酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交

關(guān)于酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與第2頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

反式轉(zhuǎn)錄激活因子

結(jié)構(gòu)上是組件式的，即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain，簡(jiǎn)稱為BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，簡(jiǎn)稱為AD)。

第3頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。

第4頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天酵母雙雜交第5頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天酵母雙雜交系統(tǒng)的另一個(gè)重要的元件

報(bào)道株指經(jīng)改造的、含報(bào)道基因(reportergene)的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。

最常用的是酵母細(xì)胞，酵母細(xì)胞作為報(bào)道株具有許多優(yōu)點(diǎn):

〈1〉易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。

〈2〉具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)道基因。

〈3〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來(lái)源于哺乳動(dòng)物的蛋白結(jié)合第6頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天根據(jù)這個(gè)特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Baitprotein的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的BD-Baitprotein融合蛋白。將編碼AD的基因和cDNA文庫(kù)的基因構(gòu)建在

AD-LIBRARY表達(dá)載體上,在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白。第7頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天第8頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天如果誘餌蛋白和靶蛋白能夠相互作用，那么GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和GAL4激活結(jié)構(gòu)域就會(huì)相互作用，從而激活lacZ報(bào)道基因的表達(dá)。所以我們可以通過(guò)轉(zhuǎn)化的酵母的表型來(lái)確定誘餌蛋白和靶蛋白是否有相互作用。

第9頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

第10頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成ADE、HIS、LEU、TRP，因此，酵母在缺乏這些營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上無(wú)法正常生長(zhǎng)。當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因ADE、HIS、LACZ、MEL1，從而通過(guò)功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來(lái)，從而對(duì)載體中插入的文庫(kù)基因進(jìn)行測(cè)序和分析工作。

第11頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天綜上：酵母雙雜交系統(tǒng)通過(guò)兩個(gè)雜交蛋白在酵母細(xì)胞中的相互結(jié)合及對(duì)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)捕獲新的蛋白質(zhì)，其大致步驟為:

1、視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結(jié)合域融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒。

2、將待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域融合，構(gòu)建成文庫(kù)質(zhì)粒。第12頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、將這兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞中。4、酵母細(xì)胞中，已分離的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會(huì)相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；反之，則不能。利用4種報(bào)告基因的表達(dá)，便可捕捉到新的蛋白質(zhì)。第13頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能當(dāng)我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫(kù)中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽(yáng)性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對(duì)該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個(gè)篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。第14頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

2、利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用

利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過(guò)酵母雙雜交進(jìn)行檢測(cè)。

第15頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響

酵母雙雜交的報(bào)告基因能否表達(dá)在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對(duì)于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發(fā)現(xiàn)它的病毒RNA復(fù)制與依賴于RNA的RNA聚合酶（NS5）與拓?fù)洚悩?gòu)酶NS3，以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)受體BETA-importin的相互作用有關(guān)。研究人員通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應(yīng)的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNA病毒的復(fù)制，從而達(dá)到治療這種疾病的目的。

第16頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖

眾多的蛋白質(zhì)之間在許多重要的生命活動(dòng)中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的?；蚪M中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過(guò)基因組的測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達(dá)文庫(kù)中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對(duì)于認(rèn)識(shí)一些重要的生命活動(dòng)：如信號(hào)傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義第17頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了

酵母單雜交、酵母三雜交和酵母的反向雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫(kù)蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)。第18頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

酵母單雜交技術(shù)最早是從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來(lái)，酵母雙雜交技術(shù)通過(guò)對(duì)報(bào)告基因的表型進(jìn)行檢測(cè)以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)間相互作用的研究，而酵母單雜交技術(shù)則通過(guò)對(duì)報(bào)告基因的表型檢測(cè)，分析DNA、蛋白之間的相互作用，以研究真核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控。第19頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

原理用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)；而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過(guò)程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。據(jù)此，我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為其他蛋白，只要他能與我們想要了解的目的基因相互作用，就照樣可以通過(guò)其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，從而啟動(dòng)對(duì)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。第20頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

正是基于這一理論，酵母單雜交系統(tǒng)由2部分組成：(1)將文庫(kù)蛋白片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒；(2)含有目的基因和下游報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒.

首先將報(bào)告質(zhì)粒整合入酵母基因組,產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報(bào)告株;

再將文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入報(bào)告株;

若存在文庫(kù)蛋白與目的基因的相互作用,可通過(guò)對(duì)報(bào)告基因的表達(dá)將文庫(kù)蛋白的基因篩選出來(lái).第21頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

酵母三雜交系統(tǒng)的原理與酵母雙雜交相似，利用了酵母細(xì)胞的GAL4蛋白調(diào)節(jié)目的基因(半乳糖苷酶基因及His3基因)轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)。GAL4蛋白具有兩個(gè)可分離的功能區(qū)，N端是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。只要這兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域能夠通過(guò)一定的方式在空間上足夠的靠近(如借助其他分子的相互結(jié)合使其足夠靠近)，即使它們之間沒(méi)有共價(jià)結(jié)合也可激活轉(zhuǎn)錄，這為研究蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用提供了可能。第22頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

第23頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

上圖顯示了酵母三雜交系統(tǒng)的原理。在酵母三雜交系統(tǒng)，lexA啟動(dòng)子調(diào)控下游LacZ基因和His3基因的表達(dá)，而lexA啟動(dòng)子的激活取決于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域能否在空間上相互靠近。其中第一個(gè)融合蛋白由兩部分組成，一部分為能結(jié)合lexA啟動(dòng)子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，另一部分為噬菌體衣殼蛋白MS2。第二個(gè)融合蛋白也由兩部分組成，一部分為能激活lexA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，另一部分為有待研究的RNA結(jié)合蛋白“Y”。第24頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

這兩個(gè)融合蛋白通過(guò)第三個(gè)融合的RNA分子相連，其一端為含有噬菌體衣殼蛋白MS2結(jié)合位點(diǎn)的MS2RNA，另一端為有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互作用就使得這個(gè)復(fù)合物形成一個(gè)功能性的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而使得