高效液相色譜的色譜柱的類型和流動相的選擇方法

高效液相色譜的色譜柱的類型和流動相的選擇方法一、本文概述高效液相色譜（HPLC）是一種廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域的重要分析技術(shù)。其核心組成部分——色譜柱和流動相的選擇，直接決定了分析的準(zhǔn)確性和效率。本文旨在全面介紹高效液相色譜中色譜柱的類型以及流動相的選擇方法，為研究者提供在實(shí)際操作中的參考和指導(dǎo)。我們將詳細(xì)闡述不同類型的色譜柱及其特點(diǎn)，包括正相色譜柱、反相色譜柱、離子交換色譜柱等。接著，我們將討論如何根據(jù)樣品的性質(zhì)、分析目標(biāo)以及色譜柱的類型，合理選擇流動相，以達(dá)到最佳的分離效果和分離速度。本文還將探討流動相pH值、離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑比例等因素對分離效果的影響，以及在實(shí)際操作中需要注意的事項(xiàng)。通過本文的學(xué)習(xí)，讀者將能夠更深入地理解高效液相色譜的原理和應(yīng)用，提高分析效率和準(zhǔn)確性。二、色譜柱的類型在高效液相色譜（HPLC）中，色譜柱是核心組件，其類型和特性直接影響分離效果和分析速度。選擇適當(dāng)?shù)纳V柱類型是確保分析準(zhǔn)確性和可靠性的關(guān)鍵。正相色譜柱：正相色譜柱通常使用硅膠或非極性聚合物作為填料，適用于分離極性化合物。在這些柱子上，極性較大的分子與固定相之間的相互作用更強(qiáng)，因此它們在色譜圖上會較晚洗脫出來。反相色譜柱：反相色譜柱是最常用的色譜柱類型之一，以非極性硅膠或聚合物為填料，適用于分離非極性至中等極性的化合物。這些柱子通過疏水相互作用分離化合物，非極性分子與固定相之間的相互作用較弱，因此較早洗脫。離子交換色譜柱：離子交換色譜柱通過離子交換機(jī)制分離帶電荷的化合物。這些柱子包括陽離子交換柱和陰離子交換柱，分別用于分離陽離子和陰離子化合物。尺寸排阻色譜柱：尺寸排阻色譜柱，也稱為凝膠滲透色譜柱，根據(jù)分子的尺寸和形狀進(jìn)行分離。這些柱子通常用于分離大分子，如蛋白質(zhì)和多糖。手性色譜柱：手性色譜柱用于分離立體異構(gòu)體，即具有相同化學(xué)結(jié)構(gòu)但空間排列不同的化合物。這些柱子通常用于藥物分析和手性化合物的純化。在選擇色譜柱類型時，需要考慮分析物的性質(zhì)、溶解度、極性和電荷狀態(tài)。還應(yīng)考慮分析的目的，例如是定性分析還是定量分析，以及所需的分離度和分辨率。通過仔細(xì)選擇色譜柱類型，可以優(yōu)化分析性能并提高方法的準(zhǔn)確性。三、流動相的選擇方法流動相的選擇在高效液相色譜分析中至關(guān)重要，它直接影響色譜分離的效果、分析速度以及色譜柱的使用壽命。選擇流動相時，需要綜合考慮樣品的性質(zhì)、色譜柱的類型、檢測器的性能以及分離目標(biāo)等因素。樣品性質(zhì)：了解樣品的極性、溶解度、分子量和穩(wěn)定性是選擇流動相的首要步驟。極性樣品通常需要使用極性流動相，如甲醇、乙醇或水，而非極性樣品則適合使用非極性流動相，如正己烷或環(huán)己烷。色譜柱類型：不同類型的色譜柱對流動相的要求不同。例如，反相色譜柱通常使用水或水-有機(jī)溶劑混合物作為流動相，而正相色譜柱則更適合使用非極性溶劑。分離目標(biāo)：如果目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)快速分離，可能需要選擇低粘度、高流速的流動相。如果目標(biāo)是提高分離度，可能需要選擇能夠產(chǎn)生更強(qiáng)溶劑梯度的流動相。檢測器性能：某些檢測器對流動相的組成敏感，因此選擇流動相時需要考慮檢測器的性能。例如，紫外檢測器通常要求流動相在紫外區(qū)域透明。流動相的穩(wěn)定性：流動相的化學(xué)穩(wěn)定性對于長時間的分析至關(guān)重要。應(yīng)避免使用易于氧化或分解的溶劑。環(huán)境友好性：在選擇流動相時，也應(yīng)考慮其環(huán)境友好性，盡量選擇環(huán)保型溶劑，減少對環(huán)境的污染。選擇流動相是一個需要綜合考慮多種因素的過程。在實(shí)際應(yīng)用中，可能需要進(jìn)行多次試驗(yàn)，以找到最適合特定分析的流動相。四、實(shí)際應(yīng)用案例分析在實(shí)際應(yīng)用中，高效液相色譜（HPLC）的色譜柱類型和流動相的選擇對于分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性和效率具有至關(guān)重要的影響。以下，我們將通過幾個具體的應(yīng)用案例來詳細(xì)分析色譜柱和流動相的選擇策略。在藥物分析中，色譜柱的選擇需要考慮藥物的極性和穩(wěn)定性。例如，在分離極性藥物時，常選擇硅膠或極性有機(jī)聚合物柱；對于非極性藥物，則通常選擇反相C18或C8柱。流動相的選擇則需要根據(jù)藥物的溶解度和穩(wěn)定性進(jìn)行，一般來說，水-有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈）的混合溶液是常用的流動相。在分離酸性或堿性藥物時，可能還需要加入緩沖鹽來調(diào)整流動相的pH值。在食品分析中，色譜柱和流動相的選擇需要考慮到食品成分的復(fù)雜性和多樣性。例如，在分離食品中的多糖類成分時，可以選擇氨基柱或離子交換柱；對于脂溶性成分，如脂肪酸和脂溶性維生素，則可以選擇反相柱。流動相的選擇則需要根據(jù)成分的極性和溶解度進(jìn)行，常用的流動相包括甲醇、乙腈、水和緩沖鹽等。在環(huán)境監(jiān)測中，HPLC常用于分析水中的有機(jī)污染物。在這種情況下，色譜柱的選擇需要考慮污染物的極性和穩(wěn)定性，常用的色譜柱包括反相柱和極性有機(jī)聚合物柱。流動相的選擇則需要根據(jù)污染物的溶解度和穩(wěn)定性進(jìn)行，常用的流動相包括甲醇、乙腈和水的混合溶液，有時還需要加入酸或堿來調(diào)整流動相的pH值。高效液相色譜的色譜柱類型和流動相的選擇需要根據(jù)具體的分析任務(wù)和應(yīng)用場景進(jìn)行。在實(shí)際應(yīng)用中，我們需要根據(jù)分析物的性質(zhì)、分析目的和儀器條件等因素進(jìn)行綜合考慮，以選擇最合適的色譜柱和流動相，從而獲得準(zhǔn)確、可靠的分析結(jié)果。五、結(jié)論在高效液相色譜分析中，色譜柱的類型和流動相的選擇對于實(shí)現(xiàn)最佳的分析效果至關(guān)重要。本文詳細(xì)探討了不同類型的色譜柱，包括正相色譜柱、反相色譜柱、離子交換色譜柱、尺寸排阻色譜柱以及混合模式色譜柱，并指出了它們在特定應(yīng)用中的優(yōu)勢和局限性。我們還深入討論了流動相選擇的重要性，包括其組成、pH值、離子強(qiáng)度和添加劑的影響。選擇色譜柱時，必須考慮分析物的性質(zhì)，如極性、溶解度、分子量等，以及所需的分離效果和分析時間。例如，正相色譜柱適用于分離極性較小的化合物，而反相色譜柱則更適用于極性較大的化合物。離子交換色譜柱則特別適用于分離離子型化合物，而尺寸排阻色譜柱則常用于分離大分子物質(zhì)。流動相的選擇同樣重要。合適的流動相可以確保分析物在色譜柱上的良好分離，提高分析的準(zhǔn)確性和靈敏度。在選擇流動相時，需要考慮分析物的溶解度、分離度和色譜柱的兼容性。流動相的pH值、離子強(qiáng)度和添加劑的類型和濃度也需要根據(jù)具體情況進(jìn)行優(yōu)化。高效液相色譜的色譜柱類型和流動相選擇是一個復(fù)雜而關(guān)鍵的過程，需要綜合考慮多種因素。通過了解不同類型的色譜柱和流動相的特性，以及它們在特定應(yīng)用中的表現(xiàn)，我們可以更好地進(jìn)行選擇和優(yōu)化，從而實(shí)現(xiàn)更高效、準(zhǔn)確的液相色譜分析。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，未來高效液相色譜技術(shù)將在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，為科研和工業(yè)生產(chǎn)提供有力支持。參考資料：高效液相色譜方法是在經(jīng)典液相柱色譜(即以液體作流動相的柱色譜法)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的色譜分析方法。由于它采用了平均粒徑為3～10μm且分布窄的高效固定相，因而獲得每米達(dá)數(shù)千甚至上萬塊理論塔板的分離能力。為了獲得較高的流速(1～2ml/min)，流動相必須用高壓泵輸送，因此又叫高壓液相色譜法。按照固定相的聚集狀態(tài)可分為液—固色譜法和液—液色譜法;按分離的機(jī)理可分為吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法和空間排斥色譜法;按照兩相的相對極性的大小又有正相色譜法和反相色譜法之別。應(yīng)用最廣泛的是以鍵合硅膠為固定相、以甲醇—水或乙腈—水為流動相的反相高效液相色譜法。常用的檢測器有折光檢測器、紫外一可見分光光度檢測器、熒光檢測器、電導(dǎo)檢測器等。與氣相色譜法相比，它的主要優(yōu)點(diǎn)是可以在較低的溫度下操作，除氣體和揮發(fā)性液體物質(zhì)以外，所有可溶于溶劑中的化合物均可作為液相色譜的樣品，尤其對那些不適于氣相色譜分析的熱不穩(wěn)定性物質(zhì)、離子性物質(zhì)和高分子量物質(zhì)的分析更有實(shí)際意義。在工業(yè)原料、農(nóng)藥、染料、維生素、氨基酸、核酸、藥品、天然有機(jī)物、生物樣品、生物體代謝物、血液和血清、合成高分子等樣品的分析中得到了廣泛的應(yīng)用。反相高效液相色譜（RP-HPLC）是生物醫(yī)藥、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的分離分析技術(shù)之一。流動相作為RP-HPLC的重要組成成分，其選擇與優(yōu)化對分離效果和檢測靈敏度具有決定性影響。本文將對反相高效液相色譜中流動相選擇與優(yōu)化的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。在RP-HPLC中，常用的流動相是甲醇、乙腈和水，以及它們的混合物。為了提高分離效果和檢測靈敏度，常加入有機(jī)添加劑如庚烷磺酸鈉、檸檬酸等。近年來，隨著超高效液相色譜的發(fā)展，極性有機(jī)溶劑如乙腈成為了流動相的主流選擇。離子對試劑的應(yīng)用也日益廣泛，如庚烷磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉等。這些離子對試劑可以與目標(biāo)分析物形成離子對，從而提高目標(biāo)分析物的保留能力和分離效果。流動相的優(yōu)化是提高RP-HPLC分離效果和檢測靈敏度的關(guān)鍵。近年來，科研人員針對流動相的優(yōu)化開展了大量研究工作。其中，最常用的方法是Box-Behnken設(shè)計(jì)（BBD）和響應(yīng)面法（RSM）。這些方法可以以較低的成本和較短的時間找出最佳的流動相條件。同時，也有一些學(xué)者嘗試?yán)萌斯ど窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）、遺傳算法（GA）等智能算法進(jìn)行流動相優(yōu)化。這些方法可以處理多變量、非線性問題，為流動相優(yōu)化提供了新的思路。反相高效液相色譜中流動相的選擇與優(yōu)化是提高分離效果和檢測靈敏度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來，隨著超高效液相色譜的發(fā)展和智能算法的應(yīng)用，流動相優(yōu)化取得了顯著進(jìn)展。未來，隨著技術(shù)的進(jìn)步和應(yīng)用需求的增加，流動相選擇與優(yōu)化將更加精細(xì)化和智能化，為生命科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等領(lǐng)域的研究提供更加有力的支持。液相色譜柱，是一種用于液體色譜分析儀器，有柱管、壓帽/卡套、篩板（濾片）等組成。硅膠基質(zhì)-pH2-8-----------------高或低pH下，硅膠會溶解Al2O3·nH2O-pH1-14----------化學(xué)修飾困難聚合物基質(zhì)-pH1-14-------------孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜，孔徑不均勻?qū)е轮Р粔蚋?，有機(jī)溶劑可能導(dǎo)致聚合物基質(zhì)溶漲而受損表面積---------顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和，以m2/gram表示孔徑------------顆粒的孔或腔的平均尺寸，范圍80-300?;封端------------鍵合步驟之后，用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來在選擇色譜柱之前，先多了解自己的樣品和雜質(zhì)，他們的類型結(jié)構(gòu)、極性、酸堿性、分子量大小等等。樣品是極性的且弱酸性的；就可以選擇C18在100%酸性水溶液條件下檢測，即要選擇承受100%純水且對極性化合物保留很好的色譜柱如果樣品極性太強(qiáng)，或酸性太強(qiáng)；可以選擇CN，NH2，或硅膠柱，HILIC（親水色譜），也有使用C18+強(qiáng)陰離子對試劑或強(qiáng)陰離子交換色譜柱（缺點(diǎn)是離子對試劑平衡時間長，對流動相pH要求比較精密，否則很難重復(fù)實(shí)驗(yàn)，另外離子對試劑很難洗下來，基本上用了離子對的色譜柱就不能再用于其它實(shí)驗(yàn)）若樣品是堿性的；可選擇高純硅膠柱（高純硅膠缺少金屬雜質(zhì)，且硅膠端基封尾）或一些經(jīng)過修飾的C18柱（如極性嵌入技術(shù)或堿去活技術(shù)等），他們都會減少堿性化合物的拖尾，一般會選擇中性或偏堿的條件下做，因?yàn)檫@樣可增加堿性樣品的保留如果堿性化合物的極性太強(qiáng)，或堿性太強(qiáng)；可以選擇寬pH的C18色譜柱在高pH值檢測（優(yōu)點(diǎn)是方法開發(fā)簡單，缺點(diǎn)是目前實(shí)現(xiàn)這一技術(shù)的色譜柱品牌比較少，價格也高）或者選用HILIC色譜柱（硅膠柱在反相條件下使用，這也是很經(jīng)典的檢測堿性樣品的方法）選擇強(qiáng)離子交換柱（缺點(diǎn)是不能用來分析其它樣品，對流動相pH要求比較精密，否則很難重復(fù)實(shí)驗(yàn)）也有使用C18+強(qiáng)陰離子對試劑或強(qiáng)陰離子交換色譜柱高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用。1903年俄國植物化學(xué)家茨維特（Tswett）首次提出“色譜法”（Chromatography）和“色譜圖”（Chromatogram）的概念。茨維特使用色譜法chromatography（來自希臘字，chroma意思是顏色，graphy意思是記錄-直譯為顏色記錄）來描述他的彩色試驗(yàn)。（令人好奇的是,俄羅斯名字茨維特意思是顏色。）他在論文中寫到：“（原文）一植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，后用純石油醚淋洗，結(jié)果按照不同色素的吸附順序在管內(nèi)觀察到它們相應(yīng)的色帶，就象光譜一樣，稱之為色譜圖?！?930年以后，相繼出現(xiàn)了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術(shù)。1952年，英國學(xué)者M(jìn)artin和Synge基于他們在分配色譜方面的研究工作，提出了關(guān)于氣－液分配色譜的比較完整的理論和方法，把色譜技術(shù)向前推進(jìn)了一大步，這是氣相色譜在此后的十多年間發(fā)展十分迅速的原因。1958年，基于Moore和Stein的工作，離子交換色譜的儀器化導(dǎo)致了氨基酸分析儀的出現(xiàn)，這是近代液相色譜的一個重要嘗試，但分離效率尚不理想。1960年中后期，氣相色譜理論和實(shí)踐發(fā)展，以及機(jī)械、光學(xué)、電子等技術(shù)上的進(jìn)步，液相色譜又開始活躍。到60年代末期把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC。1970年中期以后，微處理機(jī)技術(shù)用于液相色譜，進(jìn)一步提高了儀器的自動化水平和分析精度。1990年以后，生物工程和生命科學(xué)在國際和國內(nèi)的迅速發(fā)展，為高效液相色譜技術(shù)提出了更多、更新的分離、純化、制備的課題，如人類基因組計(jì)劃，蛋白質(zhì)組學(xué)有HPLC作預(yù)分離等。①高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。②高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時。③高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。⑤應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。⑦樣品量少、容易回收：樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長，相互補(bǔ)充。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。1．吸附色譜法(AdsorptionChromatography)2．分配色譜法(PartitionChromatography)4．分子排阻色譜法/凝膠色譜法(SizeExclusionChromatography)5．鍵合相色譜法（bonded-phasechromatography）6．親和色譜法(AffinityChromatography)可分為“高壓輸液泵”、“色譜柱”、“進(jìn)樣器”、“檢測器”、“餾分收集器”以及“數(shù)據(jù)獲取與處理系統(tǒng)”等部分。液相色譜和質(zhì)譜連接，可以增加額外的分析能力，能夠準(zhǔn)確鑒定和定量像細(xì)胞和組織裂解液，血液，血漿，尿液和口腔液等復(fù)雜樣品基質(zhì)中的微量化合物。高效液相色譜質(zhì)譜系統(tǒng)（ABSciexEksigentLC/MS和LC/MS/MS）提供了一些獨(dú)特的優(yōu)勢，包括：流量穩(wěn)定（±1)，耐高壓(30～60Mpa)，耐各種流動相：例如：有機(jī)溶劑、水和緩沖液；如果所進(jìn)行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做其它波譜鑒定，或獲取少量試驗(yàn)樣品的小型制備，餾分收集是必要的；(Liquid-liquidPartitionChromatography)及化學(xué)鍵合相色譜(ChemicallyBondedPhaseChromatography)流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應(yīng)互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時，服從于高效液相色譜計(jì)算公式：式中，cs—溶質(zhì)在固定相中濃度；cm—溶質(zhì)在流動相中的濃度；Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。a.正相液-液分配色譜法(NormalPhaseliquidChromatography):流動相的極性小于固定液的極性。b.反相液-液分配色譜法(ReversePhaseliquidChromatography):流動相的極性大于固定液的極性。c.液-液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機(jī)械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相（見后），可克服上述缺點(diǎn)。流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進(jìn)行分離的。其作用機(jī)制是：當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱時，溶質(zhì)分子()和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發(fā)生競爭吸附（未進(jìn)樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S)，可表示如下：mnSa======anSm式中：m--流動相中的溶質(zhì)分子；Sa--固定相中的溶劑分子；a--固定相中的溶質(zhì)分子；Sm--流動相中的溶劑分子。IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：-（溶劑中）(樹脂-R4NCl-)===（樹脂-R4N-)Cl-（溶劑中）凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進(jìn)行分離。離子對色譜法是將一種(或多種)與溶質(zhì)分子電荷相反的離子(稱為對離子或反離子)加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。其原式中：水相--流動相中待分離的有機(jī)離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；Y---形成的離子對化合物。離子對色譜法（特別是反相）解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。用離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動相。以電導(dǎo)檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對電導(dǎo)檢測器的干擾，設(shè)置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同。以陰離子交換樹脂(R-OH)作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當(dāng)待測陰離子Br-隨流動相(NaOH)進(jìn)入色譜柱時，發(fā)生如下交換反應(yīng)（洗脫反應(yīng)為交換反應(yīng)的逆過程）：可見，通過抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電導(dǎo)值很小的水，消除了本底電導(dǎo)的影響；試樣陰離子Br-則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸HBr-，可用電導(dǎo)法靈敏的檢測。(StericExclusionChromatography)空間排阻色譜法以凝膠(gel)為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進(jìn)行分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。流程：如圖1所示，溶劑貯器⑴中的流動相被泵⑵吸入，經(jīng)〔3〕梯度控制器按一定的梯度進(jìn)行混合然后輸出，經(jīng)⑷測其壓力和流量，導(dǎo)入(5進(jìn)樣閥（器）經(jīng)⑹保護(hù)柱、⑺分離柱后到⑻檢測器檢測，由⑽數(shù)據(jù)處理設(shè)備處理數(shù)據(jù)或⑾記錄儀記錄色譜圖，⑿餾分收集器收集餾分，⒀為廢液。色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elutionprofile)?；€(baseline)——經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達(dá)到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時間軸。噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測器時響應(yīng)的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少見?！吨袊幍洹芬?guī)定fn=95~05為正常峰，fn<95為前延峰，fn>05為拖尾峰。峰寬（peakwidth，W)—峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個交點(diǎn)間的距離。W=4σ半峰寬（peakwidthathalf-height，Wh/2)—峰高一半處的峰寬。Wh/2=355σ保留時間(retentiontime，tR)——從進(jìn)樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R≥5稱為完全分離。拖尾因子(tailingfactor，T)——T=，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetryfactor)或不對稱因子(asymmetryfactor)。應(yīng)按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，常用的色譜柱填料有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用辛基鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用于分子排阻色譜等。注樣量一般為數(shù)微升。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。在用紫外吸收檢測器時，所用流動相應(yīng)符合紫外分光光度法項(xiàng)下對溶劑的要求。正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變。以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。按各品種項(xiàng)下要求對儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度和拖尾因子.在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n=54^2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)，如果測得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。定量分析時，為便于準(zhǔn)確測量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。分離度(R)的計(jì)算公式為：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)，式中t(R2)為相鄰兩峰中后一峰的保留時間；t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。除另外有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于5。為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰高法測量時，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計(jì)算公式為：T(拖尾因子)=W05h/2d1式中W(05h)為05峰高處的峰寬；d1為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外,T應(yīng)在95～05間。也可按各品種校正因子測定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次，計(jì)算平均校正因子，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于0%。定量測定時，可根據(jù)樣品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內(nèi)標(biāo)法測定雜質(zhì)總量時，須采用峰面積法。測定供試品（或經(jīng)衍生化處理的供試品）中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計(jì)算各雜質(zhì)峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計(jì)算在內(nèi)。色譜圖的記錄時間應(yīng)根據(jù)各品種所含雜質(zhì)的保留時間決定，除另有規(guī)定外可為該品種項(xiàng)下主成分保留時間的倍數(shù)。當(dāng)雜質(zhì)峰面積與成分峰面積相差懸殊時，采用主成分自身對照法。在測定前，先按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測器的靈敏度或進(jìn)樣量，使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準(zhǔn)確測量要求。然后取供試品溶液，進(jìn)樣，記錄時間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時間的倍數(shù)。根據(jù)測得的供試品溶液的各雜質(zhì)峰面積及其總和并和對照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)限度。采用不加校正因子的峰面積法。取供試品，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制不含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖Ⅰ；再配制含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，在同樣的條件下注樣，記錄色譜圖Ⅱ。記錄的時間除另有規(guī)定外，應(yīng)為該品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)峰保留時間的倍數(shù)，色譜圖上內(nèi)標(biāo)峰高應(yīng)為記錄儀滿標(biāo)度的30%以上，否則應(yīng)調(diào)整注樣量或檢測器靈敏度。如果色譜圖Ⅰ中沒有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標(biāo)峰保留時間相同的雜質(zhì)峰，則色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰面積之和應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積（溶劑峰不計(jì)在內(nèi)）。如果色譜圖Ⅰ中有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰保留時間相同的雜質(zhì)峰，應(yīng)將色譜圖Ⅱ上的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積減去色譜圖Ⅰ中此雜質(zhì)峰面積，即為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積；色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰總面積加色譜圖Ⅰ中此雜峰面積，即為各雜質(zhì)峰的校正總面積，各雜質(zhì)峰的校正總面積應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積。按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子：As/ms]校正因子f=-Ar/mr式中As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高,Ar為對照品的峰面積或峰高；ms為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的量mr為加入對照品的量。再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品（或其雜質(zhì)）峰和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：Ax含量(mx)=f×-As/ms式中Ax為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高；mx為供試品（或其雜質(zhì)）的量。f、As和ms的意義同上。當(dāng)配制校正因子測定用的對照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液使用同一分內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液時，則配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液不必精密稱（量）取。按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計(jì)算含量：由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測定供試品中某雜質(zhì)或主成分含量時，以定量環(huán)進(jìn)樣為好。要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是樣品的相對分子質(zhì)量的大小，在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。對于相對分子質(zhì)量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。相對分子質(zhì)量在200~2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質(zhì)量高于2000，則可用空間排阻色譜法。水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對非極性的混合物，可用液-固色譜法。若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機(jī)螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應(yīng)用于離子化合物；異構(gòu)體的分離可用液固色譜法；具有不同官能團(tuán)的化合物、同系物可用液液分配色譜法；對于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。HPLC的出現(xiàn)不過三十多年的時間，但這種分離分析技術(shù)的發(fā)展十分迅猛，應(yīng)用十分廣泛。其儀器結(jié)構(gòu)和流程多種多樣。典型的高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)和流程可用下列方框圖表示(SeeFig.3-4)。高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置（用雙泵）、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、恒溫器、記錄儀等主要部件。高效液相色譜更適宜于分離、分析高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質(zhì)，因而廣泛應(yīng)用于核酸、肽類、內(nèi)酯、稠環(huán)芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產(chǎn)物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲劑、除銹劑的分析等物質(zhì)的分析。HPLC使用的色譜柱是很細(xì)的(1~6mm)，所用固定相的粒度也非常?。◣爪蘭到幾十μm)，所以流動相在柱中流動受到的阻力很大，在常壓下，流動相流速十分緩慢，柱效低且費(fèi)時。為了達(dá)到快速、高效分離，必須給流動相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動速度。為此，須用高壓泵進(jìn)行高壓輸液。高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。HPLC使用的高壓泵應(yīng)滿足下列條件：a.流量恒定，無脈動，并有較大的調(diào)節(jié)范圍（一般為1~10mL/min)；c.有較高的輸液壓力；對一般分離，60×10^5Pa的壓力就滿足了，對高效分離，要求達(dá)到150~300×10^5Pa。當(dāng)柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時，流動相進(jìn)入的單向閥（下部）關(guān)閉，這時就輸出少量的流體。反之，當(dāng)柱塞向外拉時，流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關(guān)閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。這種泵的特點(diǎn)是不受整個色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動相。其工作原理是：壓力為p1的低壓氣體推動大面積（SA）活塞A，則在小面積（SB）活塞B輸出壓力增大至p2的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于A和B兩活塞的面積比，如果A與B的面積之比為50:1，則壓力為5×Pa的氣體就可得到壓力為250×Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵。類似于GC中的程序升溫。已成為現(xiàn)代高效液相色譜中不可缺少的部分。梯度洗提，就是載液中含有兩種（或更多）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。梯度洗提可以分為兩種：a.低壓梯度（也叫外梯度）：在常壓下，預(yù)先按一定程序?qū)煞N或多種不同極性的溶劑混合后，再用一臺高壓泵輸入色譜柱。b.高壓梯度(或稱內(nèi)梯度系統(tǒng))：利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按設(shè)定的比例送入梯度混合室，混合后，進(jìn)入色譜柱。⑴注射器進(jìn)樣裝置：進(jìn)樣所用微量注射器及進(jìn)樣方式與GC法一樣。進(jìn)樣壓力150×10^5Pa時，必須采用停流進(jìn)樣。⑵高壓定量進(jìn)樣閥：與GC法用的流通法相似，能在高壓下進(jìn)樣。色譜柱是色譜儀最重要的部件（心臟）。通常用厚壁玻璃管或內(nèi)壁拋光的不銹鋼管制作的，對于一些有腐蝕性的樣品且要求耐高壓時，可用銅管、鋁管或聚四氟乙烯管。柱子內(nèi)徑一般為1～6mm。常用的標(biāo)準(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為6或9mm，長度為15～30cm的直形不銹鋼柱。填料顆粒