植物轉錄因子轉錄活性分析系統(tǒng)開發(fā)及驗證

摘要`

轉錄因子對很多下游基因的表達具有調(diào)控作用,在植物的生長發(fā)育、代謝及抵抗生物和非生物脅迫為中起著重要作用。隨著全球環(huán)境的惡化以及人口增長的壓力，植物抗逆機制和植物抗逆性的研究對于可持續(xù)發(fā)展的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)來說是至關重要的。植物經(jīng)過長期的自然選擇，不斷進化以適應外界環(huán)境的變化，形成了對各種環(huán)境脅迫的適應性或抗逆能力。植物體通過感受環(huán)境脅迫信號，通過多種信號轉導途徑，誘導一系列相關基因的表達，參與響應脅迫反應，調(diào)節(jié)體內(nèi)生理生化代謝，形成抗逆防御反應體系，以抵御環(huán)境脅迫對植物體的傷害。轉錄因子是一類能夠與啟動子區(qū)域順式作用元件特異性結合的蛋白質(zhì)，是植物中最大的基因家族之一。本實驗通過構建攜帶GAL4順式元件(GAL-UAS)雙熒光素酶報告子載體和GAL4BD(GAL4的DNABinding結構域)融合表達目的轉錄因子(已知具有轉錄抑制活性的OsMADS57和轉錄激活活性的OsDRAP1)的效應子載體，通過農(nóng)桿菌介導的煙草瞬時轉化體系對該系統(tǒng)進行驗證，明確轉錄因子轉錄活性分析系統(tǒng)的靈敏性。研究結果將為進一步探究候選基因（轉錄因子）的生物學功能、轉錄調(diào)節(jié)機制研究提供技術支撐。關鍵詞：植物；轉錄因子；雙熒光素酶；轉錄活性；GAL4

AbstractTranscriptionfactorsplayaregulatoryroleintheexpressionofmanydownstreamgenesandplayanimportantroleinplantgrowth,metabolismandresistancetobiologicalandabioticstress.Withthedeteriorationoftheglobalenvironmentandthepressureofpopulationgrowth,thestudyofplantresistancemechanismandplantresistanceisveryimportantforsustainablemodernagriculture.Plantshaveevolvedoveralongperiodoftimetoadapttochangesintheexternalenvironment,forminganadaptableorresistantabilitytovariousenvironmentalstress.Byfeelingthesignalofenvironmentalstress,throughavarietyofsignaltransductionchannels,theplantbodyinducestheexpressionofaseriesofrelatedgenes,participatesintheresponsetothestressresponse,regulatesthephysiologicalandbiochemicalmetabolisminthebody,andformsananti-reversaldefensiveresponsesystemtoresistthedamagetotheplantbodybyenvironmentalstress.Transcriptionfactorisisaclassofproteinsthatcanbindspecificallytotheco-actingelementsofthepromoterregionandisoneofthelargestgenefamiliesinplants.ThisexperimentverifiedthesystembyconstructinganeffectsubcarrierthatcarriesGAL4-cherokinenzymereportingsubcarriersandGAL4BD(THEDNABindingdomainofGAL4)fusionexpressionpurposetranscriptionfactors(OsMADS57knowntohavetranscriptioninhibitionactivityandosDRAP1withtranscriptionalactivationactivity)toverifythesystemthroughtheagriculturalbacteria-mediatedtobaccotransientconversionsystem.Theresultswillprovidetechnicalsupportforfurtherexplorationofthebiologicalfunctionofcandidategenes(transcriptionfactors)andthestudyoftranscriptionalchemymechanisms.Keywords:Plants;transcriptionfactors;difluoroenzyme;transcriptionactivity;GAL4緒論1.1植物響應非生物脅迫反應旱澇、鹽漬、高低溫影響了植物的生長發(fā)育，這些非生物脅迫在自然環(huán)境中非常常見，造成了農(nóng)作物產(chǎn)量下降。由于植物固定的生長在一個地方，不能移動，在長期進化過程中，為了避免這些惡劣脅迫，為了適應各種各樣的環(huán)境條件，植物從分子、細胞、生理生化等方面形成相應的抵抗機制(黃立鈺，2010)。1.1.1非生物脅迫對植物的影響土壤鹽漬化是導致作物減產(chǎn)的重要影響因素之一，受到人們越來越多的重視。在鹽協(xié)迫情況下，植物的形態(tài)發(fā)育受到影響，表現(xiàn)為抑制組織和器官的生長，加速發(fā)育過程，縮短營養(yǎng)生長和開花期，鹽協(xié)迫也影響植物生理生化代謝，表現(xiàn)為植物細胞脫水，膜系統(tǒng)破壞，位于膜上的酶功能紊亂，各種代謝無序進行最終導致膜透性的改變，表現(xiàn)為組織因缺水而引起氣孔關閉、葉綠體受損，與光合作用相關酶失活或變性，光合速度下降，同化物合成減少，表現(xiàn)為呼吸作用先加強而后減弱；表現(xiàn)為加速貯藏蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)生有害物質(zhì)，使植物細胞受到毒害，鹽協(xié)迫對植物造成的傷害是由于離子協(xié)迫和滲透協(xié)迫引起的。不同激素在植物體內(nèi)的含量會隨著逆境脅迫而發(fā)生不同程度的變化。作為一種逆境脅迫激素，ABA在植物體內(nèi)的含量會隨著鹽脅迫的處理而相應的變化，其下游信號通路也會隨之改變(宿明星等，2015）。干旱脅迫和水澇脅迫是水分脅迫的兩種表現(xiàn)形式（楊映雪，2013）。水分缺失造成的脅迫稱為干旱脅迫。生長緩慢是植物體在干旱的環(huán)境條件下表現(xiàn)出的現(xiàn)象，在干旱環(huán)境下，植物為了生存，葉片數(shù)量和葉片面積會顯著減少，生物量在植物體內(nèi)的合成含量也會隨著干旱脅迫而變化。由于植物體內(nèi)水分過多而引起的脅迫叫水澇脅迫。與前面鹽脅迫相類似，細胞的膜結構破壞，對光合作用的影響，同時還會造成植物根部缺氧是水澇脅迫對植物的主要危害，它會打破植物體內(nèi)在的平衡狀態(tài)，自由基的大量積累加速植物衰老。水澇脅迫還會導致光合速率降低但光呼吸作用加強。有害物質(zhì)的過多積累限制植物的生長。同時植物根部對礦質(zhì)元素的吸收能力下降。植物體內(nèi)的激素乙烯和ABA含量在干旱脅迫和水澇脅迫的情況下都是增加的（李娟等，2019）。溫度對植物的生長發(fā)育起著關鍵作用（劉燕敏等，2018）。其中高溫和低溫脅迫是溫度脅迫的兩種形式，通過觀察溫度高于零度或低于零度可以把低溫脅迫分為冷脅迫和冰凍脅迫。植物細胞膜的完整性受到溫度的影響，過高或過低的溫度都會破壞植物體細胞膜。另外，線粒體和高爾基體等細胞器也受其影響。細胞膜所具有的選擇性吸收的能力會喪失，受脅迫影響程度可根據(jù)相對電導率的數(shù)值來判斷。在溫度低于零度以下時，會導致細胞內(nèi)結冰,毒害物質(zhì)的積累增加，蛋白質(zhì)等生物大分子的結構和功能受損，在植物光合作用中的過程中，植物對溫度的感知是比較敏感的，溫度脅迫會致使相關酶活性受到影響，導致凈光合速率減弱。另外，呼吸代謝過程中酶的鈍化也受溫度的影響，成為植物生長中的不利作用（張丹等，2019）。1.2植物轉錄因子的研究概況轉錄因子(transcriptionfactor,TF)是能與位于轉錄起始位點上游50~5000bp的順式作用元件、增強子或沉默子結合來激活或者抑制目的基因表達的蛋白質(zhì)（王傳琦等，2013；樊松樂等，2019）。轉錄因子的結構包括DNA結合區(qū)(DNA-bindingdomain)、轉錄調(diào)控區(qū)(transcriptionregulationdomain)、寡聚化位點(oligomerizationsite)、核定位信號(nuclearlocalizationsingal,NLS)（劉強等，2000），轉錄因子至少由兩個結構域組成，DNA結合結構域(DNA-bindingdomain)和轉錄調(diào)控結構域(Transcriptionregulationdomain)。DNA結合結構域特異性結合順式作用元件，轉錄調(diào)控結構域激活或抑制靶基因表達。它們共同調(diào)節(jié)靶基因的轉錄起始速率和植物的生長發(fā)育、代謝等過程（劉相蓮等，2017）。1.2.1植物轉錄因子的類型NAC(NAM、ATAF1/2、CUC2)是植物特有的最大的轉錄因子家族之一，具有獨特的結構特征，由保守的N端結構域和多變的C端轉錄激活域組成。9大多數(shù)NAC蛋白具有保守的DNA結合結構域，其大約150個氨基酸位于蛋白質(zhì)的N末端，并且在C末端區(qū)域具有高度可變的轉錄調(diào)節(jié)區(qū)域（張慧珍等，2019；王芳等，2019）。bHLH轉錄因子因含有bHLH結構域而得名。bHLH結構域由50~60個氨基酸組成，可分為長度為10~15個氨基酸的堿性氨基酸區(qū)和40個氨基酸左右的α-螺旋-環(huán)-α-螺旋區(qū)(HLH區(qū))。堿性氨基酸區(qū)位于bHLH結構域的N-端，具有DNA識別和結合位點。植物中50%以上的堿性氨基酸區(qū)含有高度保守的H5-E9-R13序列(His5-Glu9-Arg13)，其對bHLH和靶標DNA的結合必不可缺（AtchleyWRetal.,1997;AmoutziasGDetal.,2004;StevensJDetal.,2008;PiresNetal.,2010）MYB家族是植物中最大的轉錄因子家族之一，約占擬南芥總轉錄因子家族的9%16MYB類轉錄因子的得名是因其結構上都有一段保守的DNA結合區(qū)，即MYB結構域。MYB轉錄因子結構域的N端區(qū)域都是高度保守的，且該結構域由1-3個串聯(lián)的且不完全重復的R結構(R1,R2和R3)組成。R結構是由50個左右的氨基酸組成的折疊蛋白，包含一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列，其中氨基酸殘基以螺旋-轉角-螺旋(HTH)的形式參與到與DNA的結合過程間隔序列則由一個色氨酸殘基組成，每隔18個氨基酸會間隔著一個色氨酸殘基，這個色氨酸起著疏水核心的作用，對維持HTH的構型具有重要意義(OgataKetal.,1995;LipsickJ.S.,1996;馮盼盼等，2016)。植物AP/ERF轉錄因子超家族是一個龐大的轉錄因子家族，其蛋白質(zhì)序列中含有1或2段由60~70個氨基酸殘基組成的AP2/ERF結構域18。依據(jù)AP2/ERF結構域數(shù)的不同，可以將AP2/ERF類轉錄因子分成4個亞族:DREB(dehydration-responsiveelementbindingprotein)、ERF(Ethylene-responsiveelementbindingfactors)、AP2(APETALA2)、RAV(relatedtoABI3/VP1)4個亞族，DREB亞族和ERF亞族僅含1個AP2/ERF結構域，AP2亞族含有2個AP2/ERF結構域，而RAV亞族除了含有1個AP2/ERF結構域之外還含有1個B3結構域(SakumaYetal.,2002)。1.3植物轉錄因子轉錄活性技術體系研究進展目前對于植物轉錄因子轉錄活性的研究主要是酵母激活系統(tǒng)。酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)是1989年由Field提出并建立(FieldsSetal.,1989)。它是將待研究的兩種蛋白質(zhì)的基因分別克隆到酵母表達質(zhì)粒的轉錄激活因子(如GAL4等)的DNA結合結構域基因和GAL4激活結構域基因，構建成融合表達載體，從表達產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)，是基于對真核生物調(diào)控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。反式轉錄激活因子，例如酵母轉錄因子GAL4在結構上是組件式的(modular)，往往由兩個或兩個以上結構上可以分開，功能上相互獨立的結構域(domain)構成，其中有DNA結合功能域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和轉錄激活結構域(activationdomain，DNA-AD)。這兩個結合域?qū)⑺鼈兎珠_時仍分別具有功能，但不能激活轉錄，只有當被分開的兩者通過適當?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉錄因子活性，并可激活上游激活序列(UAS)的下游啟動子，使啟動子下游基因得到表達。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，“誘餌”蛋白X克隆至DNA-BD載體中，表達DNA-BD/X融合蛋白；待測試蛋白Y克隆至AD載體中，表達AD/Y融合蛋白。一旦X與Y蛋白間有相互作用，則DNA-BD和AD也隨之被牽拉靠近，恢復行使功能，激活報告重組體中LacZ基因的表達。隨著酵母雙雜交系統(tǒng)的應用與完善，li等1993年提出了酵母單雜交技術(LIJJetal.,1993)通過對報告基因的表型檢測，分析DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用，以研究真核細胞內(nèi)的基因的表達與調(diào)控，由于酵母單雜交方法檢測特定轉錄因子與順式作用元件專一性作用的敏感性，現(xiàn)在已被廣泛用于克隆細胞中含量微弱的轉錄因子。1.4研究目的及意義目前利用酵母激活系統(tǒng)僅能對轉錄因子的轉錄激活功能進行分析，尚還缺乏對于植物體內(nèi)轉錄因子的轉錄抑制活性方面的研究。本實驗將酵母轉錄活性研究體系與雙熒光素酶報告系統(tǒng)融合，開發(fā)一套通用的植物體內(nèi)轉錄因子活性分析體系。2材料和方法2.1實驗材料2.1.1供試植物供試材料為水稻品種‘日本晴’(OryzasativaL.，cv.Nipponbare)。將水稻種子用水培裝置培養(yǎng)，待長到兩葉一心時取適量水稻葉片，用ddH2O沖洗干凈后放入液氮中速凍，再放入-80℃冰箱保存。2.1.2主要儀器與設備PCR儀、超凈工作臺、搖床、酶標儀2.1.3主要試劑及溶液配制YEP培養(yǎng)基配方：表1YEP培養(yǎng)基配方成分名稱用量（/L）牛肉浸膏10g酵母提取液10gNaCl5gPH7.0重懸液配方：表2重懸液配方成分名稱用量（/L）MgCl210mmolMES10mmolPH5.62.2RNA提取和cDNA合成水稻葉片總RNA提取根據(jù)OMEGA公司的PlantRNAKit(R6827-01)的方法進行，采用NanoDropOne進行純度和濃度檢測，RNA置于-80℃冰箱保存?？俁NA反轉錄第－鏈cDNA參照TIANGEN公司的快速反轉錄試劑盒(Cat#KR116-02)的方法進行，20μl的cDNA稀釋至100μl，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.3雙熒光素酶報告子載體的構建合成GAL4順式元件序列GAL-UAS和35Sminimal(含TATAbox)序列(Brametal.,1985;Elliottetal.,2008;Vasheeetal.,1993,Liuetal.,1994;Ulmasovetal.,1995,1997a,1997b,1999a1999b)，用限制性內(nèi)切酶KpnI和SpeI進行酶切消化后插入到pGreenII0800熒素酶報告基因(LUC)前，完成雙熒光素酶報告子載體的構建，命名為pGreenII0800-GAL。2.4效應子載體構建所有的效應基因都由CaMV35S(2×)啟動子控制(Skuzeskietal.,1990)，并包含3’胭脂氨酸合成酶未翻譯區(qū)(Liuetal.,1994;Ulmasovetal.,1995)?？寺AL4的DNA結合結構域(GAL4-BD,aminoacids1to147)(Tiwarietal.,2001)，用限制性內(nèi)切酶AscI和KpnI進行酶切消化后插入到pMDC43(Curtisetal.,2003)的多克隆位點，替換pMDC43的GFP片段(命名為pMDC43-GAL4/BD)，轉化大腸桿菌DB3.1，挑取單克隆進行菌液PCR檢測，陽性克隆送往擎科生物技術有限公司測序。2.5轉錄因子轉錄活性系統(tǒng)的驗證根據(jù)基因序列，用PrimerPremier5.0軟件設計引物TA克隆已知轉錄因子(OsMADS57具抑制活性)和OsDRAP1(具激活活性)編碼區(qū)序列，構建到中間載體pGWC-T(Chenetal.,2006)上，然后利用Gateway技術將編碼區(qū)序列插入pMDC43-GAL4/BD，使目的基因與GAL4-BD融合(命名為pMDC43-GAL4/BD-OsMADS57和pMDC43-GAL4/BD-OsDRAP1)。構建成功的重組質(zhì)粒送往擎科生物技術有限公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒(pGreen0800II-GAL和pMDC43-GAL4/BD-OsMADS57、pMDC43-GAL4/BD-OsDRAP1)采用熱激法分別轉入農(nóng)桿菌EHA105中，在含有利福平和卡那霉素的YEP培養(yǎng)基上篩選，挑取陽性克隆，擴大培養(yǎng)至30mL液體YEP培養(yǎng)基中，至OD600=1.5；室溫,5000g離心10min，棄掉上清液，用重懸液(10mmol?L-1MgCl2，10mmol?L-1MES，pH5.6；高溫高壓滅菌后，加100μmol?L-1乙酰丁香酮)重懸菌體，至OD600=1.0，室溫放置2~3h。報告菌株或單獨培養(yǎng)，或與效應菌株混合培養(yǎng)(報告菌株:效應比為1:9或2:8)。將農(nóng)桿菌懸液置于10毫升注射器中，用手小心按壓滲透到生長1月左右的健康的煙草葉片下表面。將注射后的煙草置于黑暗中24h，植物入滲后留置3天。根據(jù)制造商的指示(Promega)，采集葉片樣本，使用雙熒光素酶反應(DLR)試劑進行雙熒光素酶測定。測定螢火蟲熒光素酶活性后，在反應中加入40ulStopandGlowbuffer(Promega)滅活螢火蟲熒光素酶，并啟動REN熒光素酶(REN)反應，根據(jù)LUC/REN比值對轉錄活性進行分析，驗證該報告系統(tǒng)的正確性。3結果分析3.1雙熒光素酶報告子載體的構建用限制性內(nèi)切酶KpnI和SpeI酶切合成的GAL4順式元件序列GAL-UAS（圖1A），得到的目的片段純化后，用T4連接酶連接到報告載體pGreenII0800上，重組質(zhì)粒的酶切鑒定產(chǎn)物如圖1B中所示，片段大小符合預期，重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證正確，說明質(zhì)粒構建成功。 A M1 1 2 B M134201bp201bp 201bp圖1pGreenII0800-GAL報告子載體構建A：GAL-UAS雙酶切；B：重組質(zhì)粒構建M1：DL2000marker；1，2：GAL-UAS雙酶切產(chǎn)物；3，4：pGreenII0800-GAL酶切檢測；Fig.2ConstructionoftheReporterpGreenII0800-GALA：DoubledigestionofGAL-UAS;B:ConstructionofrecombinantplasmidM1：DL2000marker；1,2:DoubledigestionproductofGAL-UAS;3,4:IdentificationofpGreenII0800-GALbyrestrictionenzymesdigestion;3.2效應子載體的構建從pGBKT7載體上克隆GAL4-BD(如圖2A)，得到的目的片段純化后，用限制性內(nèi)切酶KpnI和AscI進行雙酶切，再用T4連接酶連接到效應載體pMDC43上，重組質(zhì)粒的酶切鑒定產(chǎn)物如圖2B中所示，片段大小符合預期，重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證正確，說明質(zhì)粒構建成功。A BM112M1345 442bp 442bp圖2pMDC43-GAL4/BD效應子載體構建A：GAL4-BD擴增；B：重組質(zhì)粒構建M1：DL2000marker；1，2：GAL4-BDPCR產(chǎn)物；3，4：pMDC43-GAL4/BD酶切檢測；5：pMDC43空載體酶切Fig.2ConstructionoftheEffectorpMDC43-GAL4/BDA:PCRamplificationofGAL4-BD;B:ConstructionofrecombinantplasmidM1:DL2000marker;1,2:PCRproductofGAL4-BD;3,4:IdentificationofpMDC43-GAL4/BDbyrestrictionenzymesdigestion;5:IdentificationofthevectorpMDC43.3轉錄因子OsMADS57和OsDRAP1轉錄活性分析 為了驗證轉錄因子轉錄活性系統(tǒng)的正確性，我們結合擬南芥原生質(zhì)體中建立的GAL4DNA結合結構域(GAL4-BD)和GAL4BD結合位點[GAL4(4X)-D1-3(4X)-GUS]的瞬時表達系統(tǒng)(Tiwarietal.,2001;)：將OsMADS57和OsDRAP1編碼序列全長（圖3A）分別融合到GAL4BD載體(在35S啟動子的控制下)，以GAL4BD-OsMADS57和GAL4BD-OsDRAP1為驅(qū)動因子，以4個拷貝的GAL4DNA結合位點[GAL4(4x)-D1-3(4x)]驅(qū)動的熒光素酶(luciferase,LUC)基因為作為報告基因（圖3B）。與對照（注射報告菌株和空載體）相比，煙草中同時注射OsMADS57效應菌株和報告菌株得到更低的LUC/REN比率，表明OsMADS57具轉錄抑制活性；而注射OsDRAP1效應菌株和報告菌株得到更高的LUC/REN比率（圖3C），表明OsDRAP1具轉錄激活活性。A M112 BOsMADS57OsDRAP1 OsMADS57OsDRAP1C

圖3OsDRAP1和OsMADS57轉錄活性分析A：OsDRAP1和OsMADS57基因擴增；B：效應子載體和報告子載體結構示意圖M1：DL2000marker；1，2：OsDRAP1和OsMADS57PCR產(chǎn)物；Fig.3TranscriptionalactivityanalysisofOsDRAP1andOsMADS57(A)PCRamplificationofOsDRAP1andOsMADS57;(B)Theschematicdiagramshowstheconstructsusedinthetranscriptionalactivityanalysisassay;(C)TheratioofLUCandREN.4討論轉錄因子通過轉錄激活或轉錄抑制對目的基因發(fā)揮調(diào)控作用，然而，目前對于相關轉錄因子的轉錄活性分析僅有轉錄激活分析(酵母激活體系)，且較為麻煩，不僅需要單獨設置內(nèi)參，還要排除假陽性；重復性差，只能定性，不能做到定量分析。而對于轉錄因子抑制活性的研究更是缺乏通用的技術體系。本文通過構建攜帶GAL4順式元件G(AL-UAS)(Brametal.,1985;Elliottetal.,2008)雙熒光素酶報告子載體和GAL4BD融合表達目的轉錄因子(已知具有轉錄抑制活性的OsMADS57和轉錄激活活性的OsDRAP1)的效應子載體，采用農(nóng)桿菌介導的煙草瞬時轉化體系對該系統(tǒng)進行驗證，對比三種檢測方法，結果均顯示OsMADS57具有轉錄抑制活性，而OsDRAP1具有轉錄激活活性，表明該系統(tǒng)具有較好的轉錄活性檢測能力。因此，筆者針對過去的不足，所開發(fā)的植物轉錄因子活性分析系統(tǒng)不僅具有快速、準確、靈敏度高等優(yōu)點；同時，本文構建的雙熒光素報告系統(tǒng)，不用單獨設置內(nèi)參，解決了內(nèi)參問題。是一套具有廣泛通用性的轉錄活性分析技術體系，可為候選基因(轉錄因子)生物學功能的深入挖掘及其轉錄調(diào)節(jié)機制的研究提供技術支撐。5結論參考文獻黃立鈺.水稻抗逆候選基因OsPDCD5和OsbHLH59的功能分析[D].中國農(nóng)業(yè)科學院,2010.王傳琦,孔穩(wěn)穩(wěn),李晶.植物轉錄因子最新研究方法[J].生物技術通訊,2013,24(01):118-123.宿明星,孫穎顥,施鶴,李秋莉.植物非生物脅迫相關轉錄因子研究方法[J].生物技術通報,2015,31(01):51-60.樊松樂,王紀坤,覃碧,王立豐.植物轉錄因子研究方法及應用[J].分子植物育種,2019,17(15):5003-5009.李娟,高凱,安新民.轉錄因子NF-Y在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應中的作用[J].中國細胞生物學學報,2019,41(12):2434-2442.張丹,馬玉花.NAC轉錄因子在植物響應非生物脅迫中的作用[J].生物技術通報,2019,35(12):144-151.劉燕敏,周海燕,王康,閆洪朗,徐建平,吳俊平,魏小云,何林池.植物對非生物脅迫的響應機制研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2018,46(16):35-37+62.楊映雪.非生物脅迫對植物的影響及植物的抵抗機制[J].生物技術世界,2013(09):34.劉強,張貴友,陳受宜.植物轉錄因子的結構與調(diào)控作用[J].科學通報,2000(14):1465-1474.劉相蓮,喬芳,黃德玉,袁宗輝,王旭.轉錄因子研究方法進展[J].生理科學進展,2017,48(01):73-76.張慧珍,白雪芹,曾幼玲.植物NAC轉錄因子的生物學功能[J].植物生理學報,2019,55(07):915-924.王芳,孫立嬌,趙曉宇,王婕婉,宋興舜.植物NAC轉錄因子的研究進展[J].生物技術通報,2019,35(04):88-93.AtchleyWR,FitchWM.Anaturalclassificationofthebasichelix-loop-helixclassoftranscriptionfactors[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1997,94:5172-5176.AmoutziasGD,RobertsonDL,OliverSG,etal..Convergentevolutionofgenenetworksbysingle-geneduplicationsinhighereukaryotes[J].EMBORep.,2004,5:274-279.StevensJD,RoalsonEH,SkinnerMK.Phylogeneticandexpressionanalysisofthebasichelix-loop-helixtranscriptionfactorgenefamily:genomicapproachtocellulardifferentiation[J].Differentiation,2008,76:1006-1022.PiresN,DolanL.Originanddiversificationofbasic-helix-loop-helixproteinsinplants[J].Mol.Biol.Evol.,2010,27:862-874.馮盼盼,陳鵬,洪文杰,等.擬南芥MYB轉錄因子家族研究進展[J].生命科學研究,2016,20(6):555-560.LipsickJ.S.,1996,OnebillionyearsofMYB,Oncogene,13(2):223-235.OgataK.,MorikawaS.,NakamuraH.,HojoH.,YoshimuraS.,ZhangR.H.,AimotoS.,AmetaniY.,HirataZ.,SaraiA.,IshiiS.,andNishimuraY.,1995,ComparisonofthefreeandDNA-complexedformsoftheDNA-bindingdomainfromc-Myb,Nat.Struct.Biol.,2(4):309-320.Ohme-TakagiM,ShinshiH.Ethylene-inducibleDNAbindingproteinsthatinteractwithanethylene-responsiveelement[J].PlantCell,1995,7(2):173-182.SakumaY,LiuQ,DubouzetJG,etal.DNA-bindingspecificityoftheERF/AP2domainofArabidopsisDREBs,transcriptionfactorsinvolvedindehydration-andcold-induciblegeneexpression[J].BiochemBiophysResCommun,2002,290:998-1009.NakanoT,SuzukiK,FujimuraT,etal.Genome-wideanalysisoftheERFgenefamilyinArabidopsisandrice[J].PlantPhysiol,2006,140(2):411-432.崔紅軍,魏玉清.酵母雙雜交系統(tǒng)及其應用研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2015,43(13):45-47.FieldsS,SONGO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteraction[J].Nature,1989,340(6230):245-246.LIJJ,HERSKOWITZI.IsolationofORC6,acomponentoftheyeastoriginrecognitioncomplexbyaone-hybridsystem[J].Science,1993,262:1870-1874.BramR.J.andKornbergR.D.SpecificproteinbindingtofarupstreamactivatingsequencesinpolymeraseIIpromoters.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1985,82(1).ElliottD.A.andBrandA.H.TheGAL4System.MethodsinMolecularBiology,2008,420:79-95.LiuZ.B.,UlmasovT.,ShiX.,HagenG.,andGuilfoyleT.J.ThesoybeanGH3promotercontainsmultipleauxin-inducibleelements.PlantCell1994,6:645-657.VasheeS.,XuH.,JohnstonS.A.andKodadekT.Howdo"Zn2cys6"proteinsdistinguishbetweensimilarupstreamactivationsites?ComparisonoftheDNA-bindingspecificityoftheGAL4proteininvitroandinvivo.[J].TheJournalofbiologicalchemistry,1993,268(33):24699-24706.UlmasovT.,LiuZ.-B.,HagenG.,andGuilfoyleT.J.Compositestructureofauxinresponseelements.PlantCell,1995,7:1611-1623.SkuzeskiJ.M.,NicholsL.M.,andGestelandR.F.Analysisofleakyviraltranslationterminationcodonsinvivobytransientexpressionofimproved-glucuronidasevectors.PlantMolecularBiology,1990,15:5-69.CurtisM.D.,andGrossniklausU.AGatewayCloningVectorSetforHigh-ThroughputFunctionalAnalysisofGenesinPlanta.PlantPhysiology,2003,133:462-469.TiwariS.B.,WangX.,HagenG.,andGuilfoyleT.J.AUX/IAAProteinsAreActiveRepressors,andTheirStabilityandActivityAreModulatedbyAuxin.ThePlantCell,2001,13(12):2809-2822.ChenQ.J.,ZhouH.M.,ChenJ.,WangX.C.UsingamodifiedTAcloningmethodtocreateentryclones.AnalyticalBiochemistry,2006,358(1):120-125.

電腦無法識別U盤該怎么辦HYPERLINK電腦無法識別U盤怎么辦?打開我的電腦上單擊右鍵，在快捷菜單里，選擇“管理”，打開“計算機管理”窗口。在計算機管理窗口里，選擇“存儲”下面的“磁盤管理”，如果看得到?jīng)]有盤符的U盤，那么在這個U盤上按鼠標右鍵，選擇“更改驅(qū)動器名稱和路徑”選項，就打開了“更改……的驅(qū)動器號和路徑”對話框。再點擊“更改”按鈕，打開“更改驅(qū)動器號和路徑”的對話框，在“指定以下驅(qū)動器號”的右邊下拉列表里，選擇你希望分配給U盤的驅(qū)動器號，盡可能靠后選擇，比如X、Y、Z，選擇好后，單擊確定按鈕，回到上一次“更改……的驅(qū)動器號和路徑”對話框窗口，再一次單擊確定，就回到“計算機管理”窗口。至此，如果一切正常，就給U盤單獨設置了一個長久使用的驅(qū)動器號，并卻，不受虛擬驅(qū)動器的影響了。建議將U盤插到電腦上，看任務欄中是否顯示圖標，如果顯示，在我的電腦點右鍵查看屬性——高級——硬件——設備管理器——查看里面是否有問號的設備，在問號設備上點右鍵——更新驅(qū)動程序然后下一步——否暫時不連接到網(wǎng)絡——下一步自動安裝軟件（推薦）就可以了另外：系統(tǒng)不認U盤的幾種處理方法1.禁用主板usb設備。管理員在CMOS設置里將USB設備禁用，并且設置BIOS密碼，這樣U盤插到電腦上以后，電腦也不會識別。這種方法有它的局限性，就是不僅禁用了U盤，同時也禁用了其他的usb設備，比如usb鼠標，usb光驅(qū)等。所以這種方法管理員一般不會用，除非這臺電腦非常重要，值得他舍棄掉整個usb總線的功能。但是這種屏蔽也可以破解，即便設置了密碼。整個BIOS設置都存放在CMOS芯片里，而COMS的記憶作用是靠主板上的一個電容供電的。電容的電來源于主板電池，所以，只要把主板電池卸下來，用一根導線將原來裝電池的地方正負極短接，瞬間就能清空整個CMOS設置，包括BIOS的密碼。隨后只需安回電池，自己重新設置一下CMOS，就可以使用usb設備了。（當然，這需要打開機箱，一般眾目睽睽之下不大適用~~）2.修改注冊表項，禁用usb移動存儲設備。打開注冊表文件，依次展開"HKEY_LOCAL_MACHINE\SYSTEM\CurrentControlSet\Services\usbehci”雙擊右面的“Start”鍵，把編輯窗口中的“數(shù)值數(shù)據(jù)”改為“4”，把基數(shù)選擇為“十六進制”就可以了。改好后注銷一下就可以看見效果了。為了防止別人用相同的方法來破解，我們可以刪除或者改名注冊表編輯器程序。提示：“Start”這個鍵是USB設備的工作開關，默認設置為“3”表示手動，“2”是表示自動，“4”是表示停用。3.在computermanagement里將removablestorage的使用權限禁止。computermanagement是一個windows管理組件，可以在控制面板——管理工具——計算機管理打開。在該工具窗口中storage——removablestorage——property中，general項，可以控制系統(tǒng)托盤是否顯示security則可以管理移動存儲設備的使用權限。在security中將普通用戶的使用權限降低，就可以達到禁用u盤的目的。破解的方法也很簡單，管理員降低普通用戶移動存儲設備的使用權限，但未必禁用computermanagement的使用權限。普通用戶可以通過這個工具解除usb移動存儲設備的使用權限限制。另外，值得一提的是，如果u盤插到電腦上后可以驅(qū)動，但是我的電腦里卻沒有盤符，很有可能是管理員改動了u盤的默認盤符，使得我的電腦不能識別。這種情況，可以在movablestorage中看到u盤驅(qū)動器?？梢栽趗盤驅(qū)動器屬性設置里為u盤重新分配一個盤符，再重新插拔一次u盤，就可以在我的電腦里看到u盤的盤符了。一、首先可以將該U盤換到別的機器上，看使用是否正常。如果排除了硬件損壞的可能，一般就是軟件方面有問題。在WindowsXP+SP1操作系統(tǒng)下，有些USB2.0設備的確常常出現(xiàn)工作不穩(wěn)定的問題，可以試試安裝設備自帶的USB2.0驅(qū)動程序。另外最好不要使用USB延長線，防止因為供電不足而造成不穩(wěn)定現(xiàn)象。如果仍無效，可以在主板BIOS設定中，將USB接口強行設置為USB1.1傳輸速率。二、（適用于WIN98）啟動計算機，進入主板BIOS設置，檢查BIOS中USB的相關選項是否已經(jīng)打開：OnChipUSB設定為Enabled；USBController設定為Enabled；PNPOSInstalled設定為Yes；AssignIRQForUSB設成Enabled。要正常使用USB設備首先要開啟USB接口，在主板BIOS里可以進行此項工作，一般來說只需在BIOS中進入ChipsetFeatures設置，并將USBKeyborad/MouseLegacy選項設定為Enable，就能夠保證在操作系統(tǒng)下使用USB鍵盤了。這些選項的作用是打開主板芯片組對USB設備的完全支持，為系統(tǒng)識別USB設備做準備工作。三、USB口接觸不好處理辦法：拔下，等十秒鐘再插上USB口，使接觸完好；五、閃存盤驅(qū)動程序沒有安裝完成(WIN98系統(tǒng)下)處理辦法：鼠標點“我的電腦”，選擇屬性找到“通用串行總線”，刪除其中的USBMASSSTORAGE項，再點擊“刷新”，然后按照提示重新安裝一次驅(qū)動程序。六、接其它USB設備(如掃描儀、打印機、數(shù)碼相機)時可以正常使用，接優(yōu)盤時閃指示燈不亮，不能夠使用。1、檢查優(yōu)盤與電腦的聯(lián)接是否正常，并換用其它USB接口測試。2、檢查設備管理器，看是否出現(xiàn)”通用總線設備控制器”條目，如果沒有，請將電腦主板BIOS中USB接口條目*激活(ENABLE)。3、如果電腦安裝過其它類型USB設備，卸載該設備驅(qū)動程序，并首先安裝優(yōu)盤驅(qū)動程序。4、到其它電腦試用此優(yōu)盤，確認是否優(yōu)盤不良。七、啟動型優(yōu)盤在的電腦上無法實現(xiàn)啟動，可能是主板型號不支持。如何判斷一塊主板是否支持閃存盤啟動系統(tǒng)啟動型優(yōu)盤是采用模擬USB軟驅(qū)和USB硬盤的方式啟動電腦的。只要電腦主板支持USB設備啟動，即BIOS的啟動選項中有USB-FDD、USB-HDD或是其它類似的選項，就可以使用啟動型優(yōu)盤啟動電腦。八、第一次在電腦上使用優(yōu)盤，未出現(xiàn)提示發(fā)現(xiàn)新硬件的窗口，驅(qū)動程序無法安裝的原因可能是：1、主板usbcontroller未啟用解決辦法:在電腦主板BIOS中啟用此功能。2、usbcontroller已經(jīng)啟用但運行不正常解決辦法:在設備管理器中刪除”通用串行控制器”下的相關設備并刷新。3、優(yōu)盤被電腦識別異常，在設備管理器中表現(xiàn)為帶有黃色？或！的”其它設備”或“未知設備”。解決辦法:刪除此設備并刷新。九、大容量的U盤(例如兼具MP3播放器或錄音功能的U盤)或移動硬盤在電腦上無法正常使用，雖然系統(tǒng)提示找到了未知的USB設備，但無法正確識別U盤或移動硬盤。原因可能是：1．USB接口供電不足:系統(tǒng)為每個USB接口分配了500mA的最大輸出電流，一般的U盤只需要100mA的工作電流，因此在使用過程中不會出現(xiàn)什么問題。大多數(shù)移動硬盤所使用的是普通的2.5英寸硬盤，其工作電流介于500mA~1000mA之間，此時假如僅僅通過USB接口供電，當系統(tǒng)中并無其他USB設備時，那么還是可以勉強使用的，但如果電壓不穩(wěn)的話，就隨時可能出現(xiàn)供電不足的問題。特別是使用支持USB2.0的移動硬盤時，情況最為嚴重。另外，如果你的筆記本電腦使用電池供電，那么USB接口所分配的電量就更小了。2．使用了外接的USB擴展卡:在筆記本電腦中使用USB2.0的U盤或移動硬盤時，如果筆記本電腦不支持USB2.0技術，一般必須通過PCMCIA卡轉USB2.0的擴展卡來間接實現(xiàn)支持，這些擴展卡基本上都采用NEC公司的D720100AGMUSB控制芯片，少則提供兩個USB2.0接口，多則提供五個USB2.0接口，對一般用戶而言足夠使用了。由于PCMICA接口提供的電源功率比板載USB接口要小，這樣就會由于供電不足而導致移動硬盤工作的出現(xiàn)問題。解決方案:1.它從USB連接線上接移動硬盤的一端引出一根轉接線，可以插入電腦背后的PS/2接口取電，這里可以比USB接口提供更大的電流輸出。2.利用電源補償線(也稱“鍵盤取電線”)，如果U盤或移動硬盤的包裝盒中提供了選配的電源適配器，你就可以直接使用外接電源，這樣就可以從根本上避免供電不足的情況發(fā)生了前置USB線接錯。當主板上的USB線和機箱上的前置USB接口對應相接時把正負接反就會發(fā)生這類故障，這也是相當危險的，因為正負接反很可能會使得USB設備燒毀。所以盡量采用機箱后置的USB接口,也少用延長線.也可能是斷口有問題,換個USB端口看下.USB接口電壓不足。當把<ahref="mobileharddisk">移動硬盤</a>接在前置USB口上時就有可能發(fā)生系統(tǒng)無法識別出設備的故障。原因是<ahref="">移動硬盤</a>功率比較大要求電壓相對比較嚴格，前置接口可能無法提供足夠的電壓，當然劣質(zhì)的電源也可能會造成這個問題。解決方法是<ahref="">移動硬盤</a>不要接在前置USB接口上，更換劣質(zhì)低功率的電源或盡量使用外接電源的硬盤盒，假如有條件的話。主板和系統(tǒng)的兼容性問題。呵呵這類故障中最著名的就是NF2主板與USB的兼容性問題。假如你是在NF2的主板上碰到這個問題的話，則可以先安裝最新的nForce2專用USB2.0驅(qū)動和補丁、最新的主板補丁和操作系統(tǒng)補丁，還是不行的話嘗試著刷新一下主板的BIOS一般都能解決。系統(tǒng)或BIOS問題。當你在BIOS或操作系統(tǒng)中禁用了USB時就會發(fā)生USB設備無法在系統(tǒng)中識別。解決方法是開啟與USB設備相關的選項。就是開機按F2或DEL鍵,進入BIOS,把enableusbdevice選擇enable。拔插要小心,讀寫時千萬不可拔出,不然有可能燒毀芯片。XP中任務欄中多出USB設備的圖標，打開該圖標就會在列表中顯示U盤設備，選擇將該設備停用,然后你再拔出設備，這樣會比較安全。

其實判斷軟件硬件問題很簡單,在別的機器或換個系統(tǒng)試試就可以了.有些小的問題不妨先用專門軟件格式化下.還有提醒大家WINDOWS下格式化時要選擇FAT,不要選FAT32。

提示無法識別的USB設備維修

故障提示如圖：

無法識別的USB設備：UnknownUSBDevice.很多人都遇到過的一個問題，所謂“無法識別”對于操作系統(tǒng)來說，或者是驅(qū)動程度有問題，或者是USB設備出現(xiàn)了問題，或者是計算機與USB設備連接出現(xiàn)了故障，解決問題的方法也是從這幾處著手。

對于不同的設備會有不同的處理方法，了解USB設備正常工作需要的條件以及一些可能影響USB設備正常工作的因素，會有助于解決問題。

下面是保證USB設備可以正常工作的一些條件：（1）USB設備本身沒有任何問題——可以通過在其它計算機上進行測試，保證能正常工作；（2）USB接口沒有任何問題——可以通過連接其它的USB設備在此接口上進行測試；（3）USB設備的驅(qū)動程序已經(jīng)正確安裝，如果有詳細說明書的USB設備，一定要仔細查看相應的說明文件，按照說明安裝相應的驅(qū)動程序；Windows2000以后的操作系統(tǒng)以識別大部分的USB設備，Windows98以前的操作系統(tǒng)可以安裝USB設備自帶的驅(qū)動或者安裝通用的USB設備驅(qū)動程序。下面是可能影響USB設備正常工作的一些情形：（1）USB設