海洋鏈霉菌GB-2的分離篩選及其抗菌物質的研究

海洋鏈霉菌GB-2的分離篩選及其抗菌物質的研究海洋中蘊藏著大量的微生物資源，在它們中廣泛地分布著抗菌活性菌株，是抗菌物質的重要潛在來源。海洋微生物資源還是一個開發(fā)不久的新領域，加上海洋環(huán)境的獨特性和極端性特點，它們所產生的抗菌物質往往是新穎的，可能具有很好的應用前景。因此，從海洋中篩選產高效、新穎、低毒的抗菌活性物質潛力巨大。本研究的目的在于利用我國連云港豐富的海洋微生物資源，從海洋樣品中篩選出能產生抗菌活性高、抗菌譜廣、安全高效的抗菌物質的菌株，并對抗菌物質的理化特性、組成及其對蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制效果進行研究，旨在獲得廣譜高效、安全無毒的將來能作為食品防腐劑和飼料抗生素的新型抗菌物質。研究結果分述如下：1．從采自連云港海域的海洋樣品中分離到667株菌，其中246株有抗菌活性，包括74株放線菌、156株細菌和16株真菌，拮抗菌株獲得比例為36.88％，以放線菌拮抗株得率為最高；選取抗菌活性強的11株菌進行復篩后，發(fā)現11株菌株對啤酒酵母和擴展青霉均表現較明顯的抑制作用；除1株菌對革蘭氏陰性菌沒有抑制作用外，其它菌株對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有不同程度的抑制活性。這些菌株大部分有較廣泛的抗菌譜，顯示了它們較好的應用潛力。其中放線菌GB-2的抑菌譜廣，且抑菌活性強，不僅能較好地抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌而且對霉菌和酵母菌也有顯著的抑菌作用。因此，確定菌株GB-2為下一步試驗菌株。2．對放線菌GB-2進行了分類鑒定。通過形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性和細胞壁化學組分分析，初步判定其屬于鏈霉菌屬。在分子生物學鑒定中，通過總DNA提取、PCR擴增，得到1395bp的16SrRNA序列，與GenBank中相關序列進行同源性比對后，應用Bioedit7.0和Treedrawing軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示，GB-2的16SrRNA序列和數據庫中的弗氏鏈霉菌(StreptomycesfradiaeAB184776)的序列同源性達到98％以上。經過與已報道的弗氏鏈霉菌進行比較分析，確定菌株GB-2為弗氏鏈霉菌變種。3．通過研究菌株GB-2的生物學活性及其抗菌物質的理化特性發(fā)現發(fā)酵液色澤的深淺與培養(yǎng)基鹽度密切相關，且用人工海水配制培養(yǎng)基可顯著提高菌株GB-2的抗菌活性。GB-2菌株的抑菌譜較廣，不僅對金黃色葡萄球菌及其耐藥性菌株、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌等革蘭氏陽性和革蘭氏陰性食品致病菌和腐敗細菌都有較強的抑制作用，而且可抑制擴展青霉、黃曲霉、點青霉等食品中常見的腐敗真菌及番茄灰霉、小麥赤霉病菌、棉花枯萎病菌、稻瘟病菌等植物病原真菌。發(fā)酵液穩(wěn)定性研究表明GB-2菌株所產抗菌物質在121℃pH1和pH12條件下抑菌活性均不變，紫外線照射對其抗菌活性也沒有影響，表現出良好的耐酸堿熱特性及對紫外線的穩(wěn)定性，在生防、食品防腐劑及醫(yī)藥方面具有較好的應用潛力。4．菌株GB-2產生的抗菌物質溶于水，微溶于甲醇、乙醇，不溶于其它有機溶劑中。GB-2的發(fā)酵液經過超濾后發(fā)現其抗菌活性由抗細菌和抗真菌兩大組分組成，其中抗細菌組分能通過截留分子量≤1KDa的超濾膜。對含抗細菌物質的超濾液進行紙層析，發(fā)現該物質是一種水溶性的中性物質。經SephadexLH-20和SephadexG-15色譜柱分離后，過柱液經抗菌活性檢測出現3個活性峰，其中a峰的對蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌活性最強。將a峰的收集液進一步用HPLC純化，在圖譜上出現兩個峰，第2個峰具有抑菌活性。根據其特性推測其可能是一種氨基糖苷類抗生素。5．研究了抗細菌物質抑制蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌的敏感性及作用效果。結果表明，蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌對其均具有較高的敏感性，最小抑菌濃度分別0.663μg/mL和0.904μg/mL，能夠較強地抑制這2種菌的生長；菌體生長曲線、膜通透性研究結果顯示加了抗細菌物質的培養(yǎng)液菌濃下降、紫外吸收值上升，表明對這2種菌具有殺滅溶解作用；掃描電鏡和透射