開發(fā)酶的底物非特異性轉(zhuǎn)化多羥基化合物生產(chǎn)1-烷醇和1-n-烷二醇的研究

開發(fā)酶的底物非特異性轉(zhuǎn)化多羥基化合物生產(chǎn)1-烷醇和1,n-烷二醇的研究1-烷醇和1,n-烷二醇(C4-C6)作為重要的的通用化學(xué)品,在能源、化工和材料等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用,然而它們大多不能由微生物自發(fā)的合成,開發(fā)1-烷醇和1,n-烷二醇的人工途徑具有重要的意義。多羥基化合物在自然界中廣泛存在,且它們具有和1-烷醇及1,n-烷二醇相似的結(jié)構(gòu),這激發(fā)我們尋找能夠減少多羥基化合物中的羥基數(shù)目的酶,從而實現(xiàn)從多羥基化合物到1-烷醇和1,n-烷二醇的生物轉(zhuǎn)化。鑒于甘油脫水酶和二醇脫水酶在1-丙醇和1,3-丙二醇的合成中起著重要作用,因此本課題從甘油脫水酶和二醇脫水酶出發(fā),利用蛋白質(zhì)工程開發(fā)其底物非特異性,實現(xiàn)了從長碳鏈多元醇到1-烷醇和1,n-烷二醇的生物轉(zhuǎn)化。以下是本論文的主要內(nèi)容和結(jié)論:首先,研究了甘油脫水酶和二醇脫水酶催化四碳多元醇的潛能。異源表達了四個不同來源的脫水酶,結(jié)合酶學(xué)實驗和產(chǎn)物檢測證實了脫水酶無法有效催化赤蘚糖醇。然后對其中兩個脫水酶進行突變,獲得了1,2,4-丁三醇催化活性顯著提高的突變體,并且利用全細胞催化證實了從1,2,4-丁三醇到1,4-丁二醇轉(zhuǎn)化的可行性。其次,研究了甘油脫水酶和二醇脫水酶催化1,2-丁二醇、1,2,4-丁三醇、赤蘚糖醇、1,2-戊二醇、1,2,5-戊三醇和1,2,6-己三醇的潛能。體外酶學(xué)實驗和產(chǎn)物檢測證實野生型甘油脫水酶可以催化1,2,5-戊三醇,野生型二醇脫水酶能夠催化1,2-戊二醇和1,2,5-戊三醇。將兩個脫水酶突變后,突變體催化上述六種多元醇的能力均有不同程度的增強。第三,在大腸桿菌中構(gòu)建了從赤蘚糖醇到1,4-丁二醇,從1,2-戊二醇到1-戊醇和從木糖到1,4-丁二醇的生物途徑。其中含有甘油脫水酶突變體的三條途徑分別生產(chǎn)16.1mg/L1,4-丁二醇,12.8mg/L1-戊醇和48.9mg/L1,4-丁二醇;含有二醇脫水酶突變體的三條途徑分別生產(chǎn)11.9mg/L1,4-丁二醇,137.8mg/L1-戊醇和51.8mg/L1,4-丁二醇。此外,測定甘油脫水酶和二醇脫水酶催化1,2,4-丁三醇的動力學(xué)參數(shù),其中甘油脫水酶突變體和二醇脫水酶突變體的Km值分別為34.14mM和1.04mM;二者的kcat值分別為0.21s-1和0.39s-1。最后,進一步研究甘油脫水酶催化四碳多元醇的特性。首先研究菌體濃度、溫度、底物濃度和pH對重組菌轉(zhuǎn)化赤蘚糖醇合成1,4-丁二醇的影響。結(jié)果顯示,1,4-丁二醇的濃度隨菌體濃度、底物濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,低溫和弱堿性對1,4-丁二醇的合成有利。在最佳條件下,1,4-丁二醇的濃度為34.5mg/L,相比于未優(yōu)化條件,產(chǎn)物濃度上升了近6倍。然后研究甘油脫水酶催化赤蘚糖醇異構(gòu)體的活性和1.2,4-丁三醇異構(gòu)體的動力學(xué)特性,證實突變體催化L-蘇糖醇的酶活顯著高于赤蘚糖醇和D-蘇糖醇。突變體對三種1,2,4-丁三醇具有相似的催化速率,但是對(R)-1,2,4-丁三醇的Km值明顯高于(S)-1,2,4-丁三醇和1,2,4-丁三醇,這些數(shù)據(jù)將為后續(xù)的計算機模擬提供數(shù)據(jù)支持。許多重要化合物由于缺乏相關(guān)的酶,無法實現(xiàn)生物合成,因此構(gòu)建其代謝途徑的關(guān)鍵是挖掘基因,而開發(fā)酶的非特異性是一種有效的策略。本課題從甘油脫水酶和二醇脫水酶出發(fā),對其底物非特異