利用甲烷氧化混合菌生物合成聚β-羥基丁酸酯

利用甲烷氧化混合菌生物合成聚β-羥基丁酸酯聚p-羥基丁酸酯(PHB)是大多數(shù)細菌細胞內(nèi)碳源和能源的儲備物,具有生物可降解性,熱塑性,且透氧率低,用作食品包裝用膜、袋,飲料用包裝內(nèi)襯層和生鮮食品盤等,更利于食品的儲藏運輸,在食品包裝領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景,日益受到人們的關(guān)注。目前,PHB的商業(yè)化生產(chǎn)主要基于野生菌和基因工程菌的純菌種發(fā)酵工藝,嚴(yán)格控制的無菌底物和生產(chǎn)環(huán)境導(dǎo)致了較高的生產(chǎn)成本,從而限制了生物塑料PHB的大規(guī)模應(yīng)用,特別是在食品包裝中的應(yīng)用。富集高產(chǎn)PHB、組成穩(wěn)定的混合菌在開放條件下,以甲烷甲醇等一碳化合物生產(chǎn)PHB成為目前實現(xiàn)PHB在食品包裝領(lǐng)域中規(guī)模化應(yīng)用最具前景的研究課題。本學(xué)位論文利用從黑龍江省大慶油田富含沼氣地區(qū)的土壤中培養(yǎng)篩選獲得的甲烷氧化混合菌,以甲烷為碳源通過好氧瞬時供料方式(充盈-饑餓交替),篩選掉其中PHB含量少的菌株,對菌群中開放條件下穩(wěn)定高產(chǎn)PHB的甲烷氧化菌進行了富集。通過甲烷氧化混合菌的結(jié)構(gòu)解析,對菌群中分離純化的非甲烷氧化菌和甲烷氧化菌的生長和催化性能的初步探索,以及優(yōu)化細胞培養(yǎng)環(huán)境,高密度甲烷氧化混合菌發(fā)酵培養(yǎng)方式的探索,建立了開放條件下以廉價碳源穩(wěn)定合成PHB的方法。(1)根據(jù)甲烷氧化混合菌細胞生長規(guī)律,建立基于Logistic模型的細胞生長動力學(xué)模型：經(jīng)對比驗證結(jié)果表明,對于不同的培養(yǎng)條件,該動力學(xué)模型對細胞生長密度(用吸光度OD600表示)的計算值與實驗值之間都具有較好的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)均達到92%以上。這表明應(yīng)用"Logistic模型”建立的動力學(xué)模型對甲烷氧化混合菌具有較好的適用性,可以進行實際工作中的模擬研究,該模型中各參數(shù)和特征值隨培養(yǎng)條件而變化,適用于發(fā)酵條件優(yōu)化控制,為后續(xù)細胞高密度培養(yǎng)提供指導(dǎo)。(2)采用充盈-饑餓(feast-faminecycle)模式間歇供料,以甲烷為底物好氧開放式培養(yǎng)甲烷氧化混合菌,利用蘇丹黑染色法動態(tài)檢測充盈和饑餓階段胞內(nèi)PHB含量變化,實現(xiàn)了菌群中高PHB存儲能力的甲烷氧化菌的富集和穩(wěn)定傳代。結(jié)果顯示,在充分供氧條件下,充盈培養(yǎng)5d,饑餓培養(yǎng)15d,循環(huán)培養(yǎng)5次,PHB含量從10.8%增加到36.6%,且富集后甲烷氧化混合菌經(jīng)過開放條件下連續(xù)傳代培養(yǎng),細胞生長和PHB合成穩(wěn)定,表明甲烷氧化混合菌具有菌群組成穩(wěn)定性,適于PHB工業(yè)化生產(chǎn)。(3)通過對富集后的甲烷氧化混合菌進行菌群結(jié)構(gòu)及生長生長特性分析,推測了混合菌體系中不同微生物間的協(xié)同作用機理：甲基彎菌JW和JC能以甲烷、甲醇作為碳源生長,并為伴生菌提供從甲烷、甲醇得到的代謝碳供伴生菌生長,伴生菌的存在可以及時利用代謝中間產(chǎn)物有效避免產(chǎn)物抑制,同時為甲基彎菌JW和JC提供生長因子,促進細胞生長。甲烷氧化混合菌分離出來的重要成員甲基彎菌JC能高效利用甲醇生長,能增強甲烷氧化混合菌對甲醇的耐受性,促使混合菌體系無需馴化直接利用甲醇為碳源生長,避免由于甲烷在培養(yǎng)基中溶解度低而導(dǎo)致細胞生長慢的問題,為高密度培養(yǎng)打下基礎(chǔ)?；谖锓N間的自然選擇和競爭,以碳饑餓作為選擇壓力,通過甲烷為碳源短期充盈(5d)長期饑餓(15d)循環(huán)交替的富集方式,形成了能長期耐受碳饑餓的高PHB存儲能力的甲烷氧化菌-伴生菌共生的微生態(tài)系統(tǒng),其在開放條件下也不易受到雜菌的污染,更具環(huán)境適應(yīng)性而長期穩(wěn)定生長并積累PHB。(4)在掌握了細胞的基本生長規(guī)律和胞內(nèi)PHB積累能力的基礎(chǔ)上,利用富集后的甲烷氧化混合菌以廉價碳源甲烷、甲醇生長的優(yōu)勢,通過調(diào)整碳源供給、培養(yǎng)基組成等手段優(yōu)化胞外生長環(huán)境促進胞內(nèi)PHB積累,以少量甲醇的加入在原有基礎(chǔ)上大幅提高了細胞產(chǎn)量及胞內(nèi)PHB的積累能力。對營養(yǎng)平衡-營養(yǎng)受限兩階段培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)時間的實驗結(jié)果表明,在相同的碳源補加方式下,優(yōu)化后的營養(yǎng)平衡(培養(yǎng)6d)-營養(yǎng)受限(培養(yǎng)6d)的兩段式培養(yǎng)方式不僅可以明顯提高PHB的含量,最高可達61.5%,而且并沒有完全抑制細胞生長,細胞干重達到1.35g/L,實現(xiàn)了細胞生長密度和單位細胞PHB積累量的提高,在一定程度上解決了細胞生長與PHB積累的矛盾。(5)甲烷氧化混合菌可在開放條件下利用甲醇代替甲烷做為唯一碳源生長并在細胞內(nèi)合成PHB,且甲醇能夠較大程度的促進菌體生長和PHB的胞內(nèi)積累。通過對富集后甲烷氧化混合菌在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中細胞生長動力學(xué)的研究,以延滯期和最大比增長速度為依據(jù),對發(fā)酵罐的碳源補加量和補加方式進行優(yōu)化,建立提高PHB產(chǎn)量為目的甲醇流加策略,通過分批補加不同濃度碳源(甲醇),解除高濃度甲醇的抑制作用,為菌體生長和PHB的胞內(nèi)合成提供適宜的碳源利用環(huán)境,從而明顯縮短發(fā)酵時間,提高甲烷氧化混合菌胞內(nèi)PHB的