谷糠抗結(jié)腸癌結(jié)合態(tài)多酚的制備及其機(jī)制研究

谷糠抗結(jié)腸癌結(jié)合態(tài)多酚的制備及其機(jī)制研究隨著人們生活水平的提高,飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,再加上食物中的農(nóng)藥殘留、食品添加劑的不合理使用等加快了消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率。結(jié)腸癌（colorectalcancer,CRC）是一種最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,目前的治療手段主要是手術(shù)和化療,其極易復(fù)發(fā),同時(shí)產(chǎn)生耐藥性,具有較強(qiáng)的毒副作用。近年來(lái)從天然產(chǎn)物中已獲得多種抗結(jié)腸癌臨床藥物,如:紫杉醇,依立替康和長(zhǎng)春新堿等多種小分子藥物。以上三大類抗結(jié)腸癌臨床藥物均來(lái)源于天然產(chǎn)物。因此,天然產(chǎn)物是藥物篩選的巨大寶庫(kù),從天然產(chǎn)物中獲取高效無(wú)毒的抗結(jié)腸癌藥物也是目前國(guó)內(nèi)外腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。我國(guó)天然產(chǎn)物資源豐富又有源遠(yuǎn)的藥用歷史,利用天然產(chǎn)物資源的優(yōu)勢(shì),一直以來(lái)是我國(guó)新藥開(kāi)發(fā)的主要方向。谷子（Setariaitalica）是我國(guó)黃河流域傳統(tǒng)的農(nóng)作物,屬一年生禾本科植物,是山西的名優(yōu)產(chǎn)品,現(xiàn)在已廣泛種植于全世界。谷糠是在小米加工過(guò)程中作為副產(chǎn)品被丟棄而生物利用度不高的谷子的皮殼。研究表明,谷糠含有豐富的植物化學(xué)物質(zhì),尤其是多酚類化合物。多酚主要以自由態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在于自然界,以結(jié)合態(tài)形式居多并且比自由態(tài)多酚具有更強(qiáng)的抗氧化能力。有報(bào)道揭示結(jié)合態(tài)多酚具有廣泛的藥理和醫(yī)學(xué)特性,歸功于它具有清除自由基、螯合金屬和較強(qiáng)的抗氧化特性。因此,將結(jié)合態(tài)多酚作為預(yù)防和治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的潛在藥物,越來(lái)越受到科學(xué)界的關(guān)注。本研究以天然谷糠為原料,從中提取出一系列多酚化合物,并對(duì)每個(gè)多酚的含量作了比較。在細(xì)胞水平篩選具有抗結(jié)腸癌活性的多酚并對(duì)其成分進(jìn)行鑒定,確定其有效成分;采用細(xì)胞和裸鼠模型,從細(xì)胞凋亡、炎癥效應(yīng)及細(xì)胞代謝的角度系統(tǒng)探討谷糠活性多酚抗結(jié)腸癌的分子機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:（1）谷糠多酚的制備及抗氧化能力的評(píng)價(jià)。采用丙酮提取谷糠內(nèi)外殼自由態(tài)多酚,將提取完自由態(tài)多酚的谷糠內(nèi)外殼殘?jiān)M(jìn)一步堿消化,制備結(jié)合態(tài)多酚。福林酚法測(cè)定總多酚含量,結(jié)果顯示谷糠外殼結(jié)合態(tài)多酚的含量最高,其次是內(nèi)殼的結(jié)合態(tài)多酚（BPIS,boundpolyphenolofinnershell）。采用MTT法和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)只有谷糠內(nèi)殼來(lái)源的結(jié)合態(tài)多酚具有顯著抗結(jié)腸癌活性并且對(duì)其它腫瘤細(xì)胞也具良好的抗增殖效果,將其命名為:BPIS。另外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BPIS的抗氧化能力比維生素C的抗氧化性更強(qiáng)。（2）谷糠結(jié)合態(tài)多酚BPIS成分鑒定。通過(guò)UPLC-Triple-TOF液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定出BPIS含有12種多酚成分,分別是香草酸4-O-β-D–吡喃糖苷,葡萄糖基丁香酸、阿魏酸4-O-β-D–吡喃糖苷、4-羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、對(duì)-香豆酸、牡荊素、阿魏酸、異阿魏酸、二聚體阿魏酸衍生物和二聚體肉桂酸衍生物等成分。MTT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),BPIS比其分子量小于200的組分抗結(jié)腸癌效果更佳。（3）BPIS誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。將細(xì)胞內(nèi)ROS通過(guò)被DCFH-DA熒光探針標(biāo)記,結(jié)果顯示BPIS能夠顯著升高結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞內(nèi)ROS含量。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),BPIS能夠顯著降低HCT-116細(xì)胞的線粒體膜電位。Westernblotting檢測(cè)結(jié)果顯示caspases家族蛋白caspase-9和caspase-3被BPIS剪切激活且具有濃度依賴性,伴隨著促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量減少。上述結(jié)果證明BPIS能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞發(fā)生線粒體介導(dǎo)的凋亡效應(yīng),且BPIS誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)能夠被ROS的抑制劑NAC顯著逆轉(zhuǎn),表明BPIS通過(guò)增加HCT-116細(xì)胞內(nèi)ROS的含量而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。（4）BPIS發(fā)揮抗炎效應(yīng)的分子機(jī)制。采用脂多糖（LPS）構(gòu)建結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞炎癥模型并用ELISA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子,發(fā)現(xiàn)BPIS能夠顯著抑制促炎因子IL-1β和IL-6的分泌,增加抗炎因子IL-10的分泌。Westernblotting結(jié)果顯示,BPIS能夠阻滯HT-29細(xì)胞中炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位,并且抑制總Akt蛋白和p-Akt^ser473蛋白的表達(dá)。采用Akt蛋白的激活劑IGF-1（Insulin-likeGrowthFactors）與BPIS共處理HT-29細(xì)胞,結(jié)果顯示IGF-1逆轉(zhuǎn)了BPIS對(duì)p-Akt^ser473蛋白和NF-κB-p65蛋白的抑制作用,表明p-Akt^ser473蛋白正調(diào)控NF-κB蛋白的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。雙熒光素酶報(bào)告載體分析揭示,Akt是miR-149的靶基因,RT-PCR結(jié)果顯示BPIS能顯著升高HT-29細(xì)胞中miR-149的表達(dá)。采用DCFH-DA熒光探針標(biāo)記HT-29細(xì)胞內(nèi)ROS,結(jié)果顯示BPIS能夠明顯升高HT-29細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將ROS抑制劑NAC與BPIS共處理HT-29細(xì)胞,RT-PCR結(jié)果顯示NAC能顯著逆轉(zhuǎn)BPIS對(duì)miR-149的上調(diào)作用。結(jié)果表明BPIS通過(guò)促進(jìn)HT-29細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生,上調(diào)miR-149的表達(dá),抑制其靶基因Akt及其下游炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白的表達(dá),阻滯多種促炎癥因子的分泌,以此BPIS發(fā)揮了顯著地抗結(jié)腸癌炎癥效應(yīng)。（5）BPIS逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌能量代謝的分子機(jī)制。本論文研究發(fā)現(xiàn)BPIS能夠顯著減弱結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)生,并且通過(guò)抑制糖酵解過(guò)程中關(guān)鍵限速酶PKM2蛋白的表達(dá)致使細(xì)胞糖酵解速率降低。細(xì)胞外酸化率（ECAR）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BPIS能顯著減弱HT-29細(xì)胞的糖酵解速率。說(shuō)明BPIS有效地減弱了HT-29細(xì)胞的有氧糖酵解。另一方面BPIS能通過(guò)顯著降低GLS的酶活性抑制SLC蛋白在RNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá),進(jìn)而抑制HT-29細(xì)胞的谷氨酰胺代謝過(guò)程。結(jié)果還顯示,BPIS能夠抑制c-myc蛋白的表達(dá),表明BPIS逆轉(zhuǎn)的是c-myc介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞代謝。本論文已證明BPIS能夠顯著上調(diào)HT-29細(xì)胞中miR-149的表達(dá)。因此推測(cè)miR-149與c-myc蛋白具有負(fù)調(diào)控的關(guān)系。采用miRDB軟件和KEGG信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)搜集miR-149與代謝通路相關(guān)的靶基因,通過(guò)miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)Miranda和TargetScan預(yù)測(cè)可以和miR-149結(jié)合的靶基因的非編碼區(qū),通過(guò)雙熒光酶報(bào)告系統(tǒng)揭示c-myc就是miR-149的靶基因,同時(shí)驗(yàn)證了上述二者能夠負(fù)調(diào)控的推斷。MTT和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),BPIS能夠顯著抑制結(jié)腸癌HT-29和DLD1細(xì)胞的增殖;而且miR-149抑制劑能夠顯著逆轉(zhuǎn)BPIS對(duì)結(jié)腸癌HT-29和DLD1細(xì)胞的抑制作用,表明BPIS通過(guò)上調(diào)miR-149的表達(dá)而逆轉(zhuǎn)c-myc介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞異常能量代謝來(lái)發(fā)揮抗結(jié)腸癌效應(yīng)。（6）構(gòu)建裸鼠結(jié)腸癌細(xì)胞皮下成瘤模型。采用裸鼠腹腔給藥的方式,每隔2天給藥一次（共注射7次）。結(jié)果顯示BPIS能夠顯著抑制結(jié)腸癌腫瘤的生長(zhǎng),而裸鼠的正常體重和生長(zhǎng)狀況不受影響。采用Westernblotting和免疫組化驗(yàn)證BPIS在細(xì)胞水平已證實(shí)的關(guān)鍵因子表達(dá)情況,如miR-149,p-Akt^ser473,NF-κB,PKM2,c-myc等。結(jié)果顯示BPIS在體內(nèi)也具有明顯抗結(jié)腸癌效應(yīng),與細(xì)胞水平的數(shù)據(jù)一致。綜上所述:BPIS是一種來(lái)源于谷糠內(nèi)殼的結(jié)合態(tài)多酚,該多酚由12種成分組成。BPIS中分子量小于200的組分具有明顯的抗結(jié)腸癌活性,但沒(méi)有總BPIS的抗結(jié)腸癌活性效果好。本文就總BPIS發(fā)揮抗結(jié)腸癌效應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行深入探討,并通過(guò)裸鼠腫瘤模型進(jìn)行驗(yàn)證。BPIS處理可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS,過(guò)量的ROS一方面激活線粒體介導(dǎo)的凋亡效應(yīng),另一方