熒光定量PCR檢測(cè)項(xiàng)目

熒光定量PCR檢測(cè)項(xiàng)目.ppt實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法------TaqMan法

方法：TaqMan法TaqMan---水解型雜交探針與目標(biāo)序列互補(bǔ)5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無(wú)熒光，R與Q分開(kāi)，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerTaqMan?ProbeRQTaqman實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)過(guò)程Displacement5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerRQHydrolysis5’3’5’5’3’5’QRPolymerizationCompleted5’3’5’5’3’5’RQ每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過(guò)程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)原理

常規(guī)PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理定量原理如何對(duì)起始模板定量？

通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析介紹三個(gè)概念：

擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：

橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件熒光閾值熒光信號(hào)閾值（threshold）：

前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過(guò)域值Ct值Ct值的定義：

PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)valueCt值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性定量原理理想的PCR反應(yīng)：

X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：

X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率定量原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí):XCt=X0

(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:logM=logX0

(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:

logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量標(biāo)準(zhǔn)曲線

模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量確定未知樣品的C(t)值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample絕對(duì)定量25標(biāo)本采集和運(yùn)送血液標(biāo)本：用2ml真空采集管或1.5ml高壓滅菌離心管采集血液標(biāo)本，血標(biāo)本采集后在2小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室（HCV采用EDTA抗凝的血漿）。離心（檢驗(yàn)單與標(biāo)本一道）后用一次性吸管吸取血清或血漿加入經(jīng)消毒的1.5ml的離心管中。腦脊液：由臨床醫(yī)生采集后放入消毒的試管中及時(shí)送檢。用于臨床標(biāo)本采集的容器如試管或離心管，均應(yīng)使用前高壓滅菌和密封

標(biāo)本采集后，應(yīng)盡可能快的送至實(shí)驗(yàn)室，如運(yùn)送時(shí)間需2小時(shí)以上，必須用冰盒送至實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，如用于RNA測(cè)定加入4mol/L異硫氰酸胍鹽（GITC）的血清（漿）標(biāo)本和用于DNA測(cè)定的EDTA抗凝血等，則可在室溫下運(yùn)送或郵寄。注：RNA采用EDTA抗凝的全血標(biāo)本，抗凝后6小時(shí)內(nèi)分離血漿，如使用血清標(biāo)本則盡快（2小時(shí)內(nèi)）分離血清。嚴(yán)禁使用肝素抗凝。定量檢測(cè)的臨床意義

治療前進(jìn)行病毒定量檢測(cè)，指導(dǎo)選擇抗病毒藥物，避免盲目用藥。治療后定量PCR直接準(zhǔn)確地測(cè)定體內(nèi)病毒數(shù)量，有助于療效的判斷。懷孕前進(jìn)行定量PCR測(cè)定，有助于選擇有利的懷孕時(shí)機(jī)。HBV基因分型HBV基因型是根據(jù)HBV病毒核酸異源性≥8%進(jìn)行分型分為A、B、C、D、E、F、G、H等8種亞洲主要為B型以及C型感染HBV后的臨床經(jīng)過(guò)與不同基因型有關(guān)HBV基因型的臨床意義HBV標(biāo)志物清除與B基因型相比，C基因型有更高的HBeAg陽(yáng)性率，分別為16%與53%Ｂ基因型的自發(fā)性HBeAg清除要比C基因型早10年，并且在HBeAg清除后，肝臟生物化學(xué)指標(biāo)持續(xù)正常。病毒致病性HBsAg陽(yáng)性者中，C基因型比B基因型的肝功能異常更為常見(jiàn)。C基因型引起的臨床表現(xiàn)及組織學(xué)損傷更嚴(yán)重。乙型肝炎的病程及轉(zhuǎn)歸亞洲無(wú)癥狀HBV攜帶中，與B基因型比較,C基因型在肝硬化及50歲以上的肝細(xì)胞癌患者中比例較高,而B(niǎo)基因型與50歲以下,特別是35歲以下的肝細(xì)胞癌患者有關(guān)。藥物敏感性給予干擾素治療時(shí)，B基因型的完全應(yīng)答率達(dá)到C基因型的3倍HBeAg陽(yáng)性乙型肝炎患者使用拉米呋定治療時(shí),發(fā)現(xiàn)B基因型患者的HBeAg/HBeAb轉(zhuǎn)陰率達(dá)到C基因型的兩倍

HBV不同基因型比較

B型C型流行性低高HBeAg陽(yáng)性率低高HBeAg自然清除時(shí)間短長(zhǎng)HBVDNA載量低高致病性輕重HCC發(fā)生率低（低年齡組高）高（高年齡組高）干擾素治療完全應(yīng)答率高低抗病毒治療效果好差肝癌手術(shù)治療預(yù)后好差癌栓栓塞治療效果好差注意事項(xiàng)在病毒定量>103時(shí),檢測(cè)基因分型更有意義可能出現(xiàn)分型結(jié)果出現(xiàn)陰性,排除本身病毒量低的原因外,患者HBV基因型可能為非B,C型HBV—拉米夫定拉米夫定(Lamivudine,Heptodin)“有效”——核苷類高效抗乙肝病毒藥物，可迅速降低HBV-DNA的滴度，改善肝臟組織的病變，還可能阻止纖維化的進(jìn)程，終止肝硬化的發(fā)展?！澳退帯薄L(zhǎng)期服用，會(huì)引起HBV基因突變，造成HBV對(duì)藥物敏感性大大降低，從而血清中HBV復(fù)制恢復(fù)活躍，滴度升高。耐藥機(jī)理HBV聚合酶中Y(酪氨酸）

M（蛋氨酸）D（天門冬氨酸）D（天門冬氨酸)變異毒株的生物特性：對(duì)拉米夫定抗病毒效應(yīng)的敏感性降低至1／300，DNA減少僅1／7。臨床癥狀：血清ALT水平暫時(shí)上升，HBV-DNA的濃度上升,并有輕度乏力、惡心等肝臟炎癥