SN-T 2627-2010馬鈴薯卷葉病毒檢疫鑒定方法

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)馬鈴薯卷葉病毒檢疫鑒定方法2010-05-27發(fā)布國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)四川出人境檢驗(yàn)檢疫局、四川省農(nóng)業(yè)廳植物檢疫站、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)。1馬鈴薯卷葉病毒檢疫鑒定方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了進(jìn)境植物檢疫中馬鈴薯卷葉病毒檢測(cè)鑒定的程序。本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬鈴薯塊莖、種苗等茄科植物感染馬鈴薯卷葉病毒的檢驗(yàn)和鑒定。2原理馬鈴薯卷葉病毒(potatoleafb)lvirus,PLRV)屬馬鈴薯黃癥病毒科，馬鈴薯卷葉病毒屬。病毒粒體球狀，粒體直徑23nm～25nm,是等軸對(duì)稱病毒，致死溫度7O℃,稀釋限點(diǎn)約10-*。引起馬鈴薯卷葉病毒病。馬鈴薯病毒病一般根據(jù)病害癥狀很難確定病事種類，采用免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法，可快速根據(jù)有關(guān)判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行馬鈴幕卷葉病毒檢疫鑒定。3試劑與材料除非另有說明，在本標(biāo)準(zhǔn)中僅使用確認(rèn)的分析純?cè)噭┖驼麴s水或去離子水或相當(dāng)純度的水。3.1免疫學(xué)檢驗(yàn)試劑3.1.1捕捉抗體(Capture儲(chǔ)藏于4℃條件下備用。3.1.2酶標(biāo)抗體(Alkalineantibob)馬錢薯卷phofphataseJnzynfe病毒免疫球蛋白抗體稀釋度按市售產(chǎn)品要求進(jìn)行。conjugdte):國(guó)堿性磷酸酶標(biāo)記的馬鈴薯卷葉病毒的免疫球蛋白抗體。按市售產(chǎn)品要求進(jìn)行稀釋，儲(chǔ)段于4個(gè)條件下備用。3.1.3包被緩沖液(Coatingbbffer):取2.9kg碳酸氫鈉(NHCO,)、1.59g碳酸鈉(Na?CO?)、0.2g疊氮化鈉(NaN?),用1000ml裝餾水浴解，并調(diào)pl值到P.6,儲(chǔ)以手4℃條件下備用。3.1.4洗滌液(PBSTBuffer);取1.15g無水磷酸點(diǎn)二鈉(Na?HP()、0.2g氯化鉀(KCl)、0.2g無水磷酸二氫鉀(KH?PO?),8.0g氟化鈉(NaC1)、0.5B吐溫-,用1300ml.蒸餾水溶解，并調(diào)整pH值到3.1.5樣品提取液(GEBbuffer):取1.3g無水硫酸鈉(Na?SO?)、20.0g聚乙烯吡咯烷酮[(C?H?NO)z?~4%]、0.2g疊氮化鈉(NaN?)、2.0gⅡ級(jí)雞蛋清白蛋白粉、20.0g吐溫-20,用1000mL洗滌液溶解，并調(diào)整pH值到7.4,儲(chǔ)藏于4℃條件下備用。3.1.6酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液(ECIBuffer):取0.2g牛血消白蛋白(或脫脂奶粉)、2.0g聚乙烯吡咯烷酮[(C?H?NO).]、0.02g疊氮化鈉(NaN?),用100mL洗滌緩沖液溶解，并調(diào)整pH值到7.4,儲(chǔ)藏于3.1.7底物緩沖液(PNPBuffer):用80mL滅菌蒸餾水將0.01g氟化鎂(MgCl?)、0.02g疊氮化鈉(NaN?)、9.7mL二己醇胺(CH?CH?OH)溶解后，用鹽酸調(diào)pH值到9.8,定容到100mL,儲(chǔ)藏于4℃條件下備用。3.1.8底物溶液(PNPsubstate):將5mg對(duì)硝基苯磷酸鹽(C?HsNO?)溶解于5mL底物緩沖液中。底物溶液制備需在孵育結(jié)束前15min內(nèi)，避光條件下制備。3.1.9終止液：12g氫氧化鈉(NaOH)溶于100mL蒸餾水。23.2RT-PCR檢驗(yàn)試劑3.2.1莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(MMLV):100U/pL。3.2.21×TAE緩沖液：40mmoi/LTris-HCl,20mmol/L乙酸鈉，2mmol/LEDTA(用冰乙酸調(diào)pH至8.0)。3.2.35×RT緩沖液(5×RTBuffer):50mmol/LTis-HClpH7.5,100mmol/L氯化鈉，0.1mmol/LEDTA,10mmol/LDTT,0.01%NP-40,50%甘油。3.2.410×PCR緩沖液：100mmol/LTris-HCl(pH8.3),500mmol/L氯化鉀。3.2.6RNA酶抑制劑(RNasin):10U/μL。3.2.7RT增強(qiáng)劑(RTEhancer)。3.2.8無水乙醇(CH?CH?OH)。3.2.9RL裂解液。3.2.10去蛋白液。3.2.12dNTPMixture10mmol/L。3.2.13漂洗液。3.2.14雙蒸水(ddH?O)。3.2.152-巰基乙醇(MCE)C?H?OS。3.2.16液氮(N?)。3.2.17引物：上游引物(P1)堿基序列：5’-AGGCGCGCTAACAGAGTTCA-3’,下游引物(P2)列：5’-CTTGAATGCCGGACAGTCTG-3’,用雙蒸水稀釋至20μmol/L。3.2.19溴酚藍(lán)(CgH??Br?O?S)。3.2.20瓊脂糖凝膠：稱取1.5g瓊脂糖緩緩倒人250mL三角瓶?jī)?nèi)，加入100mL1×TAE,在微波爐中加熱1min溶解后，再加入5μLGoldview的生物染料，倒入調(diào)平并安放適當(dāng)梳齒的制膠板上，冷凝后小心拔出梳齒。4儀器及用具4.1聚乙烯微量滴定板：根據(jù)樣品數(shù)量選用40孔和96孔兩種規(guī)格。5ml五種規(guī)格及配套吸頭。4.3天平1/100g,1/1000g。4.4培養(yǎng)箱。4.5臺(tái)式高速離心機(jī)。4.6酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。4.7水平電泳儀。4.8凝膠成像系統(tǒng)。4.9PCR擴(kuò)增儀。4.11研缽：內(nèi)徑60mm～80mm。4.12剪刀。34.15渦旋混勻器。5檢測(cè)與鑒定送實(shí)驗(yàn)室作進(jìn)一步鑒定。6實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢驗(yàn)方法見附錄A。如采用認(rèn)可的試劑盒，按說明操作。樣品的制備與檢驗(yàn)方法見附錄B。如采用認(rèn)可的試劑盒，按說明操作。在陰性對(duì)照OD值≤0.1,且陽(yáng)性對(duì)照OD值大于陰性對(duì)照OD值2倍的前提下，樣品孔OD值大于陰性對(duì)照OD值2倍時(shí)，判定為陽(yáng)性反應(yīng)，即樣品帶PLRV;否則判定為陰性反應(yīng)，即樣品不帶PLRV。在陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶，且陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)222bp目標(biāo)條帶的前提下，樣品RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果8樣品保存經(jīng)檢疫鑒定后的樣品，應(yīng)在一80℃~-20℃保存3個(gè)月，以備復(fù)驗(yàn)、談判和仲裁，保存期滿后，需進(jìn)行滅活處理。4SN/T2627—2010(規(guī)范性附錄)馬鈴薯卷葉病毒DAS-ELISA檢驗(yàn)程序A.1包被抗體向酶聯(lián)反應(yīng)板每孔加入100μF用包被緩中液稀種的捕捉抗體，將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中，室溫孵育4h或4℃冰箱過夜。A.1.2洗板向每個(gè)反應(yīng)孔中加人200μL洗滌液，迅速倒出，重復(fù)2次，流板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上吸干反應(yīng)孔中殘留液體。A.2點(diǎn)樣A.2.1樣品制備品提取液究窮研磨后，再加入2mL樣品提取液嗣樣間臨注意防止樣品的交叉污染。將待測(cè)樣品剪碎，取0.3品提取液究窮研磨后，再加入2mL樣品提取液嗣樣間臨注意防止樣品的交叉污染。充分研磨至均勻。剩余樣品于-20℃冰第保存?zhèn)洳椋珹.2.2點(diǎn)樣用微量進(jìn)樣器將制備好的樣是加入是聯(lián)反屋板孔內(nèi)，每個(gè)樣品3飲重復(fù)，每孔100μL。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、馬鈴薯健康組織研磨液陰性時(shí)照和包被緩中液空由對(duì)照。加樣完成后將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容h或4℃冰箱h。A.2.3洗板在每個(gè)反應(yīng)孔加滿洗滌液，迅建倒出再加滿洗淡液，靜置3min后將洗滌液迅速倒出。重復(fù)3次。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙，吸桿反應(yīng)孔中殘留液體。A.3結(jié)合酶標(biāo)抗體A.3.1加酶標(biāo)抗體向酶聯(lián)反應(yīng)板每孔加入100μL用酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液按比例稀釋的酶標(biāo)抗體溶液。置于保濕容器中室溫孵育2h。A.3.2洗板A.4顯色每孔加入100μl.底物溶液。25℃避光孵育30min～60min,至陽(yáng)性對(duì)照顯色。5A.5終止反應(yīng)A.6結(jié)果測(cè)定和記錄用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定并記錄光密度值(OD值)。6(規(guī)范性附錄)馬鈴薯卷葉病毒的RT-PCR檢驗(yàn)程序采用TIANGENRNAprepPlantKit試劑盒”提取馬鈴薯卷葉病毒RNA。稱取50mg～100mg的馬鈴薯葉片或莖稈(薯塊需經(jīng)發(fā)芽后切取幼芽),在液氮中迅速研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移粉末至預(yù)冷的1.5mL的EP管中，加入500μL的RL裂解液(使用前按RL裂解液1mL,加入2-巰基乙醇10μL),渦旋劇烈振蕩5min使其混勻。將勻漿液轉(zhuǎn)移至CS過濾柱上，12000r/min離心2min～5min,小心吸取上清液至無RNA酶(RNase-free)的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀。緩慢加入上清0.5倍體積無水乙醇，混勻，得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入CR吸附柱中，12000r/min離心1min,離心1min,棄廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入500μL漂洗液RW,12000r/min離心1min,棄廢液，將吸附柱放回收集管中，重復(fù)漂洗一次。漂洗完后，將吸附柱在12000r/min離心2min,去除殘余液體，并在室溫下放置片刻。將吸附柱放入一個(gè)新的RNase-free離心管中，向膜中央加人50μL～100μL無RNA酶的雙蒸水，室溫放置2min,12000r/min離心2min,得到RNA溶液。B.2RT-PCR擴(kuò)增B.2.1反轉(zhuǎn)錄B.2.1.1反應(yīng)體系RT反應(yīng)體系見表B.1。表B.1馬鈴薯卷葉病毒RT反應(yīng)體系反應(yīng)物模板MMLV加人量/μL41B.2.1.2程序B.2.2PCR反應(yīng)B.2.2.1反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系見表B.2。SN/T2627—2010表B.2PCR反應(yīng)體系反應(yīng)物聚合酶氯化鎂加入量/μl.114B.2.2.2反應(yīng)程序反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3