無(wú)機(jī)砷及其活性代謝產(chǎn)物與蛋白相互作用以及抗腫瘤活性研究

無(wú)機(jī)砷及其活性代謝產(chǎn)物與蛋白相互作用以及抗腫瘤活性研究砷屬于半金屬元素(Semimetal),廣泛分布在世界各地,在所有元素中位列第二十。當(dāng)前,全球砷污染的地下水面積不斷擴(kuò)大,引起了一系列嚴(yán)重公眾問(wèn)題,因而大家對(duì)于砷的關(guān)注點(diǎn)主要集中在環(huán)境方面。根據(jù)流行病調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),砷污染的飲用水可能會(huì)導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生,例如皮膚角化病,乏力,嘔吐,神經(jīng)病變和癌變等。目前,砷被美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)認(rèn)定為是致癌物,他們指出長(zhǎng)期慢性暴露砷會(huì)引起膀胱、肺、肝和皮膚癌。砷除了具有致癌作用,還能導(dǎo)致多種毒性疾病如周?chē)芗膊?黑腳以及高血壓。因此,美國(guó)環(huán)保署(EPA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)等多個(gè)組織規(guī)定飲用水中的砷濃度不得超出10pg/L。然而,全球多個(gè)國(guó)家仍然利用砷生產(chǎn)合金,農(nóng)藥和獸藥,環(huán)境污染的趨勢(shì)也在增加。砷在自然界主要以?xún)煞N形態(tài)存在(即有機(jī)和無(wú)機(jī)的形態(tài)存在于土壤和水中),而且砷的價(jià)態(tài)主要有三價(jià)和五價(jià)之分。研究發(fā)現(xiàn),三價(jià)砷的毒性要高于五價(jià)砷,其細(xì)胞毒性主要取決于細(xì)胞攝取砷的含量和積累。研究發(fā)現(xiàn),哺乳類(lèi)來(lái)源的細(xì)胞攝取三價(jià)砷主要依靠水通道蛋白例如AQP3、7和9通道。而在紅細(xì)胞和血腦屏障上皮細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT1參與三價(jià)砷的攝取。因此,動(dòng)物和人攝取三價(jià)無(wú)機(jī)砷的能力要遠(yuǎn)大于五價(jià)無(wú)機(jī)砷,而產(chǎn)生三價(jià)無(wú)機(jī)砷細(xì)胞的毒性強(qiáng)于五價(jià)砷。還有,研究發(fā)現(xiàn)五價(jià)的iAsV主要通過(guò)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體被細(xì)胞吸收,尤其在哺乳生物體內(nèi),iAsV主要通過(guò)Npt2轉(zhuǎn)運(yùn)體(是一種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體)進(jìn)入細(xì)胞。但是目前也有研究這對(duì)此研究成果持有不同的觀點(diǎn)。關(guān)于砷的體內(nèi)代謝機(jī)制,研究證實(shí)砷在體內(nèi)與蛋白質(zhì)(巰基)結(jié)合,進(jìn)而迅速被甲基化。尤其肝臟是砷甲基化的主要器官,iAsⅢ在砷甲基化轉(zhuǎn)移酶(AS3MT)的催化下,產(chǎn)生不同的甲基化代謝產(chǎn)物；這些砷甲基化代謝產(chǎn)物包括單甲基化代謝產(chǎn)物和二甲基化代謝產(chǎn)物。體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)三價(jià)的甲基化代謝中間產(chǎn)物主要包括MMAIⅢ,DMAⅢ,而五價(jià)的甲基化代謝產(chǎn)物主要包括MMAV和DMAV。目前為止,關(guān)于無(wú)機(jī)砷的體內(nèi)代謝途徑仍然不是很明晰。已知的第一種比較經(jīng)典的代謝途徑(1945年,Challenger提出)是無(wú)機(jī)砷通過(guò)氧化還原過(guò)程來(lái)進(jìn)行甲基化代謝。在這條途徑中,三價(jià)的無(wú)機(jī)砷首先被氧化甲基化形成MMAV,進(jìn)而MMAV還原成MMAⅢ。之后,MMAⅢ又會(huì)被氧化甲基化成DMAV,最終又被還原為DMAⅢ(此學(xué)說(shuō)認(rèn)為五價(jià)的MMAV和DMAV是中間代謝產(chǎn)物)。但是,最近的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被五價(jià)的無(wú)機(jī)砷(iAsV)處理后,很少有甲基化的代謝產(chǎn)物(即MMAV和DMAV)生成,這表明在無(wú)機(jī)砷的生物甲基化過(guò)程中,MMAV和DMAV可能是最終產(chǎn)物,而非中間產(chǎn)物。也有研究表明,他們?cè)隗w內(nèi)組織中檢測(cè)不到游離的三價(jià)甲基化砷化合物MMAⅢ和DMAⅢ,卻發(fā)現(xiàn)其以蛋白結(jié)合的形態(tài)存在。因此,暗示三價(jià)的甲基化砷化合物可能是無(wú)機(jī)砷的中間代謝產(chǎn)物。但是,到目前為止沒(méi)有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜃C明MMAV和DMAV是無(wú)機(jī)砷的體內(nèi)中間代謝產(chǎn)物,而多項(xiàng)結(jié)果顯示五價(jià)的砷化合物是砷的最終代謝產(chǎn)物。2005年,日本的平野科研組提出無(wú)機(jī)砷的第二種代謝途徑。他們認(rèn)為無(wú)機(jī)砷發(fā)生甲基化反應(yīng)不通過(guò)氧化反應(yīng)。在第二種新代謝途徑中,無(wú)機(jī)砷主要與谷胱甘肽形成復(fù)合體,而此復(fù)合體被認(rèn)為是AS3MT的主要底物。通過(guò)與AS3MT相互作用,三價(jià)的無(wú)機(jī)砷谷胱甘肽復(fù)合體iAs(GS)3能夠被甲基化為MMA(GS)2和DMA(GS)。與第一條代謝途徑不同的是,發(fā)生甲基化反應(yīng)時(shí),砷不通過(guò)氧化反應(yīng)進(jìn)行甲基化反應(yīng),甲基化后的三價(jià)砷化合物可以氧化為五價(jià)的砷化合物。但是,第二條途徑?jīng)]有說(shuō)明無(wú)機(jī)砷在甲基化代謝過(guò)程是與GSH或AS3MT蛋白相結(jié)合。2006年,我們提出了第三種無(wú)機(jī)砷代謝途徑。無(wú)機(jī)砷是通過(guò)與體內(nèi)富含半胱氨酰殘基的蛋白相結(jié)合,從而進(jìn)行一系列甲基化反應(yīng),生成一甲基化產(chǎn)物(MMAⅢ)和二甲基化產(chǎn)物(DMAⅢ)。該條涂釋表明無(wú)機(jī)砷在體內(nèi)是通過(guò)三價(jià)的形態(tài)與蛋白相結(jié)合,之后在SAM和GSH的存在下,被AS3MT甲基化為MMAⅢ和DMAⅢ。無(wú)機(jī)砷在體內(nèi)的代謝過(guò)程被認(rèn)為是減毒過(guò)程,因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)動(dòng)物尿液中發(fā)現(xiàn)了五價(jià)的甲基化代謝產(chǎn)物。但是,之后在動(dòng)物和APL病人的尿液中發(fā)現(xiàn)了三價(jià)的甲基化代謝產(chǎn)物和硫化的砷劑,這引起大家對(duì)無(wú)機(jī)砷的體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的更多關(guān)注。因此,為了闡明無(wú)機(jī)砷的體內(nèi)毒性和臨床治療分子機(jī)制,有必要深入研究無(wú)機(jī)砷在體內(nèi)的轉(zhuǎn)換、代謝及與蛋白的相互作用。雖然砷具有毒性和致癌性,但它也被認(rèn)為是一種很好的抗癌藥,這體現(xiàn)出這種半金屬的矛盾性質(zhì),驅(qū)使我們?nèi)ヌ骄坎煌榛衔锏亩拘詸C(jī)制。與此同時(shí),我們也討論了砷的細(xì)胞攝取、蓄積、排泄以及不同形態(tài)砷與蛋白質(zhì)的親和力,這些都與砷的毒性或治療效應(yīng)密切相關(guān)。眾所周知,砷(三氧化二砷)作為一種有效的抗癌藥物,主要用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)。目前認(rèn)為,三氧化二砷能夠誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化為正常細(xì)胞,其主要機(jī)理是三氧化二砷能夠靶向降解APL細(xì)胞內(nèi)的PML-RARα的融合蛋白。最近,三氧化二砷也被用于治療APL以外的血液學(xué)惡性腫瘤,但是確切的抗癌機(jī)制還有待闡明。因此,砷的毒性和治療效果的不同機(jī)制還需要更深層次的研究。在本論文中,我們?cè)敿?xì)討論了對(duì)于砷的致癌性和抗癌功效的機(jī)理的見(jiàn)解,進(jìn)一步解釋了砷的代謝途徑、代謝產(chǎn)物的多種細(xì)胞靶點(diǎn)及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。此外,我們探討了砷化合物的現(xiàn)在和將來(lái),并深入探討了砷作為抗癌藥物的歷程及存在的不足等。在隨后的章節(jié)中,我們進(jìn)一步討論了三氧化二砷作為緩解APL的一線藥物的使用情況及對(duì)APL緩解和復(fù)發(fā)治療的效果。此外,還分析了三氧化二砷及其有機(jī)砷化合物對(duì)非APL腫瘤的治療效果,尤其重點(diǎn)探討了單用砷劑或合用其它抗癌藥物治療不同實(shí)體瘤的效果、優(yōu)點(diǎn)及進(jìn)一步需要強(qiáng)化的方面。最后,我們?cè)敿?xì)地總結(jié)了砷化合物的抗癌分子機(jī)制(例如探討單用砷劑或與其它化合物合用)。最近的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞對(duì)砷的敏感性與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制有關(guān),這里我們也強(qiáng)調(diào)了砷的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑與其在細(xì)胞內(nèi)的蓄積和與蛋白質(zhì)的巰基結(jié)合有關(guān)。早在19世紀(jì),砷曾作為強(qiáng)有力的藥物被用于治療不同的疾病,包括皮膚和乳腺癌、高血壓、胃潰瘍、風(fēng)濕、梅毒、牛皮癬、痔瘡,甚至是中藥牙醫(yī)中的牙齒填充。然而,1992年至1999年間,三氧化二砷中藥制劑(俗稱(chēng)‘"Ailing-1",含有1%的As203)首次被發(fā)現(xiàn)具有較好的抗白血病的功效。尤其是,APL病人在三氧化二砷治療后顯示出較好的臨床效果,表現(xiàn)出令人難以置信的臨床緩解率和較低的毒性。2000年,美國(guó)FDA批準(zhǔn)三氧化二砷用于APL的治療。APL的發(fā)生機(jī)制已被闡明,即15號(hào)染色體上的早幼粒細(xì)胞白血病(PML)基因和17號(hào)染色體上的視黃酸受體α(RARa)基因融合形成嵌合基因,表達(dá)PML-RARa融合癌蛋白,此融合蛋白阻礙了早幼粒細(xì)胞的成熟,導(dǎo)致APL的發(fā)生。關(guān)于APL的治療,目前已證實(shí),高劑量的全反式維甲酸(ATRA)可誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化。雖然ATRA顯示出卓越的誘導(dǎo)細(xì)胞分化的能力,但是在病人進(jìn)行ATRA緩解治療后超過(guò)三到五周,疾病容易復(fù)發(fā)。因此,ATRA需要和其它化療藥物聯(lián)合使用。同樣,研究發(fā)現(xiàn)后天獲得ATRA抗性的APL患者不能第二次單用全反式維甲酸來(lái)治療。研究顯示,三氧化二砷對(duì)使用ATRA治療復(fù)發(fā)的APL患者具有很好的療效。關(guān)于砷劑治療白血病的分子機(jī)制研究,報(bào)道指出三氧化二砷對(duì)PML的半胱氨酸殘基有著高親和力,這可能導(dǎo)致PML-RARa融合蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化,最終導(dǎo)致該蛋白的降解。報(bào)道認(rèn)為,三氧化二砷可直接與核質(zhì)PML及核小體中PML-RARa的PML的鋅指區(qū)域結(jié)合,形成PML-RARa多聚體,或通過(guò)使PML-RARa融合蛋白的PML之間形成二硫鍵進(jìn)而重組PML-NBS。在此基礎(chǔ)上,PML-RARa多聚體通過(guò)與泛素結(jié)合酶9(UBC9)結(jié)合,發(fā)生SUMO化,然后經(jīng)環(huán)指蛋白4(RNF4)誘導(dǎo),進(jìn)行泛素化,導(dǎo)致其蛋白酶體依賴(lài)性降解,最后使得APL細(xì)胞分化為正常細(xì)胞。此外,三氧化二砷也被用于治療APL之外的惡性腫瘤或?qū)嶓w瘤。然而,三氧化二砷對(duì)實(shí)體瘤并沒(méi)有很好的抗腫瘤效果。但是,三氧化二砷與其他化療藥物的聯(lián)合治療策略對(duì)除了少數(shù)腫瘤之外的其他腫瘤顯露出可喜的成果。研究還發(fā)現(xiàn),當(dāng)AS203注射到APL患者后,體內(nèi)發(fā)生甲基化,生成三價(jià)的中間代謝產(chǎn)物,然而,這些甲基化代謝物在治療白血病過(guò)程中究竟起到了什么樣的作用,至今沒(méi)有任何報(bào)道和研究。目前大多數(shù)研究人員很少注意三價(jià)中間代謝物在治療功效上的貢獻(xiàn)。一般來(lái)講,As203注射后會(huì)水解成iAsⅢ,然后代謝成甲基化的三價(jià)中間代謝產(chǎn)物(如MMAⅢ和DMAⅢ)。與五價(jià)的甲基化代謝物相比,三價(jià)砷化合物被認(rèn)為具有較大的毒性。許多研究已經(jīng)證實(shí),三價(jià)甲基化砷被發(fā)現(xiàn)可以容易地被吸收并聚集在細(xì)胞中,并進(jìn)一步與各種關(guān)鍵酶或細(xì)胞器的半胱氨酸殘基相互作用且抑制其活性,最終導(dǎo)致砷毒性。甲基化代謝產(chǎn)物MMAⅢ和DMAⅢ可能影響各種細(xì)胞途徑,目前已發(fā)現(xiàn)其對(duì)不同細(xì)胞有著不同程度的影響,表明這兩種三價(jià)甲基化砷代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有著不同的毒性作用。關(guān)于無(wú)機(jī)砷的細(xì)胞毒性,目前有多種解釋,其中比較受關(guān)注的是無(wú)機(jī)砷通過(guò)與生物大分子相結(jié)合來(lái)引起細(xì)胞毒性,長(zhǎng)期可能引起人體細(xì)胞發(fā)生癌變。無(wú)機(jī)砷在引起細(xì)胞毒性的同時(shí)會(huì)激活一系列磷酸化依賴(lài)的信號(hào)途徑。在本論文中,我們探討了砷化合物對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的影響研究。眾所周知,PTP可以通過(guò)調(diào)節(jié)酪氨酸受體水平來(lái)調(diào)節(jié)磷酸化依賴(lài)的信號(hào)通路。所以,我們希望能夠發(fā)現(xiàn)iAsⅢ及其中間代謝產(chǎn)物與PTP之間的關(guān)系。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,三價(jià)砷的中間代謝產(chǎn)物能夠強(qiáng)烈抑制PTP1B和CD45的活性,但是無(wú)機(jī)砷卻不能。我們的研究結(jié)果顯示,甲基化砷可能通過(guò)PTP失活來(lái)干擾正常的細(xì)胞信號(hào)通路(詳細(xì)內(nèi)容參照正文)。另外,我們比較了三價(jià)砷(包括iAsⅢ、MMAⅢ、DMAⅢ)抗白血病的活性及其作用機(jī)制。此課題以人粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞系為主要研究對(duì)象。為了研究可能參與誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞毒性的砷化物的靶點(diǎn),我們用相同濃度的三種砷化合物分別處理細(xì)胞,檢測(cè)了活性氧的生成情況和DNA的損傷程度等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中,三價(jià)的砷代謝產(chǎn)物MMAⅢ和DMAⅢ分別通過(guò)用L-半胱氨酸在90攝氏度還原五價(jià)的MMAV和DMAV制備。細(xì)胞存活率用MTT法測(cè)定。細(xì)胞攝取砷含量通過(guò)ICP質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。Westernblot法用來(lái)檢測(cè)HL-60細(xì)胞中Caspase-9,Caspase-3和PARP等蛋白的表達(dá)。Caspase-3的特異性底物(AC-DEVD-pNA)用來(lái)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活性。細(xì)胞凋亡率通過(guò)流式細(xì)胞儀結(jié)合AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)染色來(lái)檢測(cè)。結(jié)果顯示,三價(jià)的甲基化代謝產(chǎn)物(即MMAⅢ和DMAⅢ)具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,其毒性強(qiáng)于無(wú)機(jī)砷(iAsⅢ)。MTT結(jié)果表明,iAsⅢ的IC50值大約為10μM,然而,MMAⅢ和DMAⅢ在較低濃度(分別為3和2μM)顯著抑制了細(xì)胞增殖。較低劑量的MMAⅢ和DMAⅢ也能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了觀察MMAⅢ和DMAⅢ是否能通過(guò)誘導(dǎo)凋亡從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,我們使用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)染色檢測(cè)HL-60細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示,MMAⅢ和DMAⅢ顯著誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。此外,NAC預(yù)處理HL-60細(xì)胞后,MMAⅢ和DMAⅢ誘導(dǎo)的凋亡被有效抑制,這表明ROS產(chǎn)生可能是MMAⅢ和DMAⅢ誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的主要原因。此外,westernblot結(jié)果顯示,HL-60細(xì)胞在MMAⅢ和DMAⅢ處理后,caspase-3和caspase-9有明顯的上調(diào),并且,PARP也有明顯的裂解片段生成。而在NAC預(yù)處理的HL-60細(xì)胞中,caspase-3、caspase9和PARP三種蛋白均有明顯的變化。但是,iAsⅢ并沒(méi)有類(lèi)似的作用效果。為了更加了解iAsⅢ對(duì)HL-