GB-T《核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶純度檢測(cè)方法》

GB/TXXXXXGB/TXXXXX—2012核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶純度檢測(cè)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶純度檢測(cè)原理、儀器設(shè)備及器具、主要試劑、分析步驟和結(jié)果分析。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生化試劑核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶產(chǎn)品的生產(chǎn)、監(jiān)督和檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）水解核糖核酸（RNA）中磷酸二酯鍵，生成寡核苷酸或單核苷酸核酸的核酸酶。根據(jù)酶作用的位置不同，可進(jìn)一步分為內(nèi)切核糖核酸酶與外切核糖核酸酶。3.2脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）水解脫氧核糖核酸（DNA）中磷酸二酯鍵，生成寡核苷酸或單核苷酸的核酸酶。根據(jù)酶作用的位置不同，可分為內(nèi)切脫氧核糖核酸酶與外切脫氧核糖核酸酶。4原理在一定濃度的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）中分離分子量不同的蛋白質(zhì)，并用考馬斯亮藍(lán)（CBB）染色，成像后進(jìn)行核酸酶的純度檢測(cè)。5儀器設(shè)備及器具5.1電泳系統(tǒng)。5.2凝膠掃描裝置。5.3水平脫色搖床，轉(zhuǎn)速45rpm/min。5.4電子天平：精度為0.0001g和0.01g。6主要試劑本方法所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6882規(guī)定的二級(jí)水。6.130%（w/v）亞甲基雙丙烯酰胺溶液（Acr-Bis）取丙烯酰胺29.00g，N，N’-甲叉雙丙烯酰胺1.00g，加入60mL水，充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?00mL。用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾除菌和雜質(zhì)后儲(chǔ)于棕色瓶，4℃避光保存。如有沉淀應(yīng)過(guò)濾，兩個(gè)月后溶液應(yīng)重新配制備用。6.20.5mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液（Tris-HCl），pH6.8取6.06g三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶于80mL的水中，充分?jǐn)嚢枞芙?，用HCl調(diào)pH值為6.8，定容至100mL，室溫保存?zhèn)溆谩?.31.5mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液（Tris-HCl），pH8.8取18.17g三羥甲基氨基甲烷溶于80mL的水中，充分?jǐn)嚢枞芙?，用HCl調(diào)pH值為8.8，定容至100mL，室溫保存?zhèn)溆谩?.410%（w/v）十二烷基磺酸鈉（SDS）溶液取2.00g十二烷基磺酸鈉溶于約16mL的水中，超聲溶解后定容至20mL，室溫保存?zhèn)溆谩?.510%（w/v）過(guò)硫酸銨（APS）溶液取0.10g過(guò)硫酸銨于1.5mL離心管，加1mL水溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。6.610倍Tris-甘氨酸電極緩沖液取30.00gTris、144.00g甘氨酸、10.00gSDS溶于800mL水中，定容至1L，室溫保存，使用時(shí)稀釋10倍。6.75倍十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）加樣緩沖液取1.25mL1mol/LTris-HCl（pH6.8）、SDS0.50g、2.5mL甘油、25.0mg溴酚藍(lán)，用水溶解定容至5mL，按照每管500μL分裝后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩ＥR用前每管加0.0780g二硫蘇糖醇（DTT），現(xiàn)配現(xiàn)用。6.8染色液染色液A：考馬斯亮藍(lán)G-2500.10g、乙醇50mL、85%（m/v）磷酸25mL，用水定容至1000mL，保存?zhèn)溆?。染色液B：考馬斯亮藍(lán)R-2500.50g、冰乙酸25mL、乙醇250mL，用水定容至500mL，室溫保存6.9脫色液取100mL冰乙酸、400mL甲醇，用水定容至1L，室溫保存。6.10標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量為6.5kDa-200kDa。6.111.0mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液取10.0純度≥98%的牛血清白蛋白，溶于10mL濃度為0.15mol/L的NaCl溶液中，-20℃保存。7分析步驟7.1蛋白含量測(cè)定7.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線取酶標(biāo)板按照表1依次加入試劑，震蕩混勻30秒后放置2分鐘，再次震蕩混勻后在595nm波長(zhǎng)下通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光值，以蛋白實(shí)際含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線（此線應(yīng)通過(guò)零點(diǎn)）。得出線性回歸方程和回歸系數(shù)（R2）?；貧w系數(shù)在0.9990及以上時(shí)，方可使用，否則應(yīng)重做。每次實(shí)驗(yàn)均需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1標(biāo)準(zhǔn)曲線配方序號(hào)012345染色液A（μL）195195195195195195水（μL）543210牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（μL）012345蛋白實(shí)際含量（μg）0123457.1.2樣品蛋白含量測(cè)定稱取10.0mg待測(cè)樣品溶解于10.0mL水中，濃度為1.0mg/mL。序號(hào)0號(hào)為對(duì)照，另取待測(cè)樣品5μL，加入染色液A195μL為待測(cè)組，震蕩混勻30秒后放置2分鐘，再次震蕩混勻后在595nm波長(zhǎng)下通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光值，記錄吸光值。7.2電泳樣品制備稱取25.0mg待測(cè)樣品溶解于10mL水中，濃度為2.5mg/mL。其中核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶樣品分別稀釋為濃度0.625mg/mL、1.250mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用，并將稀釋后的待測(cè)樣品20μL與5倍電泳（SDS）加樣緩沖液5μL在一個(gè)離心管中混合，100℃水浴加熱10min后，冷卻備用。7.3電泳裝板將電泳所使用的玻璃板洗凈、晾干，短板向外，長(zhǎng)板向內(nèi)嵌入塑料架中，并固定。7.4電泳分離膠和濃縮膠的配制組裝制膠裝置，按表2分別配置4%濃縮膠和12%分離膠溶液表2濃縮膠、分離膠配方4%濃縮膠（mL）12%分離膠（mL）30%Acr-Bis0.653.971.5MTris-HCl（pH8.8）02.50.5MTris-HCl（pH6.8）1.25010%APS0.050.110%SDS0.050.1水3.083.4四甲基乙二胺（TEMED）0.0050.0057.5電泳上樣核糖核酸酶樣品或脫氧核糖核酸酶樣品對(duì)應(yīng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的選擇分別為分子量6.5kDa-66.4kDa、6.5kDa-200kDa，上樣量均為10μL，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。7.6電泳在配置好的電泳裝置系統(tǒng)中加入電極緩沖液，浸沒(méi)電極，采用微量加樣器分別吸取待測(cè)樣品，初始電泳按照每塊膠加70V電壓，待樣品中的溴酚藍(lán)指示劑超過(guò)濃縮膠與分離膠分界線時(shí)，加大電壓至110V繼續(xù)電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑前沿到達(dá)電泳槽底部時(shí)停止電泳。7.7電泳染色與脫色電泳結(jié)束后將凝膠移至染色盒中，加入染色液，置于水平搖床染色至條帶清晰，隨后倒出染色液，加入脫色液，置于水平搖床上脫色至凝膠底色脫盡且蛋白條帶清晰可辨，期間可更換脫色液。8結(jié)果分析8.1條帶分析將待測(cè)樣品電泳條帶與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)電泳條帶對(duì)比，并進(jìn)行判定。8.2蛋白含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測(cè)樣品蛋白含量，用百分比表示（%）。8.3純度計(jì)算脫色后，將凝膠轉(zhuǎn)移至蛋白印記成像系統(tǒng)中成像，拍照記錄樣品3條平行實(shí)驗(yàn)條帶。再將拍好的圖像于電泳凝膠定量分析軟件中計(jì)算樣品中核糖核酸酶或者脫氧核糖核酸酶所占的比例（%），樣品3個(gè)重復(fù)結(jié)果的平均值與待測(cè)樣品蛋白含量的乘積值即為待測(cè)樣品的實(shí)際平均相對(duì)純度（用百分比表示）。8.3重復(fù)性在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：。本標(biāo)準(zhǔn)主要