醫(yī)學(xué)知識(shí)一人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取RTPCR的原理方法瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用分析

2024/3/12

RNA2024/3/12◆人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取◆RT-PCR的原理、方法◆瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用主要內(nèi)容

人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取2024/3/12電泳PCR提取總RNA合成cDNA第一鏈2024/3/12真核細(xì)胞RNA的種類真核細(xì)胞總RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA在其3'端均有一多聚A(PolyA)尾巴。2024/3/12實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備

RNA實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以建立一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境對(duì)于制備RNA很重要。2024/3/12常用的RNA酶抑制劑

1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合，進(jìn)而使RNA酶失活，有高致癌性。（實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段使用）2、異硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同時(shí)也使RNA酶失活。3、RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。（合成cDNA階段使用）2024/3/12實(shí)驗(yàn)原理Trizol試劑盒是一種苯酚與異硫氰酸胍(GTC)的混合物，異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA進(jìn)入水相，離心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白質(zhì)保留在有機(jī)相中。轉(zhuǎn)移水相，加入異丙醇沉淀RNA，從而得到純化的總RNA。2024/3/12

提取RNA

（一）、準(zhǔn)備試劑氯仿異丙醇75℅乙醇無(wú)RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過(guò)的水配制)

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提取RNA

（二）、操作步驟取材:用生理鹽水漱口后，含生理鹽水約2~3min，用15ml離心管（4000rpm5min）收集細(xì)胞(同管多次離心)，棄上清

沉淀中加入1mlTRIzol，旋渦震蕩10s重懸沉淀，加樣槍打勻溶液后轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管，15~30℃放置5min

加入0.2ml氯仿，用手搖晃15s，15~30℃放置5min

12000rpm離心15min2024/3/12

提取RNA

（二）、操作步驟小心吸取上清，轉(zhuǎn)移至新的1.5mlEp管，加入等體積的異丙醇，15~30℃放置10min

12000rpm離心15min，小心去上清，加入1ml70%乙醇，震蕩數(shù)秒，8000rpm離心5min

小心去上清，室溫干燥5min，加入10ulDEPC水，打勻

55℃水浴10分鐘助溶2024/3/12

提取RNA

（三）、注意事項(xiàng)1、塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高壓滅菌。2、有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。3、所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長(zhǎng)時(shí)間。4、配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1%DEPC在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌。5、操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換。2024/3/12

提取RNA

（三）、注意事項(xiàng)6、設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。7、防止RNA酶污染（1）RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等（2）嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑的污染。（3）最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶；而各種組織和細(xì)胞中則含有大量?jī)?nèi)源性的RNA酶。2024/3/12

RNA保存溶解在無(wú)RNase的水或TE中，在-70℃或更低溫度中保存時(shí)間在一年以內(nèi)，但避免反復(fù)凍融，應(yīng)分裝保存。從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需溶解在去離子甲酰胺中存于-70℃，至少可以保存一年。需使用RNA時(shí)，可以加入NaAc至終濃度0.3M，12000×g離心5分鐘，70%乙醇洗滌后再用無(wú)RNase的水或TE溶解。RT-PCR的原理、方法2024/3/12實(shí)驗(yàn)原理1、單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制。2、PCR技術(shù)，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)分三步：變性，退火，延伸。3、逆轉(zhuǎn)錄酶。可以以RNA為模板合成cDNA第一條鏈，或者以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA。principedoesmatter

可見(jiàn)，RT-PCR是一種將cDNA合成與PCR技術(shù)結(jié)合分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNase降解RNA

單鏈DNADNA聚合酶cDNART-PCRTaq酶2024/3/121、引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。2、引物設(shè)計(jì)原則的把握：（1）引物長(zhǎng)度:一般為15～30bp（2）堿基分布（3）3‘端要求（4）引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)（5）引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)（6）同源序列

（7）5’端無(wú)嚴(yán)格限制

操作步驟

（一）引物設(shè)計(jì)2024/3/12

操作步驟

（二）RNA的提取2024/3/12

操作步驟

（二）RNA的提取2024/3/12（1）兩步法RT-PCR

操作步驟

（三）cNDA合成a常用的反應(yīng)體系10×RT反應(yīng)緩沖液2uldNTPMixture（各10mM）2ulRNAaseinhibitor(40U/ul)0.5uloligo(dT)181ul逆轉(zhuǎn)錄酶1ul總RNA0.5~1ugDEPC－free水補(bǔ)足體系至20ul2024/3/12（1）兩步法RT-PCR

操作步驟

（三）cNDA合成b操作在發(fā)給每人一份的已制備分裝的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管里加入8ul總RNA溶液

0.2mlEp管，迷你離心機(jī)離心數(shù)秒，放置PCR儀中42℃30min（合成cDNA第一鏈）85℃5min（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶）↓↓2024/3/12（2）一步法RT-PCR

操作步驟

（三）cNDA合成

在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在同一管內(nèi)進(jìn)行。優(yōu)勢(shì)：在處理大量樣品時(shí)易于操作；減少殘余污染；可以得到更高的靈敏度。缺點(diǎn)：無(wú)法優(yōu)化反應(yīng)條件；一旦失敗，必須重新提取總RNA。

2024/3/12（2）一步法RT-PCR

操作步驟

（三）cNDA合成·0.1-1ug總RNA200一500umol/L的dNTP(每種)0.5umol／L基因特異引物（上下游）200UAMV逆轉(zhuǎn)錄酶1×Taq聚合酶緩沖液0.5-15mmol／LMgCI21mmo1／LDTT1.5UTaq聚臺(tái)酶終體積為50ul。2024/3/12（1）50ulPCR體系的組成（即一步法）：

操作步驟

（四）PCR擴(kuò)增2024/3/12（2）PCR反應(yīng)過(guò)程：

操作步驟

（四）PCR擴(kuò)增2024/3/12（1）引物退火溫度的調(diào)節(jié)，一般在引物設(shè)計(jì)軟件推薦溫度的上下2℃變化尋找最佳退火溫度。（2）此外Mg2＋濃度的調(diào)節(jié)也非常重要，通常最佳濃度為2mM左右。（3）引物和模板的量等。

操作步驟

（五）PCR條件的優(yōu)化2024/3/12

根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠（不同長(zhǎng)度產(chǎn)物所需凝膠濃度）。

取適量PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點(diǎn)樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，10V/cm電泳45－60min。成像系統(tǒng)成像分析。

操作步驟

（六）產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用2024/3/12實(shí)驗(yàn)原理1、瓊脂糖為鏈狀多糖→繩狀瓊脂糖束→大網(wǎng)孔型凝膠——分離、鑒定、純化DNA2、影響DNA遷移率的因素：DNA分子的大小、構(gòu)象，凝膠濃度，電壓，電泳緩沖液的組成principedoesmatter瓊脂糖濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度/%線狀DNA大小/kb

0.5

0.7

1.0

1.2

1.5

2.0

30-1

12-0.8

10-0.57-0.4

3-0.2

2-0.052024/3/12染色和照相電泳

樣品的制備與加樣選擇電泳類型選擇電泳緩沖體系瓊脂糖凝膠的制備2024/3/12選擇電泳類型用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）。

STEPSdoesmatter2024/3/12選擇緩沖液系統(tǒng)

常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。

STEPSdoesmatter2024/3/12凝膠的制備以稀釋的電泳緩沖液為溶劑，用微波爐配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。

STEPSdoesmatter2024/3/12樣品配制與加樣

DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有0.25%溴酚藍(lán)或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。

STEPSdoesmatter2024/3/12電泳

在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。因此為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不宜高于5V/cm。

STEPSdoesmatter2024/3/12染色與照相

常用熒光染料溴乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進(jìn)行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。

STEPSdoesmatter2024/3/12

結(jié)果分析

（一）、影響瓊脂糖凝膠電泳的因素DNA分子的大小：實(shí)驗(yàn)證明，DNA片段遷移距離與其分子量的對(duì)數(shù)成反比；瓊脂糖的濃度：一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂凝膠中，電泳遷移率不相同；DNA分子的構(gòu)型：不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大2024/3/12

結(jié)果分析

（二）、常見(jiàn)問(wèn)題的原因和解決常見(jiàn)問(wèn)題原因?qū)Σ唠娪緯r(shí)ladder扭曲配膠的緩沖液與電泳的緩沖液不是同時(shí)配制。同時(shí)配制，電泳緩沖液高出膠的1-2mm即可。電泳時(shí)電壓過(guò)高電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm。2024/3/12

結(jié)果分析

（二）、常見(jiàn)問(wèn)題的原因和解決常見(jiàn)問(wèn)題原因?qū)Σ逥NA帶缺尖DNA跑出凝膠縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增加凝膠濃度。分子大小相近的DNA帶不易分辨增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確凝膠濃度DNA變性電泳前勿加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋DNA。DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適。在脈沖凝膠電泳上個(gè)分析。2024/3/12

結(jié)果分析

（二）、常見(jiàn)問(wèn)題的原因和解決常見(jiàn)問(wèn)題原因?qū)Σ邘趸驘o(wú)DNA帶DNA上樣量不夠增加DNA上樣量，聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度高，上樣量可適當(dāng)降低。DNA降解實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免核酸酶污染。DNA跑出凝膠縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增加凝膠濃度。EB染色的DNA所用光源不合適應(yīng)用短波長(zhǎng)（254nm）的紫外光源。2024/3/12

結(jié)果分析

（二）、常見(jiàn)問(wèn)題的原因和解決常見(jiàn)問(wèn)題原因?qū)Σ叱霈F(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶酶量多或者酶的質(zhì)量差，dNTP濃度高，Mg2+濃度高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)多。減少酶量或更換酶，減少dNTP濃度，適當(dāng)降低Mg2+濃度，增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。不規(guī)則DNA帶遷移電泳條件不合適電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm，溫度<30℃，巨大DNA鏈電泳， 溫度<15℃，檢查所用電泳緩沖液的緩沖能力，注意經(jīng)常更換。DNA變性電泳前勿加熱