谷糠抗結腸癌結合態(tài)多酚的制備及其機制研究

谷糠抗結腸癌結合態(tài)多酚的制備及其機制研究隨著人們生活水平的提高,飲食結構發(fā)生了改變,再加上食物中的農(nóng)藥殘留、食品添加劑的不合理使用等加快了消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率。結腸癌（colorectalcancer,CRC）是一種最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,目前的治療手段主要是手術和化療,其極易復發(fā),同時產(chǎn)生耐藥性,具有較強的毒副作用。近年來從天然產(chǎn)物中已獲得多種抗結腸癌臨床藥物,如:紫杉醇,依立替康和長春新堿等多種小分子藥物。以上三大類抗結腸癌臨床藥物均來源于天然產(chǎn)物。因此,天然產(chǎn)物是藥物篩選的巨大寶庫,從天然產(chǎn)物中獲取高效無毒的抗結腸癌藥物也是目前國內(nèi)外腫瘤藥物研發(fā)的熱點。我國天然產(chǎn)物資源豐富又有源遠的藥用歷史,利用天然產(chǎn)物資源的優(yōu)勢,一直以來是我國新藥開發(fā)的主要方向。谷子（Setariaitalica）是我國黃河流域傳統(tǒng)的農(nóng)作物,屬一年生禾本科植物,是山西的名優(yōu)產(chǎn)品,現(xiàn)在已廣泛種植于全世界。谷糠是在小米加工過程中作為副產(chǎn)品被丟棄而生物利用度不高的谷子的皮殼。研究表明,谷糠含有豐富的植物化學物質(zhì),尤其是多酚類化合物。多酚主要以自由態(tài)和結合態(tài)兩種形式存在于自然界,以結合態(tài)形式居多并且比自由態(tài)多酚具有更強的抗氧化能力。有報道揭示結合態(tài)多酚具有廣泛的藥理和醫(yī)學特性,歸功于它具有清除自由基、螯合金屬和較強的抗氧化特性。因此,將結合態(tài)多酚作為預防和治療氧化應激相關疾病的潛在藥物,越來越受到科學界的關注。本研究以天然谷糠為原料,從中提取出一系列多酚化合物,并對每個多酚的含量作了比較。在細胞水平篩選具有抗結腸癌活性的多酚并對其成分進行鑒定,確定其有效成分;采用細胞和裸鼠模型,從細胞凋亡、炎癥效應及細胞代謝的角度系統(tǒng)探討谷糠活性多酚抗結腸癌的分子機制。主要研究內(nèi)容及結果如下:（1）谷糠多酚的制備及抗氧化能力的評價。采用丙酮提取谷糠內(nèi)外殼自由態(tài)多酚,將提取完自由態(tài)多酚的谷糠內(nèi)外殼殘渣進一步堿消化,制備結合態(tài)多酚。福林酚法測定總多酚含量,結果顯示谷糠外殼結合態(tài)多酚的含量最高,其次是內(nèi)殼的結合態(tài)多酚（BPIS,boundpolyphenolofinnershell）。采用MTT法和細胞克隆實驗,發(fā)現(xiàn)只有谷糠內(nèi)殼來源的結合態(tài)多酚具有顯著抗結腸癌活性并且對其它腫瘤細胞也具良好的抗增殖效果,將其命名為:BPIS。另外,實驗結果顯示BPIS的抗氧化能力比維生素C的抗氧化性更強。（2）谷糠結合態(tài)多酚BPIS成分鑒定。通過UPLC-Triple-TOF液質(zhì)聯(lián)用技術鑒定出BPIS含有12種多酚成分,分別是香草酸4-O-β-D–吡喃糖苷,葡萄糖基丁香酸、阿魏酸4-O-β-D–吡喃糖苷、4-羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、對-香豆酸、牡荊素、阿魏酸、異阿魏酸、二聚體阿魏酸衍生物和二聚體肉桂酸衍生物等成分。MTT檢測結果發(fā)現(xiàn),BPIS比其分子量小于200的組分抗結腸癌效果更佳。（3）BPIS誘導結腸癌細胞凋亡的分子機制。將細胞內(nèi)ROS通過被DCFH-DA熒光探針標記,結果顯示BPIS能夠顯著升高結腸癌HCT-116細胞內(nèi)ROS含量。采用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),BPIS能夠顯著降低HCT-116細胞的線粒體膜電位。Westernblotting檢測結果顯示caspases家族蛋白caspase-9和caspase-3被BPIS剪切激活且具有濃度依賴性,伴隨著促凋亡蛋白Bax的表達量增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量減少。上述結果證明BPIS能夠誘導結腸癌HCT-116細胞發(fā)生線粒體介導的凋亡效應,且BPIS誘導的凋亡效應能夠被ROS的抑制劑NAC顯著逆轉(zhuǎn),表明BPIS通過增加HCT-116細胞內(nèi)ROS的含量而誘導細胞凋亡。（4）BPIS發(fā)揮抗炎效應的分子機制。采用脂多糖（LPS）構建結腸癌HT-29細胞炎癥模型并用ELISA檢測細胞內(nèi)炎癥因子,發(fā)現(xiàn)BPIS能夠顯著抑制促炎因子IL-1β和IL-6的分泌,增加抗炎因子IL-10的分泌。Westernblotting結果顯示,BPIS能夠阻滯HT-29細胞中炎癥相關轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白的表達和核轉(zhuǎn)位,并且抑制總Akt蛋白和p-Akt^ser473蛋白的表達。采用Akt蛋白的激活劑IGF-1（Insulin-likeGrowthFactors）與BPIS共處理HT-29細胞,結果顯示IGF-1逆轉(zhuǎn)了BPIS對p-Akt^ser473蛋白和NF-κB-p65蛋白的抑制作用,表明p-Akt^ser473蛋白正調(diào)控NF-κB蛋白的表達和核轉(zhuǎn)位。雙熒光素酶報告載體分析揭示,Akt是miR-149的靶基因,RT-PCR結果顯示BPIS能顯著升高HT-29細胞中miR-149的表達。采用DCFH-DA熒光探針標記HT-29細胞內(nèi)ROS,結果顯示BPIS能夠明顯升高HT-29細胞內(nèi)ROS水平。將ROS抑制劑NAC與BPIS共處理HT-29細胞,RT-PCR結果顯示NAC能顯著逆轉(zhuǎn)BPIS對miR-149的上調(diào)作用。結果表明BPIS通過促進HT-29細胞中ROS的產(chǎn)生,上調(diào)miR-149的表達,抑制其靶基因Akt及其下游炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白的表達,阻滯多種促炎癥因子的分泌,以此BPIS發(fā)揮了顯著地抗結腸癌炎癥效應。（5）BPIS逆轉(zhuǎn)結腸癌能量代謝的分子機制。本論文研究發(fā)現(xiàn)BPIS能夠顯著減弱結腸癌HT-29細胞對葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)生,并且通過抑制糖酵解過程中關鍵限速酶PKM2蛋白的表達致使細胞糖酵解速率降低。細胞外酸化率（ECAR）實驗結果表明,BPIS能顯著減弱HT-29細胞的糖酵解速率。說明BPIS有效地減弱了HT-29細胞的有氧糖酵解。另一方面BPIS能通過顯著降低GLS的酶活性抑制SLC蛋白在RNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達,進而抑制HT-29細胞的谷氨酰胺代謝過程。結果還顯示,BPIS能夠抑制c-myc蛋白的表達,表明BPIS逆轉(zhuǎn)的是c-myc介導的結腸癌細胞代謝。本論文已證明BPIS能夠顯著上調(diào)HT-29細胞中miR-149的表達。因此推測miR-149與c-myc蛋白具有負調(diào)控的關系。采用miRDB軟件和KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫搜集miR-149與代謝通路相關的靶基因,通過miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫Miranda和TargetScan預測可以和miR-149結合的靶基因的非編碼區(qū),通過雙熒光酶報告系統(tǒng)揭示c-myc就是miR-149的靶基因,同時驗證了上述二者能夠負調(diào)控的推斷。MTT和細胞克隆實驗發(fā)現(xiàn),BPIS能夠顯著抑制結腸癌HT-29和DLD1細胞的增殖;而且miR-149抑制劑能夠顯著逆轉(zhuǎn)BPIS對結腸癌HT-29和DLD1細胞的抑制作用,表明BPIS通過上調(diào)miR-149的表達而逆轉(zhuǎn)c-myc介導的結腸癌細胞異常能量代謝來發(fā)揮抗結腸癌效應。（6）構建裸鼠結腸癌細胞皮下成瘤模型。采用裸鼠腹腔給藥的方式,每隔2天給藥一次（共注射7次）。結果顯示BPIS能夠顯著抑制結腸癌腫瘤的生長,而裸鼠的正常體重和生長狀況不受影響。采用Westernblotting和免疫組化驗證BPIS在細胞水平已證實的關鍵因子表達情況,如miR-149,p-Akt^ser473,NF-κB,PKM2,c-myc等。結果顯示BPIS在體內(nèi)也具有明顯抗結腸癌效應,與細胞水平的數(shù)據(jù)一致。綜上所述:BPIS是一種來源于谷糠內(nèi)殼的結合態(tài)多酚,該多酚由12種成分組成。BPIS中分子量小于200的組分具有明顯的抗結腸癌活性,但沒有總BPIS的抗結腸癌活性效果好。本文就總BPIS發(fā)揮抗結腸癌效應的分子機制進行深入探討,并通過裸鼠腫瘤模型進行驗證。BPIS處理可以誘導結腸癌細胞產(chǎn)生過量的ROS,過量的ROS一方面激活線粒體介導的凋亡效應,另一方