《GB-T核糖核酸酶活力檢測(cè)方法》

ICS07.080

B20/39

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

核糖核酸酶活力測(cè)定

Determinationoftheactivityofribonuclease

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局

發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1化管理委員會(huì)

GB/T××××—201×

核糖核酸酶活力測(cè)定

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了核糖核酸酶活力測(cè)定原理、儀器設(shè)備及器具、主要試劑、分析步驟和結(jié)果分析。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于生化試劑核糖核酸酶活力測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

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GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

3.1

核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）

水解核糖核酸（RNA）中磷酸二酯鍵，生成寡核苷酸或單核苷酸核酸的核酸酶。根據(jù)酶作用的位置不

同，可進(jìn)一步分為內(nèi)切核糖核酸酶與外切核糖核酸酶。

3.2

核糖核酸酶活力單位（ribonucleaseactivityunit）

以濃度為0.15mg/mL的1.5ml酵母RNA為底物，在50℃且pH5.0的條件下，1分鐘內(nèi)使反應(yīng)液在260nm

處吸光度增加0.001所需要的酶量為一個(gè)活性單位（U）。

4原理

核糖核酸酶催化產(chǎn)物在260nm波長(zhǎng)下具有特征吸收峰，通過外標(biāo)法計(jì)算核糖核酸酶的活性。

5儀器設(shè)備及器具

5.1恒溫水浴槽。

5.2紫外-可見分光光度計(jì)：吸光度精確至0.001。

5.3pH計(jì)：精確至0.01。

5.41cm石英比色皿。

5.5電子天平：精度為0.0001g和0.01g。

6試劑

1

GB/T××××—201×

本方法所用試劑均為分析純，除特殊說(shuō)明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6882規(guī)定的二級(jí)水。

6.10.1mol/L乙酸/乙酸鈉（NaAc/HAc）緩沖液，pH5.0

稱取8.20gNaAc溶于水中，緩慢加入HAc調(diào)pH至5.0，混勻后定容至1000ml。

6.2酵母核糖核酸

來(lái)源于圓酵母（TorulaYeast），含量≥98%。

7分析步驟

7.1環(huán)境要求

所有試驗(yàn)操作步驟應(yīng)在潔凈的無(wú)外源RNA酶環(huán)境中進(jìn)行。

7.2試驗(yàn)液的制備

7.2.1酵母RNA溶液

稱取酵母RNA15.0mg溶于水中，使其溶液濃度為0.15mg/mL。

7.2.2固體樣品待測(cè)酶液制備

稱取28.0mg樣品，溶于水中，調(diào)節(jié)核糖核酸酶液初始濃度為0.7mg/mL。

7.2.3液體樣品待測(cè)酶液制備

將液體待測(cè)酶樣用水調(diào)節(jié)最后的溶液中核糖核酸酶液濃度為0.7mg/mL。

7.3酶促反應(yīng)

同一樣本取4只離心管，設(shè)置空白對(duì)照管1只，檢測(cè)管3只，其中空白管中依次加入酵母RNA溶液

1.5mL、水0.5mL與NaAc/HAc緩沖液1.0mL；檢測(cè)管中依次加入酵母核糖核酸（RNA）溶液1.5mL、

待測(cè)酶液0.5mL以及NaAc/HAc緩沖液1.0mL。每個(gè)待測(cè)酶液設(shè)定三個(gè)重復(fù)即3個(gè)檢測(cè)管，50℃恒溫水

浴反應(yīng)時(shí)間為15min。

7.4分光光度分析

空白對(duì)照管標(biāo)記為0號(hào)管，檢測(cè)管分別標(biāo)記為1-3號(hào)管，加樣方法如表1所示，反應(yīng)后在260nm處測(cè)

對(duì)照管和檢測(cè)管溶液的吸光度，并記錄結(jié)果。

表1待測(cè)樣液加樣方法

0號(hào)管1號(hào)管2號(hào)管3號(hào)管

酵母核糖核酸溶液（mL）1.51.51.51.5

水（mL）0.50.00.00.0

NaAc/HAc緩沖液（mL）1.01.01.01.0

待測(cè)酶液（mL）0.00.50.50.5

2

GB/T××××—201×

8結(jié)果分析

8.1酶活力計(jì)算

按照式（1）計(jì)算：

A1000稀釋倍數(shù)

C260..........................................................（1）

15

式中：

C：核糖核酸酶活力（U/mL或U/g）；

A260：檢測(cè)管與空白對(duì)照管在260nm處測(cè)定得到的吸收值差；

1△000：吸光度原值與活力規(guī)定中規(guī)定吸光度0.001的換算系數(shù)。

15：反應(yīng)時(shí)間與活力單位定義中的換算系數(shù)。

以平行樣的平均值為最終的酶活力測(cè)定值，計(jì)算結(jié)果保留整數(shù)位。

8.2重復(fù)性