分子生態(tài)學實驗步驟與原理總結

./基因組DNA提取XX博彩生物科技XX：3SDNAIsolationKitforEnvironmentalSamplesV2.23S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒V2.2DNA抽提方法使用儀器：滅菌鍋,無菌操作臺,移液槍,漩渦振蕩器,臺式離心機,水浴鍋,分光光度計或者瓊脂糖電泳槽滅菌物品：槍頭,1.5ml,2ml離心管一、污泥樣品前處理樣品在處理前首先要混勻,使其中的懸浮物質分布均勻。取約l0mL污水樣品,加入滅菌離心管,400Orpm、離心20min,收集沉淀,加約4倍體積的TENPbuffer<50mMTirs,20mMEDTA,100mMNaCl,0.01g/mLPVP,pHl0>,加玻璃珠<d:lmm>充分勻化<解絮凝>。4000rpm,離心20min,棄上清<重復兩次,直至上清液較澄清>。加約4倍體積的PBSbuffer<8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶于lL水、pH7.4>,旋渦混勻,4000rpm,離心20min,收集沉淀<重復兩次>二、基因組DNA提取樣品準備：100mg樣品用200ulSolutionSUS將樣品浸泡、懸浮,使樣品軟化分散開。加入400ulSolutionLYS,300mg石英砂,蓋上離心管蓋,在漩渦振蕩器上高速劇烈振蕩,10-30min或更長時間。用臺式離心機,12000rpm,室溫離心5min。將上清液完全轉移到無菌1.5ml離心管中,加入120ulSolutionBID,蓋上離心管蓋,上下顛倒混勻。將溶液用1mlTIP全部轉移到3S柱內,柱子放入2ml離心管中,不蓋離心管蓋,室溫放置2min以上。蓋上離心管蓋,12000rpm,室溫離心1min。取下3S柱,棄去離心管中的廢液。將柱子放回同一根離心管中,加入600ulWashSolution,10000rpm,室溫離心1min。重復6一次。取下3S柱,棄去離心管中的全部廢液。將柱子放回同一根離心管中,10000rpm,室溫離心2min,以除去殘留的WashSolution。洗脫：在柱子中央加入100ulTE,將柱子放入新的干凈1.5ml離心管中,室溫放置2min。12000rpm,室溫離心1min。收集管中的液體即為基因組DNA。根據(jù)用途,樣品可以4℃或-20℃保存。為提高洗脫效率,可以將TE預熱到37-55℃。如果樣品中基因組DNA含量很低,用30ulTE洗脫可以提高洗脫液的樣品濃度,但產率有所下降。重復該洗脫步驟一次,可以提高產率20%左右。三、提取DNA的質量檢測<1>DNA純度和濃度檢測用紫外分光光度計測定DNA樣品在波長230,260,280nm處的吸光光度值。DNA純度的定性檢測:通過A260/A280與A260/A230的比值可以檢測所提DNA是否純。通常純DNA樣品A26O/A280≈1.8,A260/A230>2。若A260/A280>l.9,可能有RNA污染；若A260/A280<l.6,可能有蛋白質污染；若A260/A230≤2,可能存在酚類等小分子雜質。DNA濃度的計算：濃度<μg/mL>=A260*50*稀釋倍數(shù)；注：1OD值相當于50μg/mL雙螺旋DNA。<2>DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測將所得DNA樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳,電壓100V,電泳lh,EB染色后,用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。.〔二〕PCR擴增一、PCR擴增引物采用兩組對大多數(shù)細菌和古細菌的16SrRNA基因V3區(qū)具有特異性的引物對：組合<F34,GC和RS:8>。引物組合的正向引物5’端中有一個富含GC的40bp的GC發(fā)卡結構。它們各自序列分別為:F341:<5’一eCTACGooAooeAGeAo一3’>,Rsls:<5’<5’一CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG一3組合擴增產物片段長度約為220bp。二、PCR擴增反應體系PCR擴增反應體系,與表3一3相同。加樣后立即進行PCR擴增。三、PCR擴增程序PCR擴增程序,與表3一4相同。四、PCR產物電泳檢測取5閃PCR產物進行電泳,膠濃度為2.0%,在電壓100v條件下電泳lh后檢測,經EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)觀察,保存凝膠圖譜。電泳所用Marker為天根生化科技<>XX生產的nNAM叭e:nLZo00。.〔三〕變性梯度凝膠電泳<DGGE>分析預電泳的作用1.使體系達到反應的條件2.清除過多的變性劑和APS等,保持膠的穩(wěn)定狀態(tài)。聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析。其裝載的樣品量大,回收DNA純度高。長度僅相差0.2%<即500bp中的1bp>的核苷酸分子即能分離。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體,在催化劑TEMED<N,N,N,N'一四甲基乙二胺>和過硫酸銨的作用下,丙烯酰胺聚合形成長鏈,聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑,N,N'一亞甲雙丙烯酰胺參與下,聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠。一、試劑配制<l>50*TAE緩沖液:242gTris堿,57.1mL冰醋酸,100mL0.5MEDTA<pH8.0>,加水至1L?；旌暇鶆蚝蟾邏簻缇?0-30min,室溫保存。<2>40%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺<37.5：1>：38.93g丙烯酰胺,1.07g雙丙烯酰胺,加水至100mL。<3>O%變性溶液：20mL40%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺,2mL50*TAE緩沖液,加水至100mL,再分別加入80μLAPS和5μLTEMED。4℃<4>100%變性溶液：2OmL40%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺,2mL50*TAE緩沖液,40mL甲酰胺,42g尿素,加水至100mL,再分別加入80μLAPS和5μLTEMED。4<5>10%過硫酞胺<APS>：lg過硫酰胺加水至10mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。<6>對于變性濃度低于100%的溶液,用0%和100%的變性溶液混合配制而成,尿素和甲酰胺含量如下所示：不同濃度的變性溶液尿素、甲酰胺含量成分10%20%30%40%50%60%70%80%90%尿素〔g〕4.28.412.616.82125.229.433.637.8甲酰胺〔ml〕4812162024283236二、DGGE膠的制備<l>用無水乙醇清潔制膠用的兩塊玻璃板,將spacer放在2個玻璃板之間,插入clamp中,將aligment板放入,用螺絲夾子固定,將aligment取出,用手摸底部是否平整,要絕對的平,否則會漏。<2>將軟墊放在底座上,玻璃板放在軟墊上固定,用水平器調節(jié)。<3>配制13.5mL高濃度變性梯度液,加入梯度儀高濃度右槽,打開左槽螺旋,溶液流入左槽,關上螺旋,用吸管將它們吸回右槽內<確保兩槽無氣泡阻隔>。<4>配制13.5mL低濃度變性梯度液,加入梯度儀低濃度左槽。<5>輕輕打開兩槽間的活塞和梯度儀出口開關,并攪拌。將長針頭插入玻璃板之間,流速保持在2mL/min左右。<6>膠板灌滿后,頂部插入梳子,凝固2小時。三、DGGE凝膠電泳步驟與染色<l>在DGGE槽中加7L左右1*TAE<DGGE專用>,使槽中的水至Full和Run的中間位置；加蓋,注意長桿進入底部的窟窿中,打開電源,將溫度設置到60℃<2>當梳子位置的膠凝固好后,將玻璃板固定在黃色的凝膠板架上,如果只有1板膠,注意另一側也要固定玻璃板<不加spacer>,否則漏水。安裝好玻璃板后,將凝膠板架<紅點在右邊>放入水槽中,之后將溫度控制器蓋在電泳槽上,注意長桿進入底部的窟窿中。打開電源,打開heat鍵和bump鍵,開bump鍵后,水位會下降,降至run與maxmum的中間,水若不夠的話,關閉電源,打開溫度控制器上方的探望口,加1*TAE補足。<3>溫度達到60℃,立即進樣,先關掉所有電源,取下溫度控制器,小心地拔掉梳子,用移液槍沖洗侮一個進樣孔；進樣要緩慢,使樣品順著玻璃板均勻地落入到進樣孔中。每一個進樣孔加入25μ<4>將溫度控制器蓋在電泳槽上,打開電源,將溫度調到60℃,打開heat鍵和bump鍵,運行5min后,在主機上插入紅黑電源線,注意紅黑線不要顛倒。打開主機電源,將電壓調到120V,時間調為5<5>電泳結束后,關掉電源,打開蓋子,將凝膠板架拿出,控水,卸下玻璃板。將clamp卸下,手抓住spacer,向內側擰,揭下短玻璃板,膠粘在長玻璃板上。<6>將托盤上平鋪X保鮮膜后,將長板和膠放入托盤中銀染。銀染步驟步驟：時間溶液固定30min10%冰醋酸、30%乙醇,100ml敏化2*10min30%乙醇,100ml洗滌沖洗30s,漂洗5*5min雙蒸水銀染30min新鮮配制的0.1%AgNO3,100ml,使用前加入370μl的福爾馬林溶液洗滌沖洗30s,漂洗1min,再沖洗30s雙蒸水顯影直至顯示條帶為止,密切觀察溶液1：0.2g硫代硫酸鈉于10ml水中溶液2：2.5g碳酸鈉于100ml水中將100μl溶液1加入溶液2中,再加350μl的福爾馬林溶液終止30min5.84gEDTA2Na·2H2O以與8gGlycine于雙蒸水中,定容至400ml〔也可用10%的冰醋酸〕保存長達數(shù)日10%甘油長時間保存干膠自然干燥即可〔1〕AgNO3母液〔20%〕：將2gAgNO3溶解于雙蒸水中,定容至10ml,放置于棕色瓶中密閉保存。每次使用時取2ml母液,稀釋至400ml,再加入福爾馬林。〔2〕10*TrisEDTA〔TE〕：pH=8.0A．100mmol/LTris-CI〔pH=8.0〕B．10mmol/LEDTA<pH=8.0>C．Tris-Cl<1mol/L>：用800ml蒸餾水溶解121.1gTris堿,加濃鹽酸調pH值至所需值。銀染原理：銀染是一種常用的蛋白質染色方法,具有較高的靈敏度,可以染出SDS膠中含量低至0.2ng的蛋白。雖然這是protocol上的說法,但如果操作得當,檢測到5ng左右的蛋白應該不成問題。如果搜索銀染的protocol,可能會得到許多種說法。為什么這樣一種重要的實驗手段卻得不到統(tǒng)一的應用呢？這可能要從銀染本身那復雜而又靈活的原理說起。簡單的講,銀染的原理就是將銀離子還原,附著在蛋白表面,形成染色。銀染所用的銀,基本上是基于兩種試劑,一種是硝酸銀,另一種是Silverdiammine?；谙跛徙y的應用要多于后者〔據(jù)說Silverdiammine比較費"銀子"〕,現(xiàn)在主要說說基于硝酸銀的銀染的原理。銀離子容易被還原,在PAGE膠上,哪里的銀離子先開始被還原,哪里就先開始出現(xiàn)條帶。通常由于蛋白質結構上的復雜性,一部分銀離子結合在蛋白質之上后會影響更多銀離子的結合,所以有蛋白的地方銀離子較少,如果不做任何處理,有蛋白的部位將會染色更淺,所以最初的銀染是負染。那最初的負染是如何演變成正染色的呢？一方面是選用還原速度較慢的還原劑,如甲醛,另一方面,利用慢還原爭取到的時間將膠上多余的銀離子洗去,由于銀離子對蛋白質有一定的結合力,故更多地保留在有蛋白的位置,于是形成了正染。但是這種染色的方法靈敏度還不是很高,所以人們又在染色之前加入了敏化的步驟,能夠使銀染敏化的試劑很多,一類是增加蛋白質與銀離子的結合位點,如SDS等；還有一類能使銀離子和蛋白形成silversulfide等結合,硫代硫酸鹽起到的就是這個作用；還有的試劑兼顧上述兩種功能,如戊二醛。通過敏化過程,銀染的靈敏度大大增加,同時也降低了背景。綜上,銀染的原理概括如下：讓銀離子盡可能多的于蛋白結合,盡可能的洗掉膠上的銀離子,然后還原顯色。各種各樣的protocol基本上都是基于這個原理。最為經典的一個版本是這樣的：談談其中一些具體步驟：1.固定,固定的作用主要是使蛋白變性,防止蛋白在擴散2.敏化,戊二醛和硫代硫酸鈉都是增加蛋白和銀離子的結合,但是做質譜兼容銀染的時候一般都把戊二醛去掉,原因是對蛋白造成修飾〔在我的實驗中,有戊二醛存在的時候一般也能鑒定到蛋白,不知道是不是去掉更好〕。乙酸鈉的作用應該是緩沖pH。3.染色,有的protocol中這一步不加甲醛,不加甲醛使后面的顯色速度將大大降低。4.顯色,碳酸鈉的作用是提供堿性環(huán)境,在堿性環(huán)境下甲醛才能發(fā)揮它的慢還原特性。這一步中的硫代硫酸鈉有增加銀化合物溶解的能力,防止氯化銀在膠表面形成薄膜,但是在質譜兼容銀染中,硫代硫酸鈉也是省去的。5.終止,顧名思義,顯色成功后終止反應。評價好的銀染方法主要基于以下幾個方面：靈敏度,重復性,速度。個人認為平衡好靈敏度和重復性是實驗的關鍵,速度可以放在后面考慮。如果不知道哪個版本的銀染更為合適,那么上面的那個經典版本是個不錯的選擇,之后可以根據(jù)具體的結果,并參考銀染的原理做些優(yōu)化。通常銀染方法簡單,只需幾步。電泳后,在醋酸中固定膠除去電泳液和凝膠中的尿素,并防制小的延伸產物的擴散。換幾次蒸餾水除去固定劑。膠在硝酸銀和甲醛中染色。在染色后,將凝膠用水清洗,在含甲醛和硫代硫酸鈉的堿性碳酸鈉溶液中顯色。甲醛將銀離子還原為金屬銀。硫代硫酸鈉防止自由銀離子還原為金屬銀,否則會增加背景。在顯色一定的時間后,用水清洗一下,在空氣中干燥。<7>用Bio-RadGelDocTMXR凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。.〔四〕DGGE圖譜目的條帶的克隆測序1.DGGE圖譜目的條帶DNA的提取與PCR擴增將切取下來的目的條帶浸泡在TE溶液中,4℃過夜,得到的溶液即可作為PCR反應的模板。PCR反應體系與程序與之前相同,采用引物對BSF338<5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’>和BSR534<5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’>。PCR反應體系〔25μl〕:10×ExTaqbuffer<Mg2+>2.5μl,2.5mmol/LdNTP2μl,20pmol/L正反引物各0.75μl,模板DNA10～100ng,ExTaq0.25μl,加雙蒸水補足至25μl。PCR反應程序：94℃預變性5min,94℃變性40s,55℃退火40s,72℃延伸30s,35個循環(huán),72℃2.PCR產物的膠回收采用E.Z.N.AGelExtractionKit,操作步驟如下：<1>電泳足夠時間后,在紫外燈下小心地把所需的DNA片段切下來,并盡量去除多余的凝膠。<2>稱取空離心管的重量,切下帶目的片段的凝膠裝在1.5ml離心管中并稱其重量,求出凝膠塊的重量,近似地確定其體積。一般情況下,凝膠的密度為1g/ml,于是凝膠的體積與重量的關系可按下面換算：凝膠薄片的重量為0.2g則其體積為0.2ml；加入等倍凝膠體積的BindingBuffer,把混合物置于55℃~65℃水浴中溫浴7min至凝膠完全融化,其間每隔2-3<3>轉移700μl的DNA-瓊脂糖溶液到一個HiBindTMDNA柱子,并把柱子裝在一個干凈的2ml收集管內,室溫下,10000×g離心1min,棄去液體；<4>將柱子重新套回收集管中,加300μlBindingBuffer至HiBindDNA柱子中,室溫下,10000×g離心1分鐘,去棄濾出液；<5>將柱子重新套回收集管中,加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室溫下,10000×g離心1min,去棄濾出液；<6>將柱子重新套回收集管中,重復加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室溫下,10000×g離心1min,棄去濾出液；將空柱子重新套回收集管中,10000×g離心1min以甩干