天然乳香香味劑3-羥基丁酮產(chǎn)生菌的構(gòu)建及制備工藝的研究

天然乳香香味劑3-羥基丁酮產(chǎn)生菌的構(gòu)建及制備工藝的研究3-羥基丁酮(又名乙偶姻、乙酰甲基甲醇、英文名acetoin),具有令人愉快的奶油香氣,天然存在于某些植物中如玉米、葡萄、可可、蘋果、香蕉、草莓等,以及動(dòng)物組織中,是一種令人喜愛的食用香料,是國際上應(yīng)用廣泛的常用香料品種。3-羥基丁酮還是一種重要的C4平臺(tái)化合物,2004年美國能源部將其列為30種優(yōu)先開發(fā)利用的平臺(tái)化合物之一。3-羥基丁酮的生產(chǎn)方式包括化學(xué)合成法、酶法轉(zhuǎn)化和微生物發(fā)酵法,目前,化學(xué)合成方法仍是3-羥基丁酮的主要生產(chǎn)方式,該方法存在著工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題,也不符合天然、綠色、安全的消費(fèi)理念,限制了其在食品、醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用前景;酶法轉(zhuǎn)化由于高效生物酶獲取困難限制了其工業(yè)化的應(yīng)用;而微生物發(fā)酵法是以微生物為工具,利用可再生的生物質(zhì)為原料,原料來源豐富、條件溫和、環(huán)境友好、產(chǎn)品綠色安全,能從根本上改變化學(xué)合成法生產(chǎn)3-羥基丁酮所面臨的資源與環(huán)境壓力,是最具競(jìng)爭力的生產(chǎn)方法。發(fā)酵法已成為3-羥基丁酮生產(chǎn)方法研究的熱點(diǎn)。本研究利用隨機(jī)誘變手段選育得到一株產(chǎn)3-羥基丁酮的高產(chǎn)突變株BacillussubtilisSF3-102,針對(duì)菌株遺傳改造、3-羥基丁酮發(fā)酵工藝及下游工程等開展研究,論文的主要研究結(jié)果如下:(1)前期工作中,從自然界中分離篩選獲得了一株產(chǎn)3-羥基丁酮B.subtilisSF4-3,采用了傳統(tǒng)的誘變手段包括紫外線、硫酸二乙酯和亞硝基胍對(duì)菌株進(jìn)行隨機(jī)處理,獲得了一種3-羥基丁酮產(chǎn)量明顯提高的突變株SF3-102;研究考察了環(huán)境條件和營養(yǎng)組分對(duì)菌株SF3-102代謝合成積累3-羥基丁酮的影響,其最適接種量為5%(v/v),最適培養(yǎng)溫度為36-38℃,采用統(tǒng)計(jì)學(xué)手段對(duì)培養(yǎng)基組分的影響進(jìn)行了考察,得到了最適的培養(yǎng)基組成:葡萄糖160g/L,酵母膏6.5g/L,玉米漿13g/L,尿素3g/L,MnSO40.05g/L,FeSO40.05g/L。在上述條件下菌株SF3-102搖瓶發(fā)酵3-羥基丁酮產(chǎn)量達(dá)到了60.64g/L。(2)為了解析菌株SF3-102積累3-羥基丁酮的代謝機(jī)理,本研究使用IlluminaSolexa技術(shù)對(duì)B.subtilisSF3-102進(jìn)行全基因組鳥槍法denovo測(cè)序,拼裝后最終得到10條scaffolds,共4,153,882bp的數(shù)據(jù),共有4545個(gè)開放閱讀框架,其平均長度為798bp,編碼區(qū)域包含3,625,437bp,占基因組數(shù)量的87.28%,并進(jìn)行了蛋白編碼基因的GO(GeneOntology)注釋、COG(ClusterofOrthologousGroupsofproteins)的注釋以及KO及Pathway注釋,在上述分析的基礎(chǔ)上,針對(duì)與3-羥基丁酮代謝的相關(guān)基因,將該菌株與NCBI中已經(jīng)測(cè)序的枯草芽孢桿菌菌株168和BEST195進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析,確定了枯草芽孢桿菌菌株過量積累3-羥基丁酮相關(guān)的關(guān)鍵基因或操縱子上個(gè)別氨基酸的基因突變位點(diǎn)。(3)結(jié)合菌株SF3-102的3-羥基丁酮代謝網(wǎng)絡(luò)及全基因組測(cè)序的研究,對(duì)菌株進(jìn)行了分子改造。2,3-丁二醇作為3-羥基丁酮生產(chǎn)過程中的主要的副產(chǎn)物,是有3-羥基丁酮在丁二醇脫氫酶(BDH)的作用下轉(zhuǎn)化而成,它的存在對(duì)3-羥基丁酮的產(chǎn)率及下游分離提取均有影響,因此,為切斷2,3-丁二醇的合成或減少其積累,對(duì)BDH編碼基因bdhA進(jìn)行了敲除?？紤]到該菌株的工業(yè)應(yīng)用性,選用了一種無痕“Cre/lox”基因敲除系統(tǒng),得到一株bdhA基因敲除后的菌株B.subtilisSFAP,搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明2,3-丁二醇的產(chǎn)量由21.5g/L降至6.1g/L,3-羥基丁酮的產(chǎn)量提升了23.6%,產(chǎn)量達(dá)69.5g/L,生產(chǎn)效率達(dá)0.97g/L/h。(4)采用5L和50L全自動(dòng)發(fā)酵罐對(duì)菌株SFAP3-羥基丁酮發(fā)酵條件和控制進(jìn)行了系統(tǒng)研究,重點(diǎn)考察了溶解氧(罐壓、通風(fēng)和攪拌)和pH對(duì)菌株3-羥基丁酮發(fā)酵的影響,確定了菌株SFAP生產(chǎn)3-羥基丁酮的具體控制策略和參數(shù):發(fā)酵過程中控制溶解氧5-10%,以調(diào)控?cái)嚢柁D(zhuǎn)速為主(400-500r/min),調(diào)節(jié)通風(fēng)量為輔(1.0-1.2m3/h),前期菌體生長期,控制pH6.5-7.0,后期產(chǎn)物形成期,控制pH5.5-6.0。實(shí)驗(yàn)方案在1000L規(guī)模發(fā)酵罐上進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn),平均發(fā)酵周期70.2h,3-羥基丁酮產(chǎn)率64.84g/L,轉(zhuǎn)化率40.42%。5000L發(fā)酵罐生產(chǎn)性實(shí)驗(yàn)發(fā)酵周期平均68.3h,最高產(chǎn)率64.90g/L。采用1000L發(fā)酵罐研究了3-羥基丁酮補(bǔ)料發(fā)酵工藝,確定了最佳補(bǔ)料方式,發(fā)酵周期78h3-羥基丁酮最高產(chǎn)率78.9g/L。(5)針對(duì)生物法生產(chǎn)3-羥基丁酮的下游提取工藝進(jìn)行了系統(tǒng)研究,確定了發(fā)酵液的預(yù)處理凈化工藝。發(fā)酵液預(yù)處理采用陶瓷膜過濾,控制物料溫度≤80℃,操作壓力≤0.2MPa,膜面錯(cuò)流速度≤5m/s;研究確定了過膜清液的脫色工藝,優(yōu)選確定了脫色效果較好的活性炭型號(hào)ZX-303,脫色溫度50-55℃,活性炭添加量0.8-1.0%,脫色時(shí)間20-25min;重點(diǎn)研究了3-羥基丁酮的提取純化工藝,比較研究了精餾、加鹽精餾和萃取等分離技術(shù)在3-羥基丁酮分離純