T-SHRH 021-2019 化妝品美白功效測試 體外重組3D黑色素模型 測試方法

71.100.70C2682Y42

T/SHRH

021-2019________________________________________________________________________________________化妝品美白功效測試

3D

In

Reconstructed

skin

test

T/SHRH

021-2019 前言…………… 21

32.

規(guī)范性引用文件………… 33.

術語和定義……………… 34.

試驗原則…………………. 35.

試劑及儀器設備………… 46.

試驗步驟………………… 47.

結果計算………………… 58.

質量控制………………… 69.

結果判定………………… 6附錄

（資料性附錄）………………………

7T/SHRH

021-2019 本標準按照

GB/T1.1-2009

給出規(guī)則起草。本標準由上海日用化學品行業(yè)協(xié)會提出和歸口。本標準的某些內容可能涉及專利，本標準的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。公司、上海創(chuàng)元化妝品有限公司、福建片仔癀化妝品有限公司、東阿阿膠股份有限公司、上海綠瑞生物科技有限公司、云南貝泰妮生物科技集團股份有限公司、上海清軒生物科技有限公司、上海天祥質量技術服務有限公司、上海日用化學品行業(yè)協(xié)會。本標準主要起草人：

盧永波、李瀟、張艷云、曹平、陳田、陳靜、廖箏箏、曾四立、吳梅芳、陳貞明、謝阿貴、廖峰

、姜春鵬、趙奕竹、馬驍、王飛飛、高宏旗、朱翠翠、李瓊、金堅、陳亦華T/SHRH

021-2019化妝品美白功效測試

體外重組

黑色素模型測試方法1 范圍本標準規(guī)定了一種基于體外重組本標準適用于具有生物化學美白作用的化妝品原料及成品的美白功效測試，不適用于物理遮蓋類美白原料或成品。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682

分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法化妝品安全技術規(guī)范3 術語和定義下列術語和定義適用于本標準。3.1

體外重組

黑色素皮膚模型

reconstructed

skin

containing

采用人原代表皮角質形成細胞及黑素細胞共培養(yǎng)形成的一種復層化、高度分化的三維重建皮膚模UVB、α、

白響應。3.2

吸光度

optical

OD入射光強度與透射光強度比值的常用對數(shù)值。表示被檢測物吸收的光學密度。特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成正比關系。4 試驗原則4.1 方法簡要步驟本標準采用體外重組

?進行美白功效性測試。化妝品原料采用液下給藥方式，在氣液面培養(yǎng)的第

6

天（續(xù)給藥

6

6

第

8

2

次，單次給藥后孵育時長為

結束后，去除待測物殘留，對暴露后的體外重組

黑色素模型進行表觀色度，值，黑色素分布及黑素含量等測試。4.2 方法測試終點生物化學美白主要通過抑制黑色素的合成、阻斷黑色素的轉運及加快黑色素的代謝等機制達到美

?T/SHRH

021-2019

值用于測定待測物的亮白作用；黑素顆粒分布用于測定待測物的黑素轉運抑制作用；黑素含量用于測定待測物的黑素合成抑制作用。5 試劑及儀器設備5.1

材料及試劑5.1.1

黑色素皮膚模型（?）。5.1.2

體外重組

黑色素皮膚模型培養(yǎng)液（

培養(yǎng)液）。5.1.3

PBS

緩沖液。5.1.4

曲酸（Acid，）。5.1.5

，DMSO5.1.6

乙醇。5.1.7

乙醚。5.1.8

氫氧化鈉（NaOH5.1.9

丙二醇。5.1.10

號：）。

多聚甲醛（4%5.1.12

黑色素染色試劑盒。5.2 儀器設備5.2.1

。5.2.2 酶標儀：405nm。5.2.3 超凈工作臺。5.2.4 細胞培養(yǎng)箱：℃±1℃，5±，相對濕度。5.2.5 分析天平(精度

。5.2.6

活塞排代式移液器和相應吸頭、2μL~10μL、

100μL、20~200μL、100~1000μL

移液器及相應吸頭。5.2.7 通風柜。5.2.8 電熱恒溫水浴鍋（℃）。5.2.9 單反相機。5.2.10

色度儀。

正置顯微鏡。5.2.12

低溫高速離心機。6 試驗步驟6.1

體外重組

3D

黑色素皮膚模型的準備該步驟在超凈工作臺中進行。每輪測試中，空白對照組、陽性對照組、陰性對照組和各待測物組均需要

1

塊

6

6

mL

的

面培養(yǎng)

3

天（）的體外重組

黑色素皮膚模型轉移至無菌懸架中，置于

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（±15±1%

CO、95%

6

3

個重復模型；值、黑素含量測定需

3

個重復模型。6.2

UVB

誘導T/SHRH

021-20197天UVB50mJ/cm/次。每次輻照結束后，更換培養(yǎng)液，液量為

3.7

孔?？瞻讓φ战M不進行

養(yǎng)液，液量為

孔。6.3

給藥6.3.1

化妝品成品給藥方式在氣液面第

6

天（）和氣液面第

8

天（）進行表面給藥，給藥量為

10μL。陽性對照選用曲酸，給藥濃度為

0.05%。6.3.2

化妝品原料給藥方式從氣液面第

6

6

24h添加含

42.67μg

曲酸的

照組、空白對照組僅更換培養(yǎng)液。6.4

清洗：化妝品成品給藥全部結束后，采用超純水對皮膚模型表面清洗三次，去除受試物殘留?；瘖y品原料類給藥全部結束后，用無菌棉簽擦拭皮膚模型底面，去除受試物殘留。6.5

檢測6.5.1

表觀色度將比色卡置于單反相機正下方，用鑷子將單個模型放置于比色卡色圈內，進行拍照。單反相機參數(shù)設置為手動拍照模式，焦距調至

，孔徑設置為

，光圈調至

，快門速度設置為

1/80s，

設置為

1600。6.5.2

L*值測定用手術刀片沿模型邊緣進行環(huán)切后，用干凈的鑷子置于相片紙上，保證角質層朝上放置；色差儀

值最終讀數(shù)。6.5.4

黑素顆粒分布測定將表觀色度拍照結束后的模型，用手術刀片沿模型邊緣進行環(huán)切后，放入裝有

4%多聚甲醛溶液的

2h

5~8μm

置于正置顯微鏡下

倍物鏡下拍照，觀察黑素顆粒分布。6.5.3

黑色素含量檢測將

值測定后的模型置于

1.5mL

PBS

高速離心機

離心

，棄上清；向

離心管中依次加入

蒸餾水，500μL

無水乙醇和

500μL

，

離心

含10%DMSO

的

NaOH

80℃水浴中加熱

，用移液器吸取

200μL

至

96

孔板中，酶標儀

405nm

波長下讀取

OD

值。7 結果計算T/SHRH

021-20197.1 值根據(jù)每組三個重復模型的

值，計算平均值（Mean）及標準差（

，），結果采用

Mean±

形式表示。7.2

黑素含量以黑色素標準品的濃度為縱坐標，OD

值為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程式，將測定的OD

值代入回歸方程式，計算黑素含量。計算每組三個重復模型的黑素含量平均值及標準差，結果采用

Mean±

形式表示。7.3

黑素顆粒分布每個模型選

3

J

8 質量控制8.1

基本原則：每批次試驗均需設置空白對照、陰性對照和陽性對照。實驗中設置的各種對照應符合以下標準。如任一種對照出現(xiàn)非下述標準，則視為質控不合格。8.2

陰性對照：與空白對照組相比，表觀色度呈現(xiàn)明顯黑化，值呈現(xiàn)

10%以上下降，黑素含量呈現(xiàn)10%

值與黑素含量標準偏差均小于等于

。8.3

陽性對照：與陰性對照組相比，表觀色度呈現(xiàn)明顯變白，值呈現(xiàn)

10%以上升高，黑素含量呈現(xiàn)10%

值與黑素含量標準偏差均小于等于

。8.4

待測樣品：三個重復模型的

值與黑素含量標準偏差均小于等于

。9

結果判定以下條件說明待測物具有美白功效:與陰性對照組相比，待測物表觀色度明顯變白，值具有統(tǒng)計學顯著性差異；與陰性對照組相比，待測物黑色素顆粒分布減少，且有統(tǒng)計學顯著性差異