病原生物學(xué)第七次課-逆轉(zhuǎn)錄

病原生物學(xué)第七次課-逆轉(zhuǎn)錄匯報(bào)人：2024-01-22contents目錄逆轉(zhuǎn)錄基本概念與原理逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)與功能逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制周期與調(diào)控機(jī)制逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用contents目錄逆轉(zhuǎn)錄病毒與人類疾病關(guān)系探討實(shí)驗(yàn)方法：從RNA到cDNA再到蛋白質(zhì)表達(dá)驗(yàn)證01逆轉(zhuǎn)錄基本概念與原理以RNA為模板合成cDNA的過程，是RNA病毒的復(fù)制形式，需逆轉(zhuǎn)錄酶的催化。對(duì)RNA病毒而言，逆轉(zhuǎn)錄是其生命周期中重要環(huán)節(jié)，確保病毒遺傳信息得以傳遞和表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄定義及作用逆轉(zhuǎn)錄作用逆轉(zhuǎn)錄定義逆轉(zhuǎn)錄酶種類主要包括依賴DNA的DNA聚合酶（DDDP）和依賴RNA的DNA聚合酶（RDDP）。特性逆轉(zhuǎn)錄酶具有模板特異性，能識(shí)別并結(jié)合到RNA模板上；具有催化活性，能催化合成cDNA；對(duì)底物和反應(yīng)條件有一定要求。逆轉(zhuǎn)錄酶種類與特性逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程及條件1.引物與模板結(jié)合在適宜條件下，引物與RNA模板的特定位點(diǎn)結(jié)合。2.延伸反應(yīng)在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，以dNTP為底物，按模板序列合成cDNA鏈。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程及條件終止反應(yīng)：當(dāng)cDNA鏈合成到一定長(zhǎng)度時(shí)，反應(yīng)自然終止或加入終止劑終止反應(yīng)。1.合適的引物引物需與RNA模板特異性結(jié)合，長(zhǎng)度和序列要合適。2.適宜的pH值和溫度不同逆轉(zhuǎn)錄酶的最適pH值和溫度可能有所不同，需根據(jù)具體酶的特性進(jìn)行調(diào)整。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程及條件底物dNTP和酶的濃度需適中，以保證反應(yīng)的順利進(jìn)行。3.適量的底物和酶在逆轉(zhuǎn)錄過程中，需采取措施防止RNA模板的降解，如使用RNase抑制劑等。4.防止RNA降解逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程及條件02逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)與功能逆轉(zhuǎn)錄病毒概述逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類特殊的病毒，其遺傳物質(zhì)為RNA，但與常規(guī)RNA病毒不同的是，逆轉(zhuǎn)錄病毒在感染宿主細(xì)胞后，其RNA能夠逆轉(zhuǎn)錄成DNA，并整合到宿主細(xì)胞基因組中。逆轉(zhuǎn)錄病毒具有廣泛的宿主范圍，可以感染包括人類在內(nèi)的多種生物體，引起多種疾病，如艾滋病、貓白血病等。逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制過程包括吸附、注入、逆轉(zhuǎn)錄、整合、轉(zhuǎn)錄、翻譯和組裝等步驟。Gag蛋白是逆轉(zhuǎn)錄病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，參與病毒核心的形成。Gag蛋白具有多種功能，包括與病毒RNA結(jié)合、參與病毒顆粒的組裝和釋放等。Pol蛋白是逆轉(zhuǎn)錄病毒的另一個(gè)重要結(jié)構(gòu)蛋白，具有多種酶活性，包括逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶等。Pol蛋白在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與病毒的逆轉(zhuǎn)錄、整合和蛋白加工等過程。Env蛋白是逆轉(zhuǎn)錄病毒的外膜蛋白，負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞受體的識(shí)別和結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。Env蛋白具有糖蛋白的特性，可以形成病毒表面的刺突結(jié)構(gòu)。主要結(jié)構(gòu)蛋白及其功能輔助蛋白和調(diào)節(jié)蛋白作用Rev蛋白是逆轉(zhuǎn)錄病毒的調(diào)節(jié)蛋白之一，參與病毒RNA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。Rev蛋白能夠與病毒RNA的特定序列結(jié)合，促進(jìn)病毒RNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而確保病毒的正常復(fù)制。Tat蛋白是逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)錄激活蛋白，能夠結(jié)合到病毒RNA的特定序列上，促進(jìn)病毒的轉(zhuǎn)錄過程。Tat蛋白通過與宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活病毒的轉(zhuǎn)錄并增加病毒RNA的產(chǎn)量。Nef蛋白是某些逆轉(zhuǎn)錄病毒的輔助蛋白，具有多種生物學(xué)功能。Nef蛋白可以通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑、改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和影響免疫應(yīng)答等方式，促進(jìn)病毒的復(fù)制和傳播。03逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制周期與調(diào)控機(jī)制VS逆轉(zhuǎn)錄病毒通過其外膜蛋白與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)病毒的吸附。隨后，病毒利用宿主細(xì)胞的膜融合或內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。脫殼進(jìn)入細(xì)胞后，逆轉(zhuǎn)錄病毒在宿主細(xì)胞質(zhì)中脫去蛋白質(zhì)外殼，釋放出病毒核酸（RNA）。吸附與進(jìn)入進(jìn)入細(xì)胞及脫殼過程逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板合成cDNA。此過程中，逆轉(zhuǎn)錄酶具有校正功能，確保合成的cDNA序列的準(zhǔn)確性。DNA整合合成的cDNA在整合酶的作用下，整合到宿主細(xì)胞的基因組中，形成前病毒。整合過程具有特異性，可確保前病毒DNA穩(wěn)定地存在于宿主細(xì)胞基因組中。前病毒DNA合成及整合到宿主基因組03病毒釋放組裝完成的病毒顆粒通過宿主細(xì)胞的裂解或出芽方式釋放到細(xì)胞外，完成病毒的復(fù)制周期。01病毒基因表達(dá)前病毒DNA在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。02病毒顆粒組裝病毒的結(jié)構(gòu)蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜上組裝成新的病毒顆粒。組裝過程需要特定的酶和輔助因子的參與。表達(dá)產(chǎn)物組裝和釋放新病毒顆粒04逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用通過逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，將mRNA轉(zhuǎn)化為cDNA，構(gòu)建cDNA文庫，用于研究基因表達(dá)和功能。利用逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，將特定基因的cDNA克隆到載體中，實(shí)現(xiàn)基因的擴(kuò)增和表達(dá)，用于基因功能和疾病治療研究。cDNA文庫構(gòu)建基因克隆策略cDNA文庫構(gòu)建和基因克隆策略真核生物mRNA差異顯示技術(shù)通過逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，比較不同生理狀態(tài)或不同組織細(xì)胞中的mRNA表達(dá)差異，揭示基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制和疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。mRNA差異顯示技術(shù)研究真核生物基因表達(dá)的時(shí)空特異性、揭示疾病相關(guān)基因的表達(dá)變化、發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)等。真核生物mRNA差異顯示技術(shù)的應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，獲取基因表達(dá)譜和轉(zhuǎn)錄組信息。高通量測(cè)序技術(shù)在逆轉(zhuǎn)錄研究中的應(yīng)用研究基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化、發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本和基因、揭示轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和基因互作關(guān)系等。高通量測(cè)序技術(shù)在逆轉(zhuǎn)錄研究中的應(yīng)用05逆轉(zhuǎn)錄病毒與人類疾病關(guān)系探討感染過程HIV通過破壞人體免疫系統(tǒng)，特別是T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)崩潰，從而引發(fā)艾滋?。ˋIDS）。要點(diǎn)一要點(diǎn)二傳播途徑HIV主要通過性接觸、母嬰傳播和血液傳播。其中，無保護(hù)性行為、多個(gè)性伴侶、靜脈注射毒品等是高危行為。人類免疫缺陷病毒（HIV）感染與傳播途徑HTLV-I型可導(dǎo)致熱帶痙攣性截癱（TSP），這是一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為下肢痙攣性癱瘓、感覺和膀胱功能障礙等。HTLV-II型與HTLV-I型類似，但致病性較弱，主要引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如HTLV-II相關(guān)性脊髓?。℉AM）。HTLV-I/II型導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病分析人類T細(xì)胞白血病病毒（HTLV）除了HTLV-I/II型外，還有HTLV-III型等，它們可引起不同類型的T細(xì)胞白血病。乙型肝炎病毒（HBV）雖然HBV不是逆轉(zhuǎn)錄病毒，但它的復(fù)制過程涉及到逆轉(zhuǎn)錄酶的參與，因此也在這里提及。HBV可引起乙型肝炎，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝硬化和肝癌。其他逆轉(zhuǎn)錄病毒如貓免疫缺陷病毒（FIV）、牛免疫缺陷病毒（BIV）等，這些病毒主要感染動(dòng)物并引起類似艾滋病的疾病。雖然它們不直接感染人類，但通過對(duì)這些病毒的研究，有助于深入了解逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制機(jī)制以及與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用。其他逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)人類疾病簡(jiǎn)介06實(shí)驗(yàn)方法：從RNA到cDNA再到蛋白質(zhì)表達(dá)驗(yàn)證利用TRIzol試劑中的異硫氰酸胍等物質(zhì)，使細(xì)胞裂解并釋放出RNA，然后通過氯仿抽提和異丙醇沉淀等步驟，將RNA從細(xì)胞裂解液中分離出來。TRIzol法利用硅膠膜對(duì)RNA的特異性吸附作用，將RNA從細(xì)胞裂解液中分離出來。該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、高通量等優(yōu)點(diǎn)。硅膠膜法利用磁珠表面的寡聚T或特定序列與mRNA的3'端poly(A)尾結(jié)合，從而將mRNA從總RNA中分離出來。該方法具有特異性高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。磁珠法總RNA提取和純化方法介紹原理以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成與mRNA互補(bǔ)的cDNA第一鏈。然后以cDNA第一鏈為模板，在DNA聚合酶的作用下，合成cDNA第二鏈，從而形成雙鏈cDNA。包括逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、引物、RNA酶抑制劑、DEPC水等。將逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、引物、RNA酶抑制劑等按一定比例混合，加入適量的DEPC水，配制成反應(yīng)體系。將RNA樣品加入反應(yīng)體系中，混勻后置于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件一般為42℃60分鐘，然后70℃10分鐘終止反應(yīng)。將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化，去除多余的引物、dNTPs等雜質(zhì)。準(zhǔn)備試劑和耗材加樣和反應(yīng)cDNA純化配制反應(yīng)體系cDNA合成原理及操作步驟詳解Westernblot利用特異性抗體與目的蛋白結(jié)合，通過顯色或發(fā)光等方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于多種類型的蛋白質(zhì)表達(dá)驗(yàn)證。ELISA將特異性抗體包被于固相載體上，加入待測(cè)樣品后，通過酶標(biāo)二抗與固相抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。然后加入底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，