞+IL-17中和培養(yǎng)體系，用濃度為2μg/ml的中和抗il-17單克隆抗體添加到nsc+TCRγδ細(xì)胞培養(yǎng)體系中，然后將這些細(xì)胞在培養(yǎng)基中共培養(yǎng)24小時(shí)。2.ELISA檢測TCRγδ細(xì)胞及IL-17單抗于神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)對IL-17表達(dá)影響2.1主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：胰蛋白酶、MEM培養(yǎng)基、FBS、PBS、青霉素、鏈霉素電熱壓力蒸汽消毒器（YXQ-LS-100A）、超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-15AC-SC）、白細(xì)胞介素17（IL-17）ELISA試劑盒、高速臺式離心機(jī)(TG16-WS) 、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板光學(xué)顯微(OLYMPUSCK-40)、倒置顯微鏡（OLYMPUS)2.2本實(shí)驗(yàn)原理：依據(jù)雙抗體夾心法應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析技術(shù)檢測小鼠樣本中白介素-17（IL-17）的水平。其中96孔板含有純化的小鼠IL-17抗體，此為本試劑盒的固相抗體，依次往含有IL-17單抗的孔內(nèi)加入適宜的小鼠IL-17，最后結(jié)合被HRP標(biāo)記的IL-17抗體，形成了抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，也就是我們常說的“雙抗體夾心”法的由來。酶標(biāo)板加樣本反應(yīng)后，經(jīng)洗板后加顯色底物TMB。顯色底物TMB經(jīng)酶（HRP）的催化作用后可發(fā)生顏色反應(yīng)，相應(yīng)的轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸性條件下轉(zhuǎn)化成黃色的最終色。根據(jù)顏色的深淺和樣品中的小鼠白細(xì)胞介素-17呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀測定酶標(biāo)孔各孔OD450吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得公式計(jì)算出樣本的中IL-17的水平。2.3ELISA檢測步驟2.3.1樣本收集處理細(xì)胞分組培養(yǎng)后，用吸管收集細(xì)胞上清液于離心管中（無菌）,將離心管放入離心機(jī)中離心20min（轉(zhuǎn)速：3000轉(zhuǎn)/分），吸管吸取離心后的上清液以備后續(xù)ELISA檢測。2.3.2ELISA檢測1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)板上選擇好標(biāo)準(zhǔn)品孔（10孔），在第1、第2孔中均加入標(biāo)準(zhǔn)品100μl、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液一半濃度，移液槍吹打混勻。然后從第1孔、第2孔中已經(jīng)混勻的液體用移液槍分別取100μl，加入到第3孔和第4孔中同樣的進(jìn)行吹打混勻；于第3孔和第4孔中每孔棄去50μl孔內(nèi)液體，然后再從3、4孔各吸取50μl液體分別加到第5與第6孔內(nèi)，參照以前步驟混勻后以此類推，最后從第九第十孔中各取50μl棄掉。2.加樣：先設(shè)立空白孔(調(diào)零用)，其中空白對照孔既不加待測樣本也不加標(biāo)準(zhǔn)品，然后于每個(gè)樣品孔內(nèi)加入相應(yīng)的樣本。將50μl待測樣本（每孔）加入到酶標(biāo)包被板中的待測樣品孔中。加樣時(shí)要注意將樣品加于酶標(biāo)板中孔的底部，輕輕晃動或用移液槍進(jìn)行吹打混勻，切忌觸到酶標(biāo)板孔壁。3.溫育：用封板膜封板后，在37℃溫度下進(jìn)行溫育三十分鐘反應(yīng)。4.配液：按說明書推薦比例，用蒸餾水稀釋20×濃縮洗滌液，備用。5.洗滌：溫育完成后將封板膜小心揭去，棄去酶標(biāo)板內(nèi)液體，輕輕甩干后，每孔加滿稀釋好的洗滌液洗板，靜置30s左右棄去洗滌液，重復(fù)操作洗板5次，最后輕輕拍干酶標(biāo)板孔內(nèi)的液體。6.加酶：96孔酶標(biāo)板中每孔加入50μl酶標(biāo)試劑（空白孔不加）。7.再次進(jìn)行上述溫育及洗滌步驟。9.顯色：每孔均加入顯色劑A&B50μl：50μl，通過輕微震蕩混合均勻后在37℃條件下避光反應(yīng)15分鐘進(jìn)行顯色。10.終止：將50μl終止液加入各孔內(nèi)使反應(yīng)停止（此時(shí)藍(lán)色立即變?yōu)辄S色）。11.測定：以空白孔為基準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)零后，在酶標(biāo)儀上讀出各孔在450nm波長處的吸光度值（OD450值）。注意加入終止液后15分鐘以內(nèi)應(yīng)盡快上酶標(biāo)儀進(jìn)行測量OD450值。2.4計(jì)算方法在坐標(biāo)紙上畫出橫坐標(biāo)（標(biāo)準(zhǔn)品的濃度）和縱坐標(biāo)（標(biāo)準(zhǔn)品OD值），得出所需的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此為據(jù)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將酶標(biāo)儀所測得的各孔樣本OD值代入方程式，計(jì)算出所求樣本的濃度（須乘以稀釋倍數(shù)）。3.用CCK-8檢測TCRγδ細(xì)胞及IL-17單抗與皮層神經(jīng)元共培養(yǎng)對神經(jīng)干細(xì)胞存活影響3.1基本原理CCK-8試劑盒（CellCountingKit）最重要的材料是WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽），此檢測方法應(yīng)用非常廣泛，例如可以用于快速檢測腫瘤細(xì)胞藥敏試驗(yàn)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性、藥物篩選以及細(xì)胞因子活性檢測等。本試劑盒工作原理可概括為在電子耦合劑環(huán)境下，線粒體內(nèi)的脫氫酶促使WST-8經(jīng)過還原反應(yīng)生成橙黃色并且具有水溶性的產(chǎn)物。此反應(yīng)產(chǎn)生的橙黃色深淺也代表著細(xì)胞的增殖程度，并與之呈正比，但是與所反映的細(xì)胞毒性成反比。細(xì)胞數(shù)量可以用酶標(biāo)儀測定的OD450值來間接表示。物品準(zhǔn)備：首先研究人員備好實(shí)驗(yàn)相關(guān)器材及用具：電熱壓力蒸汽消毒器、超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、低速臺式離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀、移液器細(xì)胞計(jì)數(shù)板、MEM培養(yǎng)基胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液（100X）、胰蛋白酶、PBS、CCK-8試劑盒3.2操作步驟1細(xì)胞培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞NE-4C培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)基中（含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗，1%Glutamax，1%Non-essentialAminoAcids）進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃、5％CO2、相對濕度為100%。經(jīng)過傳代后留待CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測分析。2CCK-8檢測于96孔板中接種100μL已經(jīng)計(jì)數(shù)調(diào)整濃度（調(diào)整濃度為1×105/mL）的樣本，每個(gè)稀釋倍數(shù)的細(xì)胞樣本設(shè)置三個(gè)復(fù)孔以減少誤差。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）培養(yǎng)96孔板中細(xì)胞樣本，設(shè)置的培養(yǎng)時(shí)間分別為24、48、72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每孔加入10μLCCK-8工作溶液，切忌往96孔板加液時(shí)不要產(chǎn)生氣泡，否則嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。并置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4h。3活力計(jì)算測定目標(biāo)計(jì)算公式細(xì)胞增殖/毒性活力（%）[A(實(shí)驗(yàn)組)-A（空白組）]/[A（對照組）-A（空白組）]×100%細(xì)胞抑制率（%）[A（對照組）-A(實(shí)驗(yàn)組)]/A（對照組）=1-細(xì)胞活力注：①A（實(shí)驗(yàn)組）：具有經(jīng)過處理的細(xì)胞、CCK溶液的吸光度值；②A（空白組）：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度值；③A（對照組）：具有未經(jīng)過處理的細(xì)胞、CCK溶液的吸光度值。4.免疫印跡分析檢測γδTT細(xì)胞及IL-17單抗與皮層神經(jīng)元共培養(yǎng)對神經(jīng)干細(xì)胞分化影響蛋白免疫印跡(WesternBlot)的具體原理是將組織細(xì)胞所有的蛋白分子大小不同，通過電泳可以將不同大小的蛋白分離開后，然后將凝膠上電泳分離的蛋白通過電流在轉(zhuǎn)膜液中轉(zhuǎn)移到NC膜或者PVDF膜上，由于抗原抗體可以特異性結(jié)合，用特異性抗體的方式就可以識別檢測某特定抗原（即目的蛋白）。WesternBlot作為一種蛋白質(zhì)檢測分析的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，抗體的作用可以理解為“探針”，通過“探針”檢測識別特異的蛋白質(zhì)。而最終識別結(jié)果是通過用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗來進(jìn)行顯色識別?？乖D(zhuǎn)移到固相載體（NC膜或者PVDF膜）上形成蛋白質(zhì)或多肽，與其特異的一抗發(fā)生反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，接下來一抗再與辣根過氧化物酶或者也可能是同位素標(biāo)記的二抗發(fā)生免疫反應(yīng)結(jié)合，最終經(jīng)過底物顯色或放射自顯影反應(yīng)來檢測電泳分離的特異性目的基因所表達(dá)的目的蛋白。目前在抗體活性的研究檢測、蛋白水平的表達(dá)、以及某些疾病的早期診斷等領(lǐng)域均可見到WesternBlot的應(yīng)用。WB操作步驟1.總蛋白提取1.1細(xì)胞裂解首先進(jìn)行總蛋白質(zhì)的提取，在提取過程中可以先進(jìn)行細(xì)胞裂解具體步驟是將裂解后的細(xì)胞將貼到壁細(xì)胞，然后丟棄培養(yǎng)基，用PBS進(jìn)行第一次清洗。再者針對懸浮細(xì)胞，具體操作是先收集所需細(xì)胞置于低溫離心機(jī)進(jìn)行離心后，用PBS緩沖液再次進(jìn)行清洗，向細(xì)胞中加入RIPA裂解液（比例：每106個(gè)細(xì)胞加0.1mLRIPAbuffer），同時(shí)要特別注意的是使得裂解液和細(xì)胞充分的接觸，可以在冰上動作輕柔的用槍頭吹打細(xì)胞液使得裂解液和細(xì)胞充分的接觸達(dá)到細(xì)胞充分裂解的目的。再輕輕傾斜培養(yǎng)皿使裂解產(chǎn)物順利的流向另外一邊，然后將裂解的細(xì)胞產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至離心管（1.5mL）前需通過培養(yǎng)皿輕輕傾斜促進(jìn)裂解產(chǎn)物順利的流向另外一邊以便進(jìn)行轉(zhuǎn)移，維持在30秒，以轉(zhuǎn)速12000rpm進(jìn)行大幅度的振蕩，在4oC低溫離心機(jī)離心15min，轉(zhuǎn)移離心后離心管內(nèi)液體的上清液，以備進(jìn)行后續(xù)的WesternBlot操作,1.2蛋白濃度測定（BCA測蛋白濃度）以及工作液的配制進(jìn)行電泳前需先按照實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行BCA測蛋白濃度測定，測定前首先配制好BCA法工作液（比例ReagentA：BCAReagentB=100：1）。用BCA來測蛋白濃度，至關(guān)重要的一步是進(jìn)行BSA標(biāo)準(zhǔn)品的配制以求得標(biāo)準(zhǔn)曲線。（1）稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取120μLBSA標(biāo)準(zhǔn)品(2mg/mL)，加入1080μL稀釋液后充分混合配置成標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（0.2mg/mL）。（2）配制各標(biāo)準(zhǔn)孔內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品溶液（見下表）。采用PBS緩沖液稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測的樣本。0.2mg/mLBSAStandard(uL)稀釋液（uL）BSA終濃度（ug/mL）40002003001001502002001001003005040360202038010103905040001.3BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備同理實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要的一步是BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，具體步驟為，在微孔板中分別加入已經(jīng)稀釋的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液100μL/孔，采取每個(gè)濃度都要設(shè)置二個(gè)復(fù)孔以減少誤差，然后同樣的在微孔板中上述加入標(biāo)準(zhǔn)品的孔內(nèi)分別加入100uL已配置好的BCA工作液，立即進(jìn)行混勻并且在37℃水浴槽中反應(yīng)60分鐘，時(shí)間到后取出微孔板冷卻至室溫，選定波長在562nm處并應(yīng)用分光光度計(jì)測定時(shí)微孔板各孔的吸光度值。注意關(guān)于測量數(shù)值，可以選擇使用1mL比色皿，用雙蒸水調(diào)零。檢測完畢所有樣品盡量控制在20min內(nèi)，得出數(shù)值后，將分光光度計(jì)測得的各孔BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液的OD562值減去空白孔OD562值進(jìn)行調(diào)零后，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測細(xì)胞樣本與BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液同時(shí)進(jìn)行測定OD562值，最后依據(jù)所得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出待測細(xì)胞樣本總的蛋白濃度。1.4SDS－PAGE電泳再進(jìn)行最關(guān)鍵的一部分SDS垂直電泳，詳細(xì)步驟如下：選擇潔凈、干燥且與制膠架配套的長短玻璃板，看好正反面對齊后按照正確方向插入制膠架中卡緊，然后垂直卡在制膠架子上準(zhǔn)備灌膠（預(yù)先加入生理鹽水確認(rèn)制膠架契合嚴(yán)密不漏膠），按比例配制出8%，10%分離膠，加入TEMED后立即輕柔搖勻混合，馬上將配好的分離膠灌入兩塊玻璃板間，加至適量高度（在綠線附近即可），注意動作緩慢輕柔避免產(chǎn)生氣泡及膠漏出，最后加入雙蒸水起到隔絕空氣加快膠凝固以及壓膠的作用，說明膠已凝成功的標(biāo)志是水和膠之間有一條折射線，水和膠之間有一條折射線后要再等3分鐘左右，就可傾斜制膠架倒去膠上的雙蒸水并用濾紙將雙蒸水盡量吸干，然后再根據(jù)比例配制出濃度為5％的濃縮膠，加入TEMED后輕柔搖勻混合即可灌膠，馬上將將梳子插進(jìn)灌好的濃縮膠中，待濃縮膠凝固后，取出含膠的玻璃板置于電泳夾中卡緊（注意玻璃板正反順序）后放入電泳槽內(nèi)。取出按BCA法計(jì)算所得蛋白濃度配制的上樣樣品，與5×SDS上樣緩沖液配比后混合并在沸水中高溫煮5min使蛋白變性。按每泳道等量蛋白上樣原則進(jìn)行上樣后，向電泳槽內(nèi)加入適量電泳液，正確連接電源后選擇濃縮膠80V壓縮條帶，等溴酚藍(lán)指示條帶壓縮成一條直線后，轉(zhuǎn)換電壓至120V將目的蛋白條帶跑開，待溴酚藍(lán)跑至膠板底部剛好沒有跑出時(shí)，可關(guān)閉電源，取出夾子將夾子打開使黑的一面保持水平向下，并在黑色夾子一面放上海綿墊→濾紙→含有目的蛋白的凝膠→已被甲醇激活的PVDF膜→濾紙→海綿墊，然后將槽內(nèi)的電泳液倒去并改為加入轉(zhuǎn)膜液，正確連接電源后選擇恒流200mA，轉(zhuǎn)膜約1～3小時(shí)終止。越大的蛋白轉(zhuǎn)膜時(shí)所用的時(shí)間也越長，這是根據(jù)蛋白分子量的大小來判定的，可控時(shí)間范圍內(nèi)目的蛋白都則會轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。2.接下來取下夾子取出膜，并用剪刀或鉛筆標(biāo)記住正反面，用配好的TBST溶液搖床上清洗1分鐘，然后配制5%脫脂牛奶作為封閉液室溫封閉PVDF膜2小時(shí)左右。一抗應(yīng)用5%脫脂牛奶封閉液進(jìn)行稀釋成一定的濃度（比例大約稀釋到1：500），然后將PVDF膜與稀釋好的相應(yīng)一抗反應(yīng)，條件為4℃孵育過夜，二抗反應(yīng)選擇室溫孵育1.5h左右。用TBST洗3次×5min/次。用封閉液將二抗按一定比例稀釋（比例大約稀釋到1：1000），二抗反應(yīng)選擇室溫孵育1.5h左右。再重復(fù)用TBST在搖床上清洗4次×5min/次，將ECL發(fā)光液按A液：B液等比例配比并混勻，均勻滴加在整片PVDF膜上反應(yīng)2min，最后在曝光儀上進(jìn)行曝光檢測。利用Tanon1600R成像系統(tǒng)(TanonTechnologyCo.Ltd,Shanghai,China)對蛋白條帶進(jìn)行可視化捕獲。每個(gè)波段的光密度是量化使用ImageJ軟件(貝塞斯達(dá)國立衛(wèi)生研究院,醫(yī)學(xué)博士,美國)和歸一化β-actin強(qiáng)度。2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析選擇SPSS19.0對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究所有列舉的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行分析。采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行二元數(shù)據(jù)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果圖1所示sICH患者血清IL-17細(xì)胞因子水平的動態(tài)變化Figure1.DynamicchangesofserumIL-17levelinsICHpatients圖2入院時(shí)GCS和第14天GOS的血清IL-17水平的相關(guān)性分析Figure2.CorrelationanalysisofserumIL-17levelwithGCSatadmissionandwithGOSatday143.1sICH患者血清IL-17水平升高并神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)系SICH患者血清中的IL-17水平在第3天明顯升高，IL-17水平含量與神經(jīng)損傷和功能恢復(fù)密切相關(guān)，我們?yōu)榱颂接慖L-17與sICH病理過程的臨床價(jià)值以及關(guān)系，因此在不同時(shí)間點(diǎn)動態(tài)檢測人血清IL-17水平。結(jié)果顯示，與健康對照組相比，SICH患者血清IL-17水平明顯升高，在第3天達(dá)到峰值，隨后下降到一個(gè)相對較高的水平(如圖1所示)。與此同時(shí)，我們分別使用GCS和GOS對血清中的IL-17水平與神經(jīng)功能損傷及恢復(fù)進(jìn)行相關(guān)性分析。分析結(jié)果表明患者入院時(shí)血清中的IL-17水平與GCS顯示負(fù)相關(guān)性(相關(guān)效率r2=-0.211，p=0.105)，而入院第14天患者血清中的IL-17水平與GOS呈顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)效率r2=-0.498，p<0.001)。(如圖2所示)圖3不同細(xì)胞培養(yǎng)/共培養(yǎng)組間IL-17濃度檢測。Figure3DetectionofIL-17concentrationsindifferentcellculture/co-culturegroups圖4不同細(xì)胞培養(yǎng)/共培養(yǎng)組間的細(xì)胞活力測試。Fig.4Cellviabilitytestbetweendifferentcellculture/coculturegroups3.2IL-17中和可以消除IL-17對NSCs生存活力的不良影響首先，我們測試了抗IL-17單克隆抗體是否能有效中和功能性IL-17濃度，在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中IL-17這種細(xì)胞因子主要是由TCRγδ細(xì)胞分泌的，我們通過ELISA這種染色方法來檢測IL-17細(xì)胞因子的水平含量(圖3所示)。最終根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明；抗IL-17單克隆抗體可以有效的抑制TCRγδ細(xì)胞分泌IL-17這種細(xì)胞因子。然后我們研究人員用CCK-8這種試劑來檢測這三個(gè)實(shí)驗(yàn)小組間72小時(shí)內(nèi)的NSCs存活率。根據(jù)結(jié)果顯示；TCRγδ細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下NSCs存活率明顯降低(p=0.023)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，換句話說，TCRγδ細(xì)胞可以分泌IL-17細(xì)胞因子，而IL-17細(xì)胞因子可以降低NSCs生存率。然而，相比，nsc+TCRγδ共培養(yǎng)細(xì)胞組中，我們得出的結(jié)論是；IL-17中和可能改善nsc生存能力，并且可以增加了nsc生存能力及數(shù)量，(p=0.031)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(圖4所示)。圖5Westernblotting凝膠圖像(d)顯示nestin(a)、GFAP(b)和MAP2(c)在不同細(xì)胞培養(yǎng)/共培養(yǎng)組中的表達(dá)。Figure5Westernblottinggelimage(d)showstheexpressionofnestin(a),GFAP(b)andMAP2(c)indifferentcellculture/coculturegroups3.3TCRγδ細(xì)胞分泌IL-17和IL-17中和可以促進(jìn)NSCs細(xì)胞分化作用本節(jié)主要介紹通過Nestin、MAP2和GFAP這三種蛋白，來評估IL-17細(xì)胞因子和IL-17中和對這三組實(shí)驗(yàn)中的NSCs分化的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們得出；相比對照組（nsc細(xì)胞培養(yǎng)組）來說，nsc+TCRγδ共培養(yǎng)細(xì)胞組中的巢蛋白（Nestin）的表達(dá)是明顯呈上升趨勢，而且根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)中得出p<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，相比nsc+TCRγδ培養(yǎng)細(xì)胞群中來說，巢蛋白在nsc+TCRγδ+IL-17中和培養(yǎng)細(xì)胞組的表達(dá)是明顯呈下降趨勢，(p=0.002)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果顯示，我們不難發(fā)現(xiàn)相比對照組來講，GFAP這種蛋白在nsc+TCRγδ共培養(yǎng)細(xì)胞組中表達(dá)是明顯呈下降趨勢(p=0.003)，然而，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組中加入IL-17中和后，GFAP這種蛋白的表達(dá)是呈上升趨勢的，(p=0.015，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也就是說IL-17中和可以有效的抑制TCRγδ細(xì)胞分泌IL-17，當(dāng)IL-17減少時(shí)，炎癥細(xì)胞因子跟著下降，反而相對應(yīng)的GFAP蛋白表達(dá)明顯上升。我們根據(jù)MAP2蛋白表達(dá)的所產(chǎn)生的效果顯示,我們實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在nsc+TCRγδ共培養(yǎng)細(xì)胞組中，MAP2蛋白表達(dá)明顯呈下降趨勢。然而，我們并沒有發(fā)現(xiàn)的是在nsc+TCRγδ培養(yǎng)細(xì)胞組和nsc+TCRγδ+IL-17中和培養(yǎng)細(xì)胞組，MAP2蛋白在2組實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.098)，也就是說MAP2蛋白在nsc+TCRγδ培養(yǎng)細(xì)胞組和nsc+TCRγδ+IL-17中和培養(yǎng)細(xì)胞組表達(dá)是沒有區(qū)別的(如圖5所示)。4討論綜上所述，經(jīng)過查閱大量現(xiàn)有文獻(xiàn)可知，NSCs是一類具有自我更新替代能力并具有多能性的細(xì)胞群，同時(shí)NSCs具有可以分化為若干細(xì)胞系的特性，比如說較為常見的是神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等。正常情況下，NSCs通常位于大腦的腦室下區(qū)(SVZ)和亞顆粒區(qū)(SGZ)，而且NSCs在分化特性中并不活躍，但是在人體大腦發(fā)育的每個(gè)階段中均發(fā)揮舉足輕重的作用。然而根據(jù)近來研究結(jié)果的說法表明，非活性NSCs可以在大腦受到損傷后很快被激活，被激活之后的NSCs可以參與到大腦細(xì)胞的修復(fù)過程中去。特別的是，對于大腦受到損傷后發(fā)生的整個(gè)病理反應(yīng)過程而言，被激活后的NSCs參與的自我修復(fù)作用往往是短暫的、不充分的[22]。因此，近幾十年來，世界范圍內(nèi)的研究人員對顱腦損傷中，包括外傷性腦出血以及自發(fā)性腦出血，NSCs的研究數(shù)量逐年增加，研究人員對腦損傷中NSCs的研究目的；主要是想發(fā)現(xiàn)激活內(nèi)源性NSCs和移植外源性NSCs在促進(jìn)神經(jīng)功能損傷后修復(fù)過程中的潛在治療策略[23，24]。同樣在這個(gè)階段，我們研究人員所關(guān)注的是，神經(jīng)炎癥在ICH微環(huán)境下的繼發(fā)性腦損傷過程中起著基礎(chǔ)性作用。同樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們也發(fā)現(xiàn)的是多種抗炎細(xì)胞因子、促炎細(xì)胞因子都參與了神經(jīng)功能損傷和神經(jīng)功能修復(fù)的過程中，而且抗炎細(xì)胞因子、促炎細(xì)胞因子在NSCs移植的分化和增殖過程中發(fā)揮全面性的相互作用[25]。最近研究報(bào)道的，IL-17的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)IL-17既是Th17細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子，同時(shí)又是Th17細(xì)胞的極為重要的效應(yīng)細(xì)胞因子。到目前為止已有命名為6個(gè)IL-17家族成員(IL-17A、IL-17BIL-17C,IL-17D,IL-17E和IL-17F)和5種IL-17受體(IL-17RA,IL-17rb、IL-17RCIL-17RD和?；鶗?.IL-17A(即IL-17)與IL-17F在結(jié)構(gòu)上極度的相似,其同源性達(dá)到50%,人的IL-17和IL-17F基因均附著在染色體的6p12位點(diǎn),其中IL-17的長度是4292個(gè)基點(diǎn),是由155個(gè)氨基酸殘基依靠二硫鍵的結(jié)合形成的，其相對分子質(zhì)量為(30~35)×103的同源二聚體,實(shí)驗(yàn)得出,Th17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17和IL-17F,主要是以IL-17/IL-17F異二聚體的形式存在[26],IL-17和IL-17F可與上皮細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞,以及巨噬細(xì)胞上的IL-17RA和IL-17RC相結(jié)合,誘發(fā)表達(dá)細(xì)胞因子(IL-1β腫瘤壞死因子,il-6,GM-CSF)、趨化因子(處于受控,CXCL8CXCL10)以及金屬蛋白酶,從而發(fā)揮促炎生物學(xué)效應(yīng)在炎性部位上[27]。其同樣也被稱為IL-17A細(xì)胞因子，IL-17A是IL-17家族的主要的細(xì)胞因子的其中一份子，由T(Th17)細(xì)胞的一個(gè)亞群產(chǎn)生(Huberetal.,2013;Costaetal.,2012;Cocciaetal.,2012)。盡管IL-17A單獨(dú)的作用效果是有限的,目前已經(jīng)研究證實(shí)的是，IL-17A與IL-1β,IL-22以及體內(nèi)其他細(xì)胞因子之間相互合作，(Adamiketal.,2013;Abeetal.,2012;DunganandMills,2011)。特別是IL-17A會誘發(fā)促炎性反應(yīng)，通過誘導(dǎo)許多其他細(xì)胞因子和趨化因子的反應(yīng)(Newcombetal.2012;Rocha等人)，這種細(xì)胞因子是在先天免疫和獲得性免疫之間的一種密不可分的聯(lián)系，據(jù)報(bào)道IL-17A細(xì)胞因子在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮的作用中是一把雙刃劍，在某些反應(yīng)中發(fā)揮有利作用，然而在另外某些反應(yīng)中發(fā)揮著不利的作用[28]。然而，迄今為止，世界范圍內(nèi)關(guān)于IL-17這種細(xì)胞因子在sICH的診斷方略和預(yù)后康復(fù)治療方面的臨床價(jià)值的研究仍比較少。一項(xiàng)對歐洲多中心的研究中我們不難發(fā)現(xiàn)，無論是ICH還是腦缺血超急性期，循環(huán)IL-17細(xì)胞因子的水平可能不是區(qū)分卒中模擬物與真實(shí)卒中的候選生物標(biāo)志物[29。在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，相比一些在ICH早期即有反應(yīng)的許多生物標(biāo)志物來說，比如IL-4、IL-10和IL-6等其他細(xì)胞因子來講，我們清楚的檢測到血清IL-17細(xì)胞因子在ICH患者入院發(fā)病后的第3天水平含量是明顯上升的[30，31]。同時(shí)，我們在ICH患者入院時(shí)通過GCS評估并未發(fā)現(xiàn)血清IL-17細(xì)胞因子的水平與患者的神經(jīng)功能損傷之間有相關(guān)關(guān)系，根據(jù)評估結(jié)果提示血清IL-17在ICH患者的病理過程中是一種比較緩慢的病理反應(yīng)過程，換句話說ICH患者最開始病情發(fā)展時(shí)，這個(gè)血清IL-17并沒有參與其中。同時(shí)，我們通過評估患者GOS評分中發(fā)現(xiàn)，血清IL-17細(xì)胞因子在第14天水平含量升高，血清IL-17細(xì)胞因子水平含量升高的ICH患者的恢復(fù)比較慢，預(yù)后也比較差，提示IL-17細(xì)胞因子在腦出血發(fā)病過程中具有神經(jīng)毒性作用，也就是說血清IL-17細(xì)胞因子抑制神經(jīng)功能恢復(fù)，這種情況持續(xù)進(jìn)展的話可能對疾病的預(yù)后產(chǎn)生不良影響。TCRγδ細(xì)胞作為主要的IL-17捐贈者，也就是說TCRγδ細(xì)胞分泌IL-17這種細(xì)胞因子，而且我們通過文獻(xiàn)查不難發(fā)現(xiàn)是TCRγδ細(xì)胞通過向周圍的骨髓細(xì)胞(比如中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)產(chǎn)生各種趨化信號，這種信號可以驅(qū)動特殊的細(xì)胞分泌特殊的細(xì)胞因子，比如說TCRγδ細(xì)胞分泌細(xì)胞因子中，其中包括IL-17在內(nèi)的，這些細(xì)胞因子在分泌之后，作用于靶細(xì)胞中有神經(jīng)毒性一般在神經(jīng)損傷后，導(dǎo)致缺血性腦損傷病理過程更加復(fù)雜，最終加劇了缺血性腦損傷[32]。那么從另一個(gè)方面，從Gaoetal[33]以及Zhangetal[34]發(fā)表的多篇文獻(xiàn)報(bào)道，我們研究人員可得出一些推測性的結(jié)論，NSC移植作用所產(chǎn)生的機(jī)制的原理，可能是會減少ICH患者中的TCRγδ細(xì)胞水平和多種炎癥細(xì)胞因子的滲透。TCRγδ細(xì)胞和IL-17之間本身密不可分的關(guān)系，因?yàn)門CRγδ細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子包括IL-17在內(nèi)的細(xì)胞，并且在腦出血發(fā)病的病理生理機(jī)制的過程中，TCRγδ細(xì)胞和IL-17細(xì)胞因子這兩種生物標(biāo)志物之間的明確區(qū)別在以往的實(shí)驗(yàn)研究中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)。所以，我們研究人員通過流式細(xì)胞儀提取細(xì)胞的方法來研究實(shí)驗(yàn)，在腦出血血腫周圍的組織中發(fā)現(xiàn)的TCRγδ細(xì)胞和IL-17共表達(dá)，根據(jù)這個(gè)結(jié)果我們推測出IL-17這種細(xì)胞因子在腦出血的患者中神經(jīng)功能損傷的病理生理機(jī)制中發(fā)揮主要影響作用，而不是TCRγδ細(xì)胞發(fā)揮主要作用。基于這一發(fā)現(xiàn)，我們推測可以通過IL-17中和或者其他方式來抑制IL-17細(xì)胞因子超載引起ICH患者腦血腫周圍組織的過度促炎作用，可能在治療上減輕ICH的神經(jīng)毒性作用。而且之前有研究報(bào)道，對于ICH患者來說，IL-17中和治療聯(lián)合低溫治療相比單純的抗IL-17細(xì)胞因子抗體治療或者單純低溫治療有更好的療效[35]。并且在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)NSCs移植是治療ICH小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械囊环N有效方法，實(shí)驗(yàn)研究中我們發(fā)現(xiàn)NSCs移植可以促進(jìn)腦出血小鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。與此同時(shí)，IL-17中和與NSCs移植一起可能會增強(qiáng)神經(jīng)功能的保護(hù)作用，說明IL-17中和能有效促進(jìn)NSCs移植誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。然而IL-17在ICH患者的神經(jīng)功能恢復(fù)中的作用機(jī)制以及在神經(jīng)干細(xì)胞定向分化中的作用尚未有明確的解釋。因此，我們在體外探索了IL-17在神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生中的潛在機(jī)制，在這里我們隆重的引入了nestin、MAP2和GFAP三種蛋白來區(qū)分不同共培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)中NSCs的分化。Nestin（巢蛋白）是一種生物標(biāo)志物，它是神經(jīng)上皮干細(xì)胞的一種。GFAP蛋白作為標(biāo)記物由星形膠質(zhì)細(xì)胞染色來的，MAP2蛋白作為生物標(biāo)志物同時(shí)作為神經(jīng)元的一種。抗IL-17單克隆抗體在IL-17中和中的應(yīng)用激發(fā)了nsc中TCRγδ細(xì)胞分化的功能。然而，實(shí)驗(yàn)中我們并未發(fā)現(xiàn)MAP2蛋白的表達(dá)中出現(xiàn)這種分化效應(yīng)。結(jié)果表明，IL-17細(xì)胞因子可能對NSCs的分化造成深遠(yuǎn)影響，IL-17細(xì)胞因子可以在NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的分化中起抑制作用。抗IL-17單克隆抗體中和IL-17可減輕對星形膠質(zhì)細(xì)胞而非神經(jīng)元的阻滯作用。雖然中風(fēng)可以觸發(fā)NSCs從非活性狀態(tài)重新分化和增殖活性狀態(tài)，但已有研究表明，NSCs的遷移和增殖可以被抑制，因此可能是NSCs的遷移和增殖受到抑制，最終導(dǎo)致炎癥灶內(nèi)NSCs的自發(fā)性脫髓鞘和神經(jīng)修復(fù)失敗，特別強(qiáng)調(diào)的是IL-17細(xì)胞因子可能對NSCs起矛盾作用。一方面，李等人發(fā)表的研究結(jié)果得到的結(jié)果是，星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-17A可以維持甚至提高腦室下區(qū)(SVZ)神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCs)的存活率、包括神經(jīng)元細(xì)胞的分化能力、隨后的突觸形成和腦卒中后的神經(jīng)功能的恢復(fù)。然而另一方面，也有研究人員在研究過程中發(fā)現(xiàn)IL-17細(xì)胞因子在作為促炎細(xì)胞因子起到至關(guān)重要的作用，IL-17細(xì)胞因子在由NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化中，起到抑制作用，這也可能是研究人員最能接受的結(jié)果。在多發(fā)性硬化的研究中，有證據(jù)顯示，在NSCs培養(yǎng)基中加入IL-17這種細(xì)胞因子后，發(fā)現(xiàn)并觀察最終可得出結(jié)論，NSCs的數(shù)目會隨之減少以及形成神經(jīng)元的能力也隨之降低。我們推測IL-17細(xì)胞因子在NSCs神經(jīng)發(fā)生中的作用差異可能與IL-17的來源有關(guān)。星形膠質(zhì)細(xì)胞起源IL-17細(xì)胞因子可能是起到保護(hù)作用，然而TCRγδ細(xì)胞或者是Th17細(xì)胞起源的IL-17細(xì)胞因子對NSC可能產(chǎn)生毒性作用。此外，目前市場上的抗IL-17單克隆抗體的商業(yè)制劑，例如蘇金單抗、單抗抗體在感染、慢性炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，這幾種抗體制劑已經(jīng)廣泛被用于治療屬于炎癥性去變性的銀屑病以及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等免疫型系統(tǒng)疾病;并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也有密切關(guān)系。與此同時(shí)，IL-17的中和作用在MS（多發(fā)性硬化癥）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的機(jī)制研究中也得到了研究，同樣我們在腦卒中的神經(jīng)功能恢復(fù)治療中發(fā)現(xiàn)其仍有商業(yè)應(yīng)用的證據(jù)。因此我們在這里可以提出一個(gè)定義并去證實(shí)，我們認(rèn)為抗IL-17單克隆抗體在ICH患者的神級功能恢復(fù)過程的治療可能是一個(gè)有前途的治療藥物，因此我們將會對抗IL-17單克隆抗體開發(fā)和藥理病理學(xué)研究將進(jìn)一步研究，并且對于我們研究人員來說又是一次重大的挑戰(zhàn)。在本研究中，我們提供了證據(jù)，表明血清IL-17水平可能與ICH患者神經(jīng)功能的恢復(fù)顯著相關(guān)。此外我們在研究腦出血模型中，我們曾設(shè)想構(gòu)造動物模型，由于出血性或缺血性腦卒中的類型不易確定，無法控制出血時(shí)間、出血量和出血面積，以及消耗大量時(shí)間精力的不足。自發(fā)性高血壓大鼠購買成本高、來源少，也導(dǎo)致了此類腦出血模型在動物實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用的局限性，與此相比較，通過植入填充物來模擬腦出血模型，目前這種腦出血模型僅用于開顱或微創(chuàng)鉆孔引流對顱內(nèi)血腫清除的研究，膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型，由于該模型機(jī)制為腦彌漫性出血，自發(fā)性腦出血與之相比出血突然且沒有急性占位效應(yīng)，因此該模型有一定的局限性，不能完全模擬自發(fā)性腦出血的病理過程。在小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，IL-17中和可同時(shí)促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，并進(jìn)一步抑制神經(jīng)功能的損傷。IL-17中和的治療作用可能有助于促進(jìn)NCS在體外定向分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞。我們認(rèn)為，由于其具有定植特性，星形膠質(zhì)細(xì)胞對腦損傷的反應(yīng)可能早于免疫細(xì)胞。因此，我們將更加關(guān)注中風(fēng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的即時(shí)炎癥反應(yīng)。5結(jié)論IL-17作為一種促進(jìn)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，這種細(xì)胞因子具有非常強(qiáng)烈的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用，這種神經(jīng)細(xì)胞毒性作用顯著影響著sICH患者的神經(jīng)功能恢復(fù)狀況。可能是由于IL-17促炎因子抑制了NSC向功能神經(jīng)細(xì)胞的分化從而影響病人預(yù)后的功能恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)研究得出IL-17中和的功能會削弱IL-17促炎因子抑制作用，IL-17中和不僅可以加強(qiáng)NSCs的定向分化水平，并且可以顯著的促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。本研究由安徽省自然科學(xué)基金資助安徽省(1708085MH211)高校拔尖人才基地(gxbjZD11)。參考文獻(xiàn)［1］.KrishnamurthiRV,MoranAE,ForouzanfarMH,BennettDA,MensahGA,LawesCM,Barker-ColloS,ConnorM,RothGA,SaccoRetal:Theglobalburdenofhemorrhagicstroke:asummaryoffindingsfromtheGBD2010study.Globalheart2014,9(1):101-106.［2］.ChenCC,ChenX,LiTC,LinHL,ChuYT,LeeHC,ChengYK,ChenDC,TsaiSC,ChoDYetal:PG2forpatientswithacutespontaneousintracerebralhemorrhage:adouble-blind,randomized,placebo-controlledstudy.Scientificreports2017,7:45628.［3］.KoivunenRJ,HarnoH,TatlisumakT,PutaalaJ:Depression,anxiety,andcognitivefunctioningafterintracerebralhemorrhage.ActaneurologicaScandinavica2015,132(3):179-184.［4］.KeepRF,HuaY,XiG:Intracerebralhaemorrhage:mechanismsofinjuryandtherapeutictargets.TheLancetNeurology2012,11(8):720-731.［5］MacLaughlinBW，PluradDS，SheppardW，etal．Theimpactofintracranialpressuremonitoringonmortalityafterseveretraumaticbraininjury［J］．AmJSurg，2015，210(6):1082-1087．［6］YuanQ，WuX，SunY，etal．Impactofintracranialpressuremonitoringonmortalityinpatientswithtraumaticbraininjury:asystematicreviewandmeta-analysis［J］．JNeurosurg，2015，122(3):574-587．［7］ChangCY，LinCY，ChenLC，etal．Thepredictorofmortalitywithinsix-monthsinpatientswithspontaneouscerebellarhemorrhage:aretrospectivestudy［J］．PLoSOne，2015，10(7):123-129．［8］WuYT，LiTY，ChiangSL，etal．Predictorsoffirstweekmortalityinpatientswithacutespontaneouscerebellarhemorrhage［J］．Cerebellum，2013，12(2):165-170．［9］.MendelowAD,GregsonBA,FernandesHM,MurrayGD,TeasdaleGM,HopeDT,KarimiA,ShawMD,BarerDH,investigatorsS:EarlysurgeryversusinitialconservativetreatmentinpatientswithspontaneoussupratentorialintracerebralhaematomasintheInternationalSurgicalTrialinIntracerebralHaemorrhage(STICH):arandomisedtrial.Lancet2005,365(9457):387-397.［10］.AronowskiJ,ZhaoX:Molecularpathophysiologyofcerebralhemorrhage:secondarybraininjury.Stroke2011,42(6):1781-1786.［11］.FelbergRA,GrottaJC,ShirzadiAL,StrongR,NarayanaP,Hill-FelbergSJ,AronowskiJ:Celldeathinexperimentalintracerebralhemorrhage:the"blackhole"modelofhemorrhagicdamage.Annalsofneurology2002,51(4):517-524.［12］.HuangFP,XiG,KeepRF,HuaY,NemoianuA,HoffJT:Brainedemaafterexperimentalintracerebralhemorrhage:roleofhemoglobindegradationproducts.Journalofneurosurgery2002,96(2):287-293.［13］.LatourLL,KangDW,EzzeddineMA,ChalelaJA,WarachS:Earlyblood-brainbarrierdisruptioninhumanfocalbrainischemia.Annalsofneurology2004,56(4):468-477.［14］.LiebnerS,DijkhuizenRM,ReissY,PlateKH,AgalliuD,ConstantinG:Functionalmorphologyoftheblood-brainbarrierinhealthanddisease.Actaneuropathologica2018,135(3):311-336.［15］.HaraK,YasuharaT,MakiM,MatsukawaN,MasudaT,YuSJ,AliM,YuG,XuL,KimSUetal:NeuralprogenitorNT2Ncelllinesfromteratocarcinomafortransplantationtherapyinstroke.Progressinneurobiology2008,85(3):318-334.［16］.NavarroQuirozE,NavarroQuirozR,AhmadM,GomezEscorcia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