DB13-T1778-2013魚類鏈球菌病診斷技術(shù)規(guī)范

ICS67.120.30B50

DB13河 北 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB13/T1778—2013魚類鏈球菌病診斷技術(shù)規(guī)范Thenormofdiagnosistechniquestreptococcicosisinfish20132013090520130930河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB13/T1778—2013DB13/T1778—2013前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北省水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治監(jiān)測總站。薛政。IIDB13/T1778—2013DB13/T1778—2013DB13/T1778—20135培養(yǎng)基和試劑DB13/T1778—20135培養(yǎng)基和試劑魚類鏈球菌病診斷技術(shù)規(guī)范范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了魚類鏈球菌病的診斷方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于魚類鏈球菌病病原菌的鑒定及本病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷、檢疫和監(jiān)測。（）GB/T4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.13.1病原菌鏈球菌（Streptococcus）（Streptococcus（Streptococcusagalactiae）（Streptococcusmillieri）（Streptococcusparauberis）（Streptococcusdysgalactiae）乳鏈球菌是引起魚類鏈球菌病的主要病原菌。4設(shè)備和材料a)b)顯微鏡：10×～100×。滅菌乳缽。0.1g。PCR電泳儀。1培養(yǎng)基和試劑包括：GB/T6682Todd-HewittTHB)。GB/T4789.2875％酒精。GB/T4789.283％H2O2（）。TaqDNAh)酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）。瓊脂糖。溴化乙錠（EB）。dNTP：dATP、dCTP、dGTPdTTP10mmol/L。PCR639bp10μmol/LDNA（Marker）。DNA（Marker）。-20℃。6診斷步驟外部檢查l解剖檢查涂片檢查用75%（GB/T4789.282脂平板。25g225mLTHB24±2h28℃24h2h，48hβ0.2μm～1.0μm按GB/T4789.28（見附錄A.2）于10℃培養(yǎng)（PCR）本方法與6.4的方法可任選其一。取樣1.0g5.0mLTEA.3DNA90μL1.5mL10μL(10mg/mL),37℃水浴1hK5μL(20mg/mL),371h，加入RNA10μL(10mg/mL),3730min,150μL25∶24∶1)312000r/minmin，100μLTEPCRDNA，4也可以使用能夠達(dá)到同種效果的商業(yè)化細(xì)菌DNA提取試劑盒。PCRPCR50μL，10×PCRbuffer5μL，MgCl2（25mmol/L）4μL，dNTPs（μL，E1、E2（10μmol／L）1μL，TaqDNA（5Ｕ/μL）0.5μL，模板DNA2μL，35.5μL。PCR：945min；94℃1min，58℃退火45s，72℃1min，共35循環(huán)；72℃延伸10min，最后4℃保溫。每次反應(yīng)應(yīng)設(shè)立陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。將海豚鏈球菌或無乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于THB增菌液中，28℃培養(yǎng)18h～24h，搖勻后取1mL，用無菌生理鹽水稀釋至106～108CUF/mL（約麥?zhǔn)媳葷岫?.4），按6.5.2的方法提取細(xì)菌DNA做為PCR反應(yīng)的陽性模板。以DNA提取液代替陰性對(duì)照模板。以水替代空白對(duì)照模板。3DB13/T1778—2013DB13/T1778—2013DB13/T1778—2013DB13/T1778—2013PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑也可以使用能夠達(dá)到同種效果的商業(yè)化PCR擴(kuò)增試劑盒。（A.4）1.50.5μg/mLEB6μL2μL6）DNA（Marker）。5V/cm45min用紫外分析儀或紫外觀察燈觀察瓊脂糖凝膠；Marker639bp639bp如在639bp位置無條帶，或條帶不在此位置，則判定為鏈球菌陰性。7綜合判定具有6.1、6.2、6.3全部或部分癥狀，并且病原菌經(jīng)6.4或6.5鑒定為鏈球菌，判定為魚類鏈球菌病。44附錄A（規(guī)范性附錄）試劑配制標(biāo)準(zhǔn)中所用試劑，除特別注明外，均采用分析純試劑。Todd-Hewitt肉湯（THB)牛肉膏5.0g胰蛋白胨20.0g葡葡糖2.0g碳酸鈉2.5g氯化鈉2.0g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)0.4g蒸餾水1000ml將以上各成份混合煮沸，完全溶化，冷卻至室溫后，調(diào)pH，于115℃滅菌10min，最終pH為7.8。營養(yǎng)肉湯蛋白陳蛋白陳10g3g5g1000mLH至7.4225，121℃高壓滅菌15i。A.31×TE1MTris-HCl（PH=8.0）0.5MEDTA（PH=8.0）5ml1ml500l40L00l后，高溫高壓滅菌；室溫保存。A.45×TBE電泳緩沖液Tris硼酸（HBO3EDTA水54g27.5g2.922g1000mL5mol/L（HCl）pH8.3，5EB(ethidiumbromide用水配制成10mg/mL的濃縮液，用時(shí)每10mL電泳液或瓊脂糖中加1μL。上樣緩沖液每100mL水溶液中含溴酚藍(lán)0.25g，蔗糖40g。66附錄B（資料性附錄）鏈球菌（EF-Tu）tuf基因序列（EF-Tu）tuf1ggaccaatgccacaaactcgtgagcacatccttctttcacgtcaagttggtgttaaacac61cttatcgtattcatgaacaaagttgaccttgttgatgatgaagaattgcttgaattggtt121gaaatggaaattcgtgaccttctttcagaatacgacttcccaggtgatga181atccaaggttcagctcttaaagcacttgaaggcgacgaaaaatacgaaga241gaattgatgagcactgttgatgagtacattccagaaccagaacgtgatac301ttacttcttccagttgaagatgtattctcaatcactggacgtggtacagt361cgtatcgaccgtggtactgttcgtgtcaacgacgaagttgaaatcgttgg421gatatccaaaaagcagttgttactggtgttgaaatgttccgtaaacaact481cttgcaggggacaacgttggtgttcttcttcgtggtgttcaacgtgatga541ggtcaagttcttgctaaaccaggttcaatcaacccacacactaaatttaa601tacatcctttctaaagaagaaggtggacgtcatactccattcttcaacaactaccgtcca661caattctacttccgtacaactgacgtaacaggttcaatcgaacttccagcaggaacagaa721atggttatgcctggtgataacgttactatcgaagttgaatt//（EF-Tu）tuf1ggaccaatgccacaaactcgtgagcacatccttctttcacgtcaagttggtgttaaacac61cttatcgttttcatgaacaaaattgaccttgttgatgatgaagaattgcttgaattagtt121gaaatggaaatccgtgatcttctttcagaatacgatttcccaggtgatgaccttccagtt181atccaaggttcagctcttaaagctcttgaaggcgatgaaaaatacgaagacatcgttatg241gaattgatggctactgttgattcatacattccagaaccagaacgtgatactgacaaacca301ttgcttcttccagttgaggatgtattctcaatcactggacgtggtactgttgcttcagga361cgtatcgaccgtggtactgttcgtgtcaacgacgaaatcgaaatcgttggtattaaagaa7421gaaactcaaaaagctatcgttactggtgttgaaatgttccgtaaacaacttgacgaaggt481cttgcaggagacaacgtaggtatccttcttcgtggtgttcaacgtgacgaaatcgaacgt541ggacaagttattgctaaaccaggttcaatcaacccacatactaaatttaaagg